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Práctica # 1 “Elaboración de Penicilina Ingeniería de Fermentaciones

mediante la fermentación del Hongo


Penicillium Chrysogenum”.

INSTITUTO POLITECNICO
NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INSTERDISCIPLINARIA DE
INGENIERÍAS CAMPUS GUANAJUATO

INGENIERÍA FARMACÉUTICA

INGENIERIA DE FERMENTACIONES
“Elaboración de la penicilina mediante la fermentación
del Hongo Penicillium Chrysogenum”

6FV1

PROFESOR: DIANA RAMIREZ SAENZ


ALUMNO: OSCAR EFRAIN FERNANDEZ DELGADO
BOLETA: 2012660037

FECHA DE ENTREGA

03/12/2013

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniería Campus Guanajuato Página 1


Profesora: Diana Ramírez Sáenz
Práctica # 1 “Elaboración de Penicilina Ingeniería de Fermentaciones
mediante la fermentación del Hongo
Penicillium Chrysogenum”.

Objetivo: Producir un antibiótico grado farmacéutico de mayor uso en el mercado,


mediante la fermentación del hongo Penicillium Chrysogenum, aprovechando sus
propiedades bioquímicas y funciones microbiológicas, utilizando como fuente un medio de
cultivo enriquecido con nutrientes necesarios para su desarrollo, y con la ayuda de un
biorreactor de tanque agitado ―Lambda‖ especializado para su producción.

Objetivos específicos

 Producción del antibiótico bencilpenicilina mediante la fermentación del hongo


Penicillium Chrysogenum, en un biorreactor ―Lambda‖ de tanque agitado.
 Purificación del caldo sobrenadante, producto de la fermentación del hongo
mencionado, mediante una cromatografía de columna, logrando la extracción del
antibiótico puro.
 Identificación del compuesto extraído, utilizando técnicas microbiológicas de
cultivo in vitro, mediante varios antibiogramas que contengan diferentes cepas, en
las cuales se compruebe con halos de inhibición bacteriana, la presencia del
antibiótico obtenido.

INTRODUCCIÓN

Un antibiótico se conoce como aquel compuesto químico producido ya sea por hongos o
bacterias, y que posee una actividad de defensa ante diferentes microorganismos
presentes en cualquier medio ambiente, para el hongo proteger los nutrientes que
necesita, mediante la interferencia del compuesto mismo en diversos pasos del
metabolismo de los microorganismos enemigos. Por consiguiente se le considera un
metabolito secundario, porque es antimicrobiano y resulta capaz de inhibir un crecimiento
bacteriano. [3-4]

Estructura general del antibiótico

El compuesto orgánico principal es el ácido 6- aminopenicilánico (6 – APA), su fórmula


condensada es C16H18N2O4S y su esqueleto se muestra a continuación:
Figura 1: Estructura Orgánica general de la molécula de penicilinas

Apreciamos una estructura consistente en un anillo tiazolídinico con un anillo β- lactámico, y una
parte variable acilada en la posición 6, lo que demuestra que se pueden obtener varios tipos de
penicilina gracias a las propiedades estructurales de la molécula.
Imagen extraída de: [http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Penicillin-G.svg]

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La penicilina es un antibiótico producido por un hongo de nombre ―penicillium‖, que actúa


mediante el bloqueo de la actividad de la enzima transpeptidasa, generando un
cruzamiento que conecta largos polímeros de azúcares formando la pared de la célula
bacteriana, bloqueando irreversiblemente la actividad de la enzima por unión covalente
con el extremo funcional de la enzima misma. La obtención de la penicilina es un proceso
fermentativo que se realiza considerando una selección de los medios de comunicación
(aquellos que proporcionan un ambiente favorable para el cultivo en cuestión, como la
regulación del pH) adecuados para el rendimiento general de la fermentación,
proporcionando un medio de cultivo que contenga todos los elementos necesarios para la
síntesis de materiales de la célula y la formación del producto deseado. [1-4]

Biosíntesis del Antibiótico

Se rige por la siguiente secuencia metabólica:


Figura 2.- Ruta metabólica que describe la producción de penicilina vía Penicillium Chrysogenum

Se aprecia la ruta biosintética del compuesto para dar como producto final penicilinas del tipo G y V
Imagen extraída de: Microbiología General 2008

La producción del antibiótico se origina porque la penicilina tiene un precursor donde


yacen las bases de aminoácidos aromáticos, la penicilina es una ruta metabólica diferente
al ciclo de krebs que se engancha a los aminoácidos aromáticos que se generaron en el
ciclo mencionado. La fuente principal para que se lleve a cabo este proceso deriva de la
glucosa (fuente de carbono) añadida al medio de cultivo, los antibióticos resultan a partir
de metabolismos secundarios y rutas alternas del sustrato que sirva a la célula del
microorganismo para deshacerse de las bacterias (mecanismo de defensa muy útil para
sobrevivir bajo condiciones adversas) que pueden competir contra ellos hacia una fuente
nutritiva. Para el caso de un medio de cultivo estéril y enriquecido, como representa un
hongo in vitro, es menester añadir un precursor debido a que el hongo por naturaleza
producirá muy pocas cantidades del antibiótico, con el precursor se activara esa ruta

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metabólica para que el hongo produzca mayores cantidades de penicilina demandadas.


[2,4]

Factores microbiológicos propicios para fermentar un determinado hongo

En microbiología un medio de cultivo adecuado para todo tipo de hongo en general,


incluyendo al penicillium, debe contener fuentes de carbono y nitrógeno principalmente.
Según el modelo del Dr. Salomón Bartnicki (desarrollado en el año 1962), un medio de
cultivo mínimo y esencial debe contener fuentes de carbono, nitrógeno, sulfato de amonio
y oligoelementos (donde se encuentran muchas sales con metales de transición, como
Mn, Cr, Fe, Co), todos ellos requerimientos nutritivos necesarios para el desarrollo del
microorganismo. [2,4]

Por último resta mencionar que una propiedad fundamental en los hongos, es que
contienen enzimas que son dependientes de metales como: Manganeso, Cromo, Hierro y
Cobalto, necesarios para que las enzimas cumplan su función, considerando que los
hongos son restrictivos en su crecimiento porque contienen muchas rutas metabólicas
alternas para producir antibióticos, u otros metabolitos secundarios como pigmentos. Las
rutas metabólicas en los hongos poseen enzimas muy específicas que dependen de
metales (metaloenzimas), y es importante que estén presentes en el medio de cultivo para
el crecimiento y desarrollo del hongo, el medio debe tener un pH acido entre 4.5 y 5 (a
excepción del Penicillium, cuyo pH debe ser de 6.5 ya que influye a un mejor desarrollo
del metabolito) puesto que a un valor mayor desarrollaría mayor cantidad de biomasa que
la necesaria. [1-2,4]

Purificación

En términos microbiológicos y de Biorreactores, cuando se trabaja con cualquier cultivo y


se requiere la producción de un metabolito secundario en específico, para este caso la
Penicilina, al añadir al cultivo cofactores que propicien en el hongo la producción de una
ruta metabólica secundaria, este tendera a excretar muchos metabolitos secundarios
posibles, no solamente uno, por ende se encontraran varios compuestos químicos
inmersos en el caldo de cultivo, productos de la ruta metabólica originada. [2-4]

El compuesto de interés se encontrara inmerso junto con otros metabolitos secundarios


posibles, y al tomar una alícuota y probarla en un antibiograma, no se conocerá
exactamente que compuesto fue el que inhibió el crecimiento bacteriano, por ende el
resultado esperado variara sin conocer que lo provoco. La purificación promueve a
separar el metabolito de interés de los otros metabolitos, mediante el uso de un solvente
capaz de polarizar a los otros metabolitos y solubilizarlos para generar una separación de
fases, en estos casos apreciaremos dos fases: Orgánica (conteniendo a los otros
metabolitos que no se necesitan) y Acuosa (contendrá el metabolito de interés). [1-3]

Para solubilizar metabolitos secundarios de desinterés, y propiciar la separación de


ambas fases, generalmente se usara un solvente orgánico de carácter polar, el cual
arrastrara metabolitos no polares generando un precipitado, dejando en la fase liquida el
metabolito de interés, este compuesto se le conoce como ciclohexanona el cual atacara
en grupos aminos y carbonilicos de los metabolitos no polares propiciando una separación
de fases y por ende un precipitado de carácter orgánico. [Wade 2012]

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Por último, para la separación del antibiótico se utiliza la cromatografía en columna, esta
técnica permite la separación de mezclas de sustancias, sus características y los factores
que en ella intervienen. Generalmente esta técnica se emplea en la purificación de
compuestos químicos, ya que existe una afinidad diferencial de los distintos compuestos
inmersos en la mezcla por la fase móvil o estacionaria, estos compuestos son arrastrados
por un eluyente que los propicia a avanzar a lo largo de la columna, pero como no todos
los compuestos avanzaran a la misma velocidad, por consiguiente terminamos obteniendo
el antibiótico de interés, ya que esperamos sea el compuesto que avance con mayor
velocidad que los otros. [1,4]

Presencia de penicilina mediante cuantificación de susceptibilidad microbiana

Existe una técnica fundamental dentro de la microbiología clínica llamada ―quimioterapia


con antimicrobianos‖, esta técnica ha venido jugando un papel vital para el tratamiento de
diversas enfermedades infecciosas en seres humanos. Desde que se desarrollaron
diferentes investigaciones acerca de las colonias microbianas por parte de Alexander
Fleming en 1924, Gerhard Dogmak en 1927 y Selman Waskman en 1932, han surgido
cientos de agentes antimicrobianos, donde algunos han sido sintetizados y unos cuantos
se encuentran disponibles para usos clínicos. Gracias a la gran variedad de agentes
antimicrobianos existentes, podemos diagnosticar con un grado de certeza confiable, los
agentes más apropiados para el tratamiento de diversos padecimientos a manera
rutinaria. [5-7]

Figura 3: Se muestra que parte del metabolismo de un microorganismo se ve afectado por los diversos
antibióticos.

Extraída de: [Delgado, A. (2010). Obtención de penicilina y comprobación de su actividad


antimicrobiana. Biotecnología Farmacéutica. Instituto Politécnico Nacional]

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Desde la síntesis de la penicilina, se han descubierto muchos antibióticos capaces de


combatir todo tipo de enfermedades causadas por infecciones microbianas, pero el uso
incorrecto y excesivo de los mismos, ha llevado a que las bacterias desarrollen cierta
resistencia hacia los mencionados, derivando en microorganismos multiresistentes, por tal
razón se efectúan pruebas de sensibilidad, para corroborar cuál es el antibiótico más
adecuado para atacar a un determinado microorganismo. Estas pruebas consisten
principalmente en dos tipos, difusión y dilución, que nos ayudan a determinar la
sensibilidad de un determinado microorganismos, para la elección del antibiótico
apropiado. [5-6,8]
Figura 4: Inhibición en el crecimiento de la bacteria E. Coli por efecto del antibiótico Amoxicilina

Extraída de: [Trabajos experimentales realizados en laboratorio de Microbiología Farmacéutica en


UPIIG-IPN]

La metodología empleada para realizar el estudio de susceptibilidad, toma en


consideración algunos de estos factores para determinar de manera eficiente cómo un
microorganismo podría responder a un determinado antibiótico. [6,9]
 Virulencia
 Alta concentración de organismos
 Infección mixta
 Desarrollo de resistencia durante el tratamiento

Existen factores propios del agente antimicrobiano, como son absorción, distribución,
metabolismo, eliminación, unión a proteínas plasmáticas y otros parámetros
farmacocinéticos, los cuales pueden influenciar la respuesta del paciente. Debido a que
los microorganismos tienen susceptibilidad variable a agentes antimicrobianos, es
necesario tener una herramienta que permita determinar la susceptibilidad del
microorganismo causante de la infección. [5-9]

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Cada vez son menos los organismos que tienen susceptibilidad predecible, por lo que
debemos hacer estudio de susceptibilidad en la mayoría de los microorganismos aislados.
La indicación primaria para el estudio de susceptibilidad es determinar el antibiótico más
apropiado para iniciar la terapia en un paciente con un proceso infeccioso. En la mayoría
de los casos, cuando comienza una enfermedad se indica un antibiótico de amplio
espectro (o una combinación de antibióticos) hasta obtener resultados acerca de la
identificación del germen causal de la infección. Posteriormente al obtener una respuesta,
puede indicarse un antibiótico más específico. [2,8]

En este momento existen varios métodos basados en la biología molecular que pueden
ser usados para detectar resistencia específica a varios antimicrobianos, pero su uso de
rutina no está indicado. Estos métodos son principalmente usados con fines
epidemiológicos, para monitorear resistencia a antibióticos. [7]

Materiales, Reactivos y Equipo

Material Reactivos
3 matraces erlenmeyer de 500 mL Glucosa
2 charolas de aluminio Sulfato de amonio
1 Espátula Extracto de levadura
2 Probeta 50 mL KCl
1 Mechero de bunsen MgSO4
2 Asa para sembrar FeCl3
Algodón Etanol al 90°
Gazas Caja petri con hongo de penicillium cultivado
Papel destraza Tubo con esporas
2 matraces erlenmeyer de 1 L Ciclohexanona
Pinzas de disección Solución acido sulfúrico 1 N
Encendedor Agar PDA
Probeta de 5 L Agar Bacteriológico
5 Lámparas de alcohol Peptona de Caseína
4 tubos Falcón Cloruro de sodio
Embudo de separación Penicilina Comercial
Columna cromatografía anionica Tubo eppendorf con esporas
Papel Filtro Cepa de cultivo con Lotto
1 Porta Objeto Cepa de cultivo con E. Coli
2 Cubre Objetos Cepa de cultivo con Salmonella
1 Caja petri de vidrio Agua destilada
Equipo para cromatografía de intercambio Equipo
iónico
Tubos Eppendorf estériles Equipo para filtración al vacio
Micropipeta de 1000 µL Bomba
Puntas para micropipeta Bomba peristáltica
Celdas para espectrofotómetro de vidrio y Fermentador Instrumentado
plástico
3 vasos de precipitado de 100 mL Microscopio
Pinzas de disección Autoclave
12 cajas petrí de plástico estériles Refrigerador
Encendedor Incubadora a 29°C
Secador Espectrofotómetro Uv-vis

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Diagrama de flujo metodología

Preparación del medio de cultivo (PDA)

Realizar los calculos


Pesar en la balanza
correspondientes de Añadir 200 ml de agua
la cantidad
cada reactivo, para destilada al matraz
correspondiente de
preparar 200 mL de erlenmeyer de 500 mL
cada reactivo
medio

Agitar posteriormente
Añadir a la solucion
vigorosamente añadir cada una de
el extracto de
efectuando una las sales pesadas en
levadura y agitar
disolucion la balanza

Seguir agitando
Añadir lentamente Envolver con una
vigorosamente
la glucosa a la gasa un pedazo de
nuestra solucion
solucion y agitar algodón, y proteger
hasta que todos los
mientras se va nuestro medio de
componentes esten
adhiriendo. cultivo
disueltos

Microcultivo

En una caja petri Tomar de las muestras


Tomar dos muestras,
colocar un portaobjeto de interes y sembrarlas
una de un homgo
y PDA, todo en un por un lado en el
aislado y la otra de una
ambiente cuadro de agar, cubiri
espora inoculada.
completamente esteril con un cubreobjeto.

Colocar 2 ml de agua
En base a lo observado,
Observar el hongo al destilada (no se pudo
determinar el tipo de
microscopio utilizando efectuar), sellar la caja
cepa para cada muestra
objetivos 20 x y 40 x e incubarla por 36
y su especie.
horas a 37 °C

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Inoculación del Hongo en el medio de cultivo

Introducir el matraz Encender el mechero y


Una vez esterilizado, Flamear el Aza y tomar
con todo y el medio de destapar el medio de
llevarlo a la campana una pequeña porcion del
cultivo al autoclave cultivo, flameando el
de flujo laminar para hongo, cuidando que se
para esterilizar, boquete del matraz y el
inocular con ayuda del efectue dentro de la
asegurando la muerte
mechero tapon de algodon zona esteril.
de toda bacteria

Introducir la porcion
extraida del hongo en
Verificar la asepsia del Meter el medio de
Flamear de nueva el medio de cultivo,
Biorreactor y considerar cultivo inoculado a un
cuenta el Aza y todo lo flameando el boquete
todas las medidas conservador durante 4
que se utilizo. del matraz y la tapa de
necesarias. . dias.
algodon, cerrando
nuestro medio.

Fermentación del Hongo

Desmontar el Realizar los calculos


Una vez preparado el
biorreactor lambda y correspondientes de Esterilizar tanto el
medio de cultivo (YPS),
lavar cada uno de sus reactivos para biorreactor como las
añadirlo lentamente al
componentes, verificar preparar 800 mL de fuentes de acido
biorreactor y cubrir
la presencia de todos medio de cultivo (H2SO4 1N) y alcali
todas las entradas del
los componentes enriquecido (YPS), y (NaOH 1N).
mismo.
necesarios prepararlo

Programar el biorreactor Verter el inoculo al


en base a las biorreactor, realizar Ajustar pH y conectar
Las condiciones son:
condiciones del hongo este procedimiento las fuentes de acido y
temperatura de 23 a
penicillium cuidando un ambiente alcali a las
25 °C, VVM entre 0.5 a
Chrysogenum y accionar completamente esteril alimentaciones
1 y pH de 6.5
para comenzar la para evitar correspondientes.
fermentación. contaminación

Dejar el biorreactor
fermentando una semana
y posteriormente realizar
una filtracion para separar
el producto de la biomasa.

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Purificación del Caldo

Posteriormente tratar el
Eliminar los residuos de caldo por centrifugacion,
Colocar el sobrenadante
mayor tamaño mediante colocando en tubo de 50
en un recipiente.
una filtracion de vacio mL con tapa por 10 min
a 5000 rpm

Verter la susbtancia en Dejar reposar en el Añadirle al mismo 200


un embudo de solvente organico los mL de Ciclohexanona,
decantacion y separar la primeros 7 dias en una realizar este paso en la
fase acuosa de la gabeta, y los otros 6 dias campana de flujo
organica. en refrigeracion laminar

Desechar la fase Lavar la columna


organica y colocar la fase Preparar la columna anionica con una
acousa en un vaso de anionica cromatografica solucion de H2SO4 [1 N],
precipitados para de intercambio ionico (realizar calculos previos
tratarla posteriomente para su preparación)

Rotular un frasco
Tratar el restante de la
determinado para
fase acuosa pasando la Sustraer una muestra de
guardar el producto
misma por la columna 10 mL de la fase acuosa
resultante de la
cromatografica
cromatografia

Guardar el producto
final en refrigeracion por
un periodo de 2 semanas

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Curva de referencia penicilina comercial

Preparar diferentes Preparar el equipo de


diluciones a distintas espectrofotometria Uv- Calibrar el
concentraciones de vis con tubo blanco a espectrofotometro
penicilina comercial 200 nm

Construir la curva de Introducir los


Determinar la
calibracion diferentes tubos con
absorbancia para cada
correspondiente a las las diluciones reaizadas
tubo con su
asbrobancias obtenidas con la penicilina
concentracion
en el espectro comercial

Elaboración de antibiograma

Esterilizar en autoclave el Determinar las


Pesar las cantidades
material necesario tal: concentraciones de
correspondientes de cada
matraz con agua peniciina presente en el
reactivo para preparar
destilada, caja petri de caldo de extraccion y la
medio LB y realizar la
vidrio con discos y matraz fase acousa de la
solucion
con medio LB decantacion

Para determinar tal


Colocar cada dilucion en un Preparar tres diluciones a concentracion, realizar una
tubo eppendorf y rotular la distintas concentraciones espectro UV-VIS a cada
concentracion de la misma y para cada muestra de muestra de los componentes,
la sustancia de penicilina penicilina: Comercial, y comparar en base a la curva
utilizada Cromatografia y acuosa de referencia obtenida de
penicilina comercial

Verter 15 mL de medio LB a Una vez que el medio


temperatura ambiente sobre solidifico, ir inoculando cada
Esperar a que el medio
las 9 cajas petri esteriles, cepa correspondidnte por
solidifique
cuidando que se tenga un todo el agar, para cada caja
ambiente esteril petri

Posterior a la inoculacion, Ir impregnando cada disco


Por ultimo colocar las cajas colocar el sensidisco con las diluciones
petri en la incubadora a impregnado con la dilucion correspondientes a las
temperatura de 29 °C por una correspondiente y rotular la distntas concentraciones de
semana y observar localizacion del mismo en la penicilinas: Comercial, acuosa
caja petri y cromatografia

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Resultados y Discusión

Preparación de 200 mL de medio de cultivo enriquecido

Se utilizaron las siguientes cantidades de cada reactivo:


Tabla 1: Cantidades y reactivos empleados para la elaboración del medio de cultivo enriquecido

Reactivos Cantidad (g)


Glucosa 8
Sulfato de amonio 0.6
Extracto de levadura 0.4
KCl 0.1
MgSO4 0.1
FeCl3 0.1

Cada componente del medio se añadió con la finalidad de desarrollar la correcta


proliferación del hongo que posteriormente se vaya a inocular en el mismo, brindándole
un correcto desarrollo y atendiendo a las demandas microbiológicas y bioquímicas del
hongo en común.

Contrastando con la literatura y algunos trabajos industriales de carácter farmacéutico, el


medio de cultivo que se preparo y los ingredientes que formaron parte del mismo, resultan
indispensables para propiciar la proliferación del hongo penicillium en el sustrato [1]. Es
importante mencionar que cada uno de los ingredientes indicados tiene su función
bioquímica en el medio de cultivo enriquecido, así se le añaden sales al mismo, porque
nuestro hongo es un ser vivo (microorganismo) y necesita de electrolitos para poder
desarrollarse, las sales también disminuyen las probabilidades de contaminación al medio
debido a que lo purifican y no permiten que se desarrollen bacterias, si se le hubiera
añadido cloruro de sodio se rompe el equilibrio de las bombas sodio y potasio y no se
desarrolla completamente (se limita mucho su crecimiento), en cambio con el cloruro de
potasio se genera el equilibrio adecuado [3-4].

La glucosa se le añade debido a que es una fuente de carbono y es básica para su


desarrollo, contribuye a formar los componentes estructurales y sirve como fuente de
energía para el microorganismo, considerando que cualquier organismo debe de pasar
por el ciclo de krebs, desdoblar la glucosa para producir piruvato (glucolisis) cuya única
vía de salida es el ciclo de Krebs para sintetizar todos los intermediarios y aminoácidos.
La razón por la que se le añade extracto de levadura al medio de cultivo, aparte de que
sigue aportando fuentes de carbono al microorganismo en caso de que ya no cuente con
glucosa, es porque representa el proceso metabólico principal para llevarse a cabo la
fermentación, transformando los azucares en etanol por metabolismo oxidativo que
incluye la glucolisis y ciclo de krebs en hongos [2-4]. Por lo que todos los
microorganismos requieren de carbono, hidrógeno, oxígeno, azufre y nitrógeno para su
crecimiento celular, demandando pequeñas cantidades de elementos traza como Cu, Mn

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y Co dependiente de la fuente de agua como la mayoría de las fuentes de agua o factores


de crecimiento, tales como vitaminas o aminoácidos. [1-4]

Microcultivo

Para continuar con la extracción del antibiótico, es importante la identificación y


comprobación del hongo que la produce, como se trabajo con dos compuestos, Hongo
aislado y esporas, era menester corroborar que ambos fueran Penicillium Chrysogeum, se
efectúa un microcultivo en el cual se identifico que solo el hongo aislado era Penicillium
mientras las esporas representaban otro componente desconocido.

No se tiene una imagen disponible del la identificación del hongo, pero a continuación se
muestra una imagen similar a la del hongo que se identifico experimentalmente y que
cumplió con las características que debe mostrar el penicillium.

Figura 5: Identificación del Hongo penicillium realizada en un trabajo experimental

En la presente imagen se aprecia que efectivamente este hongo es penicillium debido a la


conformación terverticilado de una de sus ramificaciones

Extraída de:
[http://www.google.com.mx/imgres?imgurl=http://www.pv.fagro.edu.uy/fitopato/cursos/fitopato/practicas/3/pexp.JPG&imgrefu
rl=http://www.pv.fagro.edu.uy/fitopato/cursos/fitopato/practicas/hongos.html&h=654&w=640&sz=44&tbnid=5nTOG24FOgB9
aM:&tbnh=115&tbnw=113&zoom=1&usg=__cNjOr5ylM7fxFkTE378KHAwbp8Q=&docid=WTW3zN12yYH7DM&sa=X&ei=wK
FlUsa3K8SD2QXr84DoDQ&ved=0CC8Q9QEwAQ]

En el hongo que se identifico al microscopio se apreciaron las siguientes características:


formaba conidios en una estructura ramificada, algunas ramificaciones presentaron dos
tipos de estructuras: las monoverticiladas y biverticiladas, especie esponjosa con
vellosidades la cual se asemejaba mas una esponja dura y a punto de romperse debido a
que no se le agrego agua al microcultivo y por ende no se encontraba hidratado.

La hidratación es un factor importante en microorganismos del reino Fungi, ya que sin


agua el hongo no puede sobrevivir y por ende no tendera a producir el antibiótico, aparte

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de ser necesaria para el cumplimiento de sus funciones fisiológicas, representa un


inductor de sus rutas metabólicas las cuales serán compatibles con el precursor que
propiciara la máxima producción de antibiótico posible. En este caso como se trato de un
microcultivo el hongo apenas se alcanzo a apreciar, aunque se corrió el riesgo de
confundirse con el hongo de la estreptomicina, ya que al estar deshidratado el hongo le
dio una apariencia similar a la estreptomicina, y despreciar al mismo antes de continuar
con el trabajo experimental. [1,3-4]

Preparación de 800 mL de medio de cultivo enriquecido, 400 mL para cada matraz


Tabla 2: Cantidades y reactivos empleados para la elaboración del medio de cultivo enriquecido

Reactivos Cantidad (g)


Glucosa 16
Sulfato de amonio 1.2
Extracto de levadura 0.8
KCl 0.2
MgSO4 0.2
FeCl3 0.2

Se preparo el medio de cultivo en dos matraces erlenmeyer de 1 L cada matraz, y se


añadieron las cantidades indicadas en la tabla para preparar 400 mL de medio en cada
uno. Una vez preparado el medio y verificando que la base del biorreactor estuviera
limpia, se procede a verter los 800 mL de medio en la base, y se mete al autoclave para
esterilización, protegiendo el mismo cerrando bien cada orificio.
Imagen 1.- Medio de cultivo con el hongo desarrollado.

Se aprecia la fermentación del hongo penicillium en el Biorreactor.

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Después de una semana que se dejo fermentando el hongo en el medio de cultivo, se


aprecio una cantidad considerable de biomasa, y se procedió a llevar a cabo una filtración
de vacio para separar la biomasa del sobrenadante y posteriormente realizar una
purificación en base al sobrenadante extraído.

En un trabajo industrial realizado en la farmacéutica Shering Plaug se realizo


fermentación de penicillium en un biorreactor más sofisticado y con la mayoría de los
ingredientes añadidos al medio que se preparo en esta práctica, según sus resultados,
tienen comparación con los obtenidos en la práctica debido a la explicación tanto
bioquímica como microbiología de las condiciones y nutrientes que demanda el hongo;
Alexander Fleming que fue el que descubrió el antibiótico comprobó que con la glucosa y
el extracto de levadura se producía la fermentación en el hongo para producir una
sustancia capaz de eliminar bacterias, descubrimiento que fue un gran avance al mundo
de la ciencia y sobre todo la medicina. Todo el medio preparado se hizo en base a las
necesidades que demandan el hongo penicillium para su desarrollo, considerando que
necesita una atención especial para desarrollarse y si no se le brinda lo necesario el
hongo se contamina o simplemente no se desarrolla y expira. Por ende todas las
consideraciones anteriores al preparar el medio antes de efectuar una inoculación. [2,4]

Realizando una investigación más profunda, también se discute que pudo haberse
utilizado sacarosa, su efecto respecto a nuestro medio de cultivo hubiese sido próspero,
pero no brinda suficientes fuentes de carbono debido a su inestabilidad como molécula
orgánica (no tiene todas sus conformaciones en posición ecuatorial como la glucosa), por
ende bioquímicamente no se adapta completamente a las necesidades de desarrollo y
crecimiento en el hongo según la literatura contrastada. [1-4]

Imagen 2.- Cantidad de biomasa presente en el medio de cultivo fermentado

Se aprecia una cantidad considerable de biomasa

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En otras investigaciones se encontró que el pH óptimo para que un hongo produzca


mayor cantidad de antibiótico y menor cantidad de biomasa es de 4.5 a 5 a una
temperatura de 25 grados Celsius, debido a que una menor cantidad de biomasa
representa mayor acción del precursor sobre el metabolismo secundario en un hongo.
Para el caso del hongo penicillium se observo una buena proliferación a los 3 días de
fermentación a un pH 6.5 y una temperatura de 26 grados Celsius, pero se produjo mucha
biomasa después de una semana en el fermentador. Según la literatura este no es bueno
puesto que hora que se extraiga el antibiótico este no será tan efectivo como un
antibiótico comercial, porque el precursor actuó como inductor del metabolismo primario
en lugar del secundario. Otros trabajos industriales señalan que mientras mayor numero
de biomasa producida, mayor cantidad y efectividad del antibiótico procesado, debido a
que alcanzo un estado estacionario, y una cantidad predominante de biomasa representa
un crecimiento paulatino, el hongo se adapto bien durante su etapa “lag” y continuo un
crecimiento logarítmico exitoso. Su reproducción fue tan prospera que el antibiótico
procesado será identificado mediante un antibiograma en la primera prueba. [1-3]

Purificación del sobrenadante

Una vez realizada la filtración al vacio se obtuvo un caldo impuro el cual se procedió a
purificar para obtener la penicilina. Después de centrifugar el caldo y añadirle 200 mL de
Ciclohexanona, dejar reposar 5 días y añadir a un tubo de decantación, se observo la
separación de dos fases: Orgánica (tenía otros metabolitos ajenos a la penicilina) de color
amarillo fuerte y Acuosa (contenía a la penicilina) de color amarillo claro. Se separa la
fase acuosa y posteriormente se pasa sobre una columna cromatografía anionica, para
guardar y conservar el producto.

Es importante este proceso puesto que se tiene que extraer el antibiótico de los otros
metabolitos inmersos en el caldo, para lo cual se centrifuga el sobrenadante y se le añade
ciclohexanona, cabe mencionar que la ciclohexanona es buena para solubilizar
metabolitos polares inmersos en el caldo, puesto que es un compuesto polar que ataca a
grupos aminos y carbonilicos de otro metabolitos secundarios. Comparando con otros
trabajos experimentales de obtención de penicilina, se encuentra que anteriormente hubo
otros intentos de purificación utilizando otros solventes polares como: éter, cloruro de
metileno y acetato de etilo, pero estos no resultaron en una separación de fases
adecuada, aparte de que muchos metabolitos secundarios se colaban en la fase acuosa
de penicilina, por ende el solvente orgánico que ha dado mayor resultado es la
Ciclohexanona, de haberse usado éter o cualquier otro mencionado, se hubiese obtenido
una fase acuosa de un amarillo más pronunciado. [Wade 2012]

Cuantificación en la concentración de penicilina obtenida

Todas las penicilinas tienen una estructura básica (figura 1), la cual tiene una absorbancia
con una longitud de onda entre 200 y 230 nm. Se tomó una longitud de onda de 285 nm,
ya que el espectrofotómetro no admitía lecturas a menores longitudes de onda, aparte
285 nm todavía se encuentra en el rango donde se obtiene una absorbancia relevante.

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Tabla 3.- Concentración de cada una de las diluciones de Penicilina Comercial

Dilución Concentración Absorbancia


0 500 1.218
1 125 1.005
2 62.5 1.052
3 31.25 0.702
4 7.8125 0.561
5 3.90625 0.483
6 1.953125 0.464
7 0.48828125 0.289

Estos resultados se obtuvieron en el espectro UV-VIS, cabe mencionar que el aparato


presento algunas fallas técnicas y por consiguiente para la obtención de las absorbancias
observadas, se tuvo que calibrar el espectro en la toma de cada muestra de penicilina
comercial, obteniendo unas lecturas más adecuadas que las anteriores. Al elucidar las
absorbancias en el espectro, de principio se efectuó una sola calibración, tomando como
blanco una celda con agua destilada, y arrojando unas lecturas bastantes variables y que
mostraban datos inconsistentes, no mostraban ninguna tendencia en específico, por ende
se tuvo que volver a realizar el espectro para presentar la tabla aquí mostrada.

Gráfica 1: Curva de Calibración de la penicilina comercial

Absorbancia de Penicilina Comercial


1.4
1.2 y = 0.1396ln(x) + 0.338
R² = 0.9453
1
Absorbancia

0.8
Absorbancia
0.6
0.4 Logarítmica
0.2 (Absorbancia)
0
0 100 200 300 400 500 600
Concentración y Dilución

Debido a la inconsistencia de la grafica, y al resultado que arrojo en el cálculo de la


concentración de la penicilina obtenida por fermentación, que fue de 46,332.07385
mg/mL, es notable que este dato es mayor que la concentración de la penicilina
comercial, y por tanto no es posible haber producido demasiada penicilina en un solo
proceso. Por lo tanto se procede a eliminar los dos datos que se señalan de verde, se
realiza una nueva regresión lineal, y se obtiene el siguiente grafico:

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Gráfica 2: Curva de calibración de la penicilina comercial (mejorada)

Absorbancia de Penicilina Comercial


1.2
y = 0.0103x + 0.4065
1 R² = 0.9307
Absorbancia

0.8

0.6
Series1
0.4
Lineal (Series1)
0.2

0
0 20 40 60 80
Concentración y Dilución

Con esta gráfica, se obtiene una tendencia lineal y congruente en la curva de calibración
de la penicilina comercial, contrastando estos resultados con las lecturas de absorbancia
realizadas al producto de la cromatografía de penicilina, que fue de 1.886, el resultado
nos otorga una concentración final de 143.64 mg/mL, y para el producto sobrenadante,
que fue de 1.795, el resultado fue una concentración final de 134.805 mg/mL.

Un factor que puede interferir en la lectura de la absorbancia para la penicilina comercial,


son los excipientes contenidos en este medicamento, en especial la solución inyectable
que se adjunta en la presentación del mismo, otorgando valores no solo de la penicilina
sino también de los componentes mencionados. [4]

Al comparar los resultados del grafico con varios análisis estadísticos en minitab, se
elucida que este método es de los más exactos para la determinación de un
comportamiento grafico útil para conocer concentraciones y constantes, cabe mencionar
que este tipo de datos resulto indispensable para la determinación de la concentración en
productos de penicilina obtenida por la fermentación, y como las concentraciones tuvieron
un rango de números aceptable, por ende se corrobora la eficiencia del método de
referencia para conocer la cantidad de producto elaborado. [3]

Elaboración de Antibiograma

Se realizaron 9 antibiogramas en total con tres cepas de diferentes hongos (Lotto, B.


Subtilus y Salmonella) y tres muestras distintas de penicilina (Comercial, sobrenadante y
producto de cromatografía), para comparar ambas y determinar la presencia de penicilina
obtenida después de la fermentación.

Las imágenes se aprecian a continuación:

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Imagen 3: Halos de inhibición de penicilina extraída a distintas concentraciones en cultivo Salmonella

Contaminación

Inhibición tanto del hongo


inoculado en el medio como
de los microorganismos
invasores

Imagen 4: Halos de inhibición de penicilina comercial a distintas concentraciones en cultivo B.


Subtilus

Imagen 5: Halos de inhibición de penicilina comercial a distintas concentraciones en cultivo


Salmonella

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Imagen 6: Antibiograma infectado por hongos ajenos al cultivado y halos de inhibición penicilina
sobrenadante a distintas concentraciones en cultivo salmonella

Contaminación

Inhibición tanto del hongo


inoculado en el medio como
de los microorganismos
invasores

Imagen 7: Halos de inhibición de muestra sobrenadante de penicilina a distintas concentraciones en


cultivo B. Subtilus

Imagen 8: Halos de inhibición de producto cromatografía de penicilina a distintas concentraciones en


cultivo B. Subtilus

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Imagen 9: Halos de inhibición de penicilina comercial a distintas concentraciones en cultivo Lotto

Imagen 10: Halos de inhibición de producto cromatografía de penicilina a distintas concentraciones en


cultivo Lotto

Considerando que cada antibiótico tiene un mecanismo de acción diferente, y cuenta con
diferentes regiones moleculares activas, que pueden reaccionar con una bacteria, se
usaron tres muestras distintas del mismo antibiótico, penicilina, aproximando las
concentraciones de las mismas, a las concentraciones que se encuentran de manera
comercial tanto en forma farmacéutica, como medicamentos.

Como podemos apreciar en las siguientes imágenes, hubo inhibición en todos los cultivos
donde se colocaron sensidiscos impregnados con las distintas penicilinas trabajadas en el
laboratorio, la mayor inhibición apreciada en las tres cepas fue de la penicilina comercial,
posteriormente el producto obtenido de la cromatografía y al ultimo la muestra
sobrenadante. Con los halos de inhibición obtenidos se corrobora la presencia y
producción de penicilina en la fermentación, y se aprecia que la excesiva biomasa
(imagen 2) contenida al fermentar el hongo, no afecto a la obtención del antibiótico, sino

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de lo contrario produjo mayor cantidad del mismo. A pesar de haberse contaminado las
cepas de las imágenes 3 y 6, se observa una inhibición en el crecimiento de los hongos
enemigos desarrollados, corroborando con mayor certeza la obtención del antibiótico
puro, a tal magnitud de propagarse una combinación de hongos por invasiones de
espacio en el agar, que propagarse por el mismo, porque el antibiótico impedía
mencionada propagación, por consiguiente, la afectividad de los antibióticos ayudo a
inhibir una mayor contaminación en las cepas cultivadas en las cajas petri. [5-7,9]

La penicilina es un antibiótico que pertenece al grupo de las aminopenicilinas, de manera


general, se sabe que la acción de este tipo de antibióticos, es bactericida, por lo que
actúan sobre la pared celular inhibiendo la actividad transpeptidasa de las proteínas
enzimáticas fijadoras en bacterias. [Faría Reyes & et al., 2000]

Un mecanismo de resistencia a este antibiótico, es la disminución de porinas de la pared


celular, disminuyendo así la permeabilidad, teniendo como consecuencia una inhibición, la
única bacteria capaz de inhibir por completo el antibiótico, es la Gram (-) Enterobacter,
Lotto y salmonella en cambio fueron las bacterias más susceptibles ya que muestran
halos de inhibición más extensos. [6-8]

Imagen 11: Antibiograma más llamativo y sobresaliente, halos de inhibición de la muestra


sobrenadante en la fermentación de penicilina, a distintas concentraciones en cultivo Lotto

67.4 mg/mL

33.7 mg/mL

En esta imagen se observan los halos de inhibición del producto sobrenadante de la


penicilina extraída a distintas concentraciones en cultivo Lotto, cabe mencionar que Lotto
es gram (+), y por ende la inhibición tuvo lugar y no ofreció resistencia al antibiótico. Los

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procesos biológicos por los que un microorganismo puede adquirir resistencia a un


antibiótico son [5-7]:

 Transformación: cuando se transfiere ADN del medio ambiente hacia la bacteria y


se modifica el ADN de ésta.
 Conjugación: Transferencia de ADN de una bacteria a otra por medio de un
plásmido.
 Transducción: Paso de material genético de una célula a otra a través de un fago.
 Evolución: A través de proceso de adaptación, selección natural y reproducción
diferencial.

Conclusión

Con base a los resultados obtenidos se concluye sobre la importancia de considerar los
factores necesarios para la preparación de un medio de cultivo enriquecido, adecuado a
un determinado microorganismo a desarrollar, ya que la fermentación de un metabolito
secundario en especifico, no solo es producto del tipo de biorreactor empleado para su
elaboración, sino de los factores microbiológicos adecuados al microorganismo
seleccionado para producirlo, tales como: reactivos, materiales, y condiciones
ambientales (esterilidad, pH y temperatura), ya que de ello depende el sano desarrollo del
hongo inoculado. Fundamentando que el medio de cultivo debe ser apropiado al
microorganismo de interés, y quedar exento de cualquier microorganismo contaminante,
esto se logra gracias a la añadidura de sales al medio de cultivo y la esterilización del
mismo, y la zona de trabajo, como cada uno de los materiales a emplear, durante la etapa
de inoculación.

También se menciona la importancia de la cantidad de biomasa producida en el medio,


porque garantiza si hubo una correcta proliferación del hongo en el mismo y se excretaron
los metabolitos secundarios de interés, las condiciones de temperatura y pH deben ser tal
cual lo señalan trabajos experimentales y fuentes literarias, ya que el hongo Penicillium
Chrysogenum es adaptable a pH casi neutro y temperatura ambiente, ya que se propicia
su ruta metabólica secundaria la cual produce el antibiótico de interés.

La purificación del caldo de cultivo resulta esencial para la obtención del compuesto, se
necesita un antibiótico 100 % puro para poderse administrar por cualquier vía, por ende
su importancia, porque administrar una penicilina impura puede generar efectos
secundarios y adversos a la salud del consumidor, y como no se conoce a los otros
metabolitos secundarios producidos por el hongo Penicillium Chrysogenum, por lo tanto
se desconoce su acción y posibles efectos biológicos en el organismo.

Las Bacterias pueden tener diferentes métodos de resistencia a los antibióticos, esto
debido al uso descomunal que la industria farmacéutica ah dado a los mismos, en el área
de la salud, este es un tema de interés para la población civil, ya que se requieren de
nuevos fármacos capaces de inhibir un determinado crecimiento bacteriano por rutas
metabólicas alternas que no generen ningún tipo de resistencia. Para la realización de un

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estudio de resistencia a antibióticos, no se puede generalizar a las bacterias por su


taxonomía ni tampoco por ser Gram (-) o Gram (+), porque cada bacteria tiene rutas
metabólicas diferentes, y puede darse el caso que bacterias del mismo género arrojen
resultados diferentes para cada antibiótico, lo mismo ocurre con los antibióticos, que a
pesar de estar en la misma clasificación pueden dar resultados distintos a los esperados,
por lo cual si se desean resultados precisos, lo mejor es manipular una determinada cepa,
con un seleccionado antibiótico.

Por último se produjo penicilina pura a una concentración de 143.64 mg/mL, gracias a la
fermentación del hongo Penicillium chrysogenum en un biorreactor de tanque agitado
lamba, y un medio de cultivo enriquecido con precursores necesarios para inducir al
hongo a desarrollar un metabolismo secundario propicio a la excreción del antibiótico
deseado. Se sometió el producto empleando métodos que implican bioseparaciones,
procesos utilizados en la producción de antibióticos por la microbiología clínica.

Cuestionario Complementario

Nota: Este cuestionario se encontró en un protocolo experimental de una práctica


de laboratorio de microbiología, y se decidió anexar las preguntas mas destacadas
a procesos que no se elaboraron en el laboratorio de fermentaciones, pero que son
de gran utilidad conocerlos.

1. Explica en qué consiste la prueba “E”.

La prueba E o método PDM de epsilómetro ha sido usado exitosamente para analizar


anaerobios y otros organismos aeróbicos. El término epsilómetro se refiere a una tira fina,
de 5 x 50 mm, inerte y no porosa con un gradiente continuo exponencial de agente
antimicrobiano inmovilizado en un lado y una escala de interpretación impresa en el otro
lado. El gradiente de agente antimicrobiano cubre un amplio rango de concentración, que
corresponde aproximadamente diluciones dobles. La pendiente de los cambios y los
rangos de concentración están óptimamente diseñados para corresponder a rangos y
límites de CIM clínicamente relevantes que son seleccionados para categorizar grupos de
susceptibilidad. Se inocula una placa de agar, que contenga un medio de prueba apto,
con un organismo de prueba de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego se
aplican las tiras de prueba en un patrón óptimo de tal manera que la máxima
concentración en cada tira esté más cerca al borde exterior de la placa de Petri. La placa
es inmediatamente incubada aeróbicamente o anaeróbicamente por el periodo de tiempo
estipulado. Cuando es aplicado a una placa de agar inoculada, el gradiente
antimicrobiano de la tira es liberado inmediatamente en el agar, creando un gradiente
continuo y exponencial de concentraciones de agente antimicrobiano debajo del eje lineal
del material de soporte. [7]

Después de la incubación, se observa una elipse de inhibición de crecimiento. La


intersección entre el borde de la zona de inhibición y la tira de soporte se produce en la
concentración del antimicrobiano que ya no es capaz de inhibir el crecimiento. El punto de
intersección da la ―concentración inhibitoria‖ (CI) en µg/mL— una medida directa de la

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susceptibilidad del microorganismo al agente antimicrobiano probado. Las CIMs se leen


directamente sobre la escala en la tira de soporte. [8]

2. Explica, ejemplifica y esquematiza un proceso de sinergismo en antibióticos.

El sinergismo de los Antibióticos ocurre cuando el efecto de una combinación es mayor


que la suma de los efectos de los antibióticos usados individualmente. En pacientes
hospitalizados con cateterización venosa profunda y sonda vesical, la presencia de fiebre,
escalofríos e hipotensión arterial se debe sospechar la presencia de una sepsis urinaria o
relacionada con la cateterización, los microorganismos más comunes que pueden
ocasionarlas son los estafilococos y otros Gram positivos, así como algunos Gram
negativos potencialmente resistentes. En estas situaciones se han obtenido buenos
resultados al combinar oxacilina o vancomicina con un aminoglucósido, fosfomicín,
algunos monobactámicos y el augmentín. [8]

3. Discute los efectos en la salud pública por el reciente surgimiento de MRSA en


hospitales.

La aparición de MRSA en hospitales y recientemente en la comunidad hace más difícil el


tratamiento médico para infecciones con MRSA pues ya que al ser multiresistentes a
antibióticos se necesita conocer muy bien los antibióticos que aún pueden ser útiles para
tratar a estas cepas y no contribuir a que aumente su multiresistencia. [2-3]

4. Discute la importancia de la reforma al artículo 226, fracción IV de la Ley General


de Salud
respecto a l surgimiento de cepas multiresistentes.

Es importante que un médico sea el que pueda controlar la prescripción de un


medicamento y por su parte la adquisición de éste por el paciente, pues ya que así se
promueve la buena aplicación de un tratamiento médico específico para las enfermedades
que un paciente pudiera tener y no permitir la automedicación de la persona enferma y
por consiguiente contribuir a la aparición de cepas multiresistentes a antibióticos. [7,9]

Referencias

[1] Romero Caballero Raúl. (2008). Microbiología y parasitología humana: bases


etiológicas de las enfermedades infecciosas y parasitarias (1era Edición). México.
Editorial Medica Panamericana.

[2] Melo Ruiz V. (2007). Bioquímica de los procesos metabólicos (2da Edición).
México. Editorial Reverte.

[3] Microbial Technology. Microbial Processes. Second Edition (Volume I). Ed. H.J.
Peppler and D. Perlman. Academic Press, N. Y., 1979.

[4] R M Atlas & B Bartha. (2005). Ecología Microbiana y Microbiología Ambiental.


México. Editorial Pearson España.

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[5][ Prescott, Harley, Klein][ Microbiología, quinta edición] [editorial McGRAW-HILL


interamericana]
4FV1
[6] [Michael T. Madigan, John M, Jack P, Brock] [Biologia de los Microorganismos,
10° edición] [Pearson Prentice Hall]

[7] [Reporte multicéntrico de los resultados de los ensayos de susceptibilidad a


antibióticos] [Ileana González Bonet, Fernando Travieso Ruiz,* Leonora González
Mesa, Estrella Álvarez Varela,* Gilberto Tillán Ochoa* y Rolando Contreras
Alarcón.*] [Departamento de Investigaciones Biomédicas, Centro de Química
Farmacéutica.][ Centro Nacional de Investigaciones Científicas. Avenida 25 y 158,
Apartado Postal 6414, Playa, Ciudad de La Habana, Cuba.]

[8] [INTERPRETACION DE LOS ESTUDIOS DE SUSCEPTIBILIDAD


ANTIMICROBIANA] [Boletín Escuela de Medicina. Pontificia Universidad Católica de
Chile][Dra. Elizabeth Palavecino Rosales]

[9] [Clasificación de Antimicrobianos y Quimioterápicos][Dra. Almudena Calvo


Zamorano][Capitulo 54]

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Base de Calculo

Medio PYM de cultivo composición para 1 L

Reactivo Cantidad (g) para Cantidad (g) para Cantidad (g) para
1000 mL 800 mL 200 mL
Glucosa 40 32 8
Sulfato de amonio 3 2.4 0.6
Extracto de 2 1.6 0.4
Levadura
KCl 0.5 0.4 0.1
MgSO4 0.5 0.4 0.1
FeCl3 0.5 0.4 0.1

Calculo de la concentración de la penicilina presente en el producto de la cromatografía

Con base a la ecuación de la línea de tendencia (Curva mejorada)

y = 0.0103x + 0.4065

Despejamos ―x‖ para obtener el valor de la ecuación

X = (y – 0.4065)/0.0103

Sustituyendo el valor de la absorbancia medida a la muestra del producto de la


cromatografía y el sobrenadante, tenemos:

X = (1.886 – 0.4065)/0.0103 = 143.64 mg/mL (cromatografía)

X = (1.795 – 0.4065)/0.0103 = 134.805 mg/mL (Muestra sobrenadante)

Con base a la ecuación de la línea de tendencia (Curva normal)

y = 0.1443 ln (x) + 0.3357

Despejamos ―x‖ para obtener el valor de la ecuación

X = exp ((y – 0.3357)/0.1443)

Sustituyendo el valor de la absorbancia medida a la muestra del producto de la


cromatografía y el sobrenadante, tenemos:

X = exp ((1.886 – 0.3357)/0.1443) = 46,332.07 mg/mL (cromatografía)

X = exp ((1.795 – 0.3357)/0.1443) = 24,660.52 mg/mL (Muestra sobrenadante)

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Concentraciones y diluciones para el espectro UV en penicilina comercial

La concentración total de penicilina comercial era de 800,000 UI que a mg/mL son 500

Por lo tanto tenemos una concentración de 500 mg/mL de penicilina comercial en ámpula

Se realizan diluciones de mitad en mitad para determinar la absorbancia a diferentes


concentraciones, por tanto tenemos:

C1 = 500

C2 = C1/2 = 500/2 = 250

C3 = C2/2 =250/2 =125

C4 = C3/2 =125/2 = 62.5

C5 = C4/2 =62.5/2 = 31.25

C6 = C5/2 = 31.25/2 = 15.625

C7 = C6/2 =15.625/2 = 7.8125

C8 = C7/2 =7.8125/2 = 3.90625

C9 = C8/2 =3.90625/2 = 1.953125

C10 = C9/2 =1.953125/2 = 0.9765625

C11 = C10/2 = 0.9765625/2 = 0.48828125

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