A.

Prinsip Kerja

Menganalisis koliform dengan uji MPN pada sampel minuman Es Dawet

dengan menggunakan media LB, kemudian diisolasi pada media BGLBB, ENDO AGAR,
TSIA Dan uji biokimia.

B. Cara kerja
1. HARI 1. Uji penduga
Pengenceran sampel
1) Masukkan 45 ml Nacl 0,9% + 5 ml sampel kedalam Erlemeyer 10-1 kemudian
dihomogenkan.
2) Setelah dihomogenkan dipindahkan 1 ml didalam 3 tabung reaksi yang berisi Nacl
9 ml 10-2 kemudian dihomogenkan
3) Setelah dihomogenkan dipidahkan 10-2 ke 3 tabung reaksi 10-3 kemudian
dihomogenkan
a) Isolasi sampel minuman 10-1 ke media LB Ke seri 1
a. Dimasukkan sampel minuman yang sudah diencerkan sebanyak 5 ml ke
dalam media LB 0,5 % Ke masing-masing 3 tabung
b. kemudian di inkubasi selama 1x24 jam pada suhu 37oC
b) Isolasi Sampel minuman 10-2 ke media LB ke seri 2
a. Dimasukkan sampeles dawet sebanyak 10 ml ke dalam media LB 0,5 % Ke
dalam 3 tabung
b. kemudian di inkubasi selama 1x24 jam pada suhu 37oC
c) Isolasi Sampel minuman 10-3 ke media LB ke seri 2
a) Dimasukkan sampel es dawet sebanyak 1 ml ke dalam media LB 0,5 % Ke
dalam 3 tabung
b) kemudian di inkubasi selama 1x24 jam pada suhu 37oC
2. HARI 2. Inokulasi dari media LB ke media BGLBB
a) Inokulasi media LB 10-1 Ke media BGLBB seri 1
a. Disiapkan Media BGLBB
b. Dipijarkan ose Lurus menggunakan api Bunsen
c. Fiksasi mulut tabung rekasi sebelum dan sesudah inokulasi
d. Diambil 1-2 ose biakan pada media LB kemudian diusapkan ose tersebut pada
ketiga dinding tabung seri 1 (10-1)
 e. Diinkubasi di inkubator selama 1 x24 jam pada suhu 37oC
b) Isolasi Sampel minuman ke media LB 10-2 ke seri 2
a. Disiapkan Media BGLBB
b. Dipijarkan ose Lurus menggunakan api Bunsen
c. Fiksasi mulut tabung rekasi sebelum dan sesudah inokulasi
d. Diambil 1-2 ose biakan pada media LB kemudian diusapkan ose tersebut pada
tiga dinding tabung seri 2 (10-2)
e. Diinkubasi di inkubator selama 1 x24 jam pada suhu 37oC
c) Isolasi Sampel minuman ke media LB 10-3 ke seri 3
a. Disiapkan Media BGLBB
b. Dipijarkan ose Lurus menggunakan api Bunsen
c. Fiksasi mulut tabung rekasi sebelum dan sesudah inokulasi
d. Diambil 1-2 ose biakan pada media LB kemudian diusapkan ose tersebut pada
tiga dinding tabung seri 3 (10-3)
e. Diinkubasi di inkubator selama 1 x24 jam pada suhu 37oC
3. HARI 3. Inokulasi media BGLBB ke media endo agar
a) Inokulasi media BGLBB ke media Endo Agar
1. Disiapkan Media Endo agar
2. Dipijarkan ose Lurus menggunakan api Bunsen
3. Fiksasi mulut tabung rekasi sebelum dan sesudah inokulasi
4. Diambil 1-2 ose biakan pada media BGLBB kemudian media digoreskan
berbentuk sinambung pada media Endo agar
5. Diinkubasi di inkubator selama 1 x24 jam pada suhu 37oC
4. Hari IV. Pewarnaan gram media endo agar dan inokulasi bakteri dari media Endo agar
ke media TSIA
a) Pewarnaan gram media endo agar
1. Dipanaskan ose di atas api bunsen sampai memerah
2. Diambilkan biakan bakteri pada media Endo agar dengan menggunakan ose
yang sudah di pijarkan
3. Letakkan biakan di atas objek gelas dan fiksasi dengan melewatkannya di atas
api sebanyak 3 kali.
4. Teteskan kristal violet sebagai pewarna utama, usahakan semua ulasan
terwarnai dan tunggu selama kira kira 1 menit. Kristal violet berfungsi untuk
mewarnai seluruh permukaan sel bakteri gram positif dan gram negative.
 5. Cuci dengan air mengalir
6. Tetskan 2-3 tetes larutan mordant (lugol) lalu tunggu kira kira 1 menit. Fungsi
lugol untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warrna oleh bakteri.
7. Cuci dengan air mengalir
8. Beri larutan pemucat (alkohol 96%) setetes demi stetes hingga etanol yang
jatuh berwarna jernih. Jangan sampai terlalu banyak. Alcohol berfungsi untuk
melunturkan zat warna yang berlebihan.
9. Cuci dengan air mengalir
10. Teteskan air fuchsin dan tunggu selama kira kira 1 menit. Air fuchsin fungsinya
untuk mewarnai sel bakteri gram negative.
11. Cuci dengan air mengalir
12. Keringkan preparat dengan kertas tissue yang ditempelkan di sisi ulasan lalu
biarkan mengering di udara
13. Amati dengan mikroskop perbesaran 40 x dan 100 x (ditambah oil emercy).
b) Inokulasi bakteri dari media Endo agar ke media TSIA
1. Disiapkan alat dan bahan
2. Dipijarkan ose lurus menggunkan api Bunsen
3. Diambil 1-2 ose biakan pada media Endo agar kemudian Digores pada media
TSIA Di permukaan media lalu ditusukkan, jangan sampai dasar tabung secara
aseptic
4. Inkubasi di inkubator selama 1 x24 jam pada suhu 37oC
5. Hari ke lima. Inokulasi media TSIA ke media MRVP, SCA, INDOL
a) Uji Methyl Red Voges-Proskauer (MRVP)
1. Disiapkan Media Methyl Red Voges-Proskauer (MRVP)
2. Dipijarkan ose Lurus menggunakan api Bunsen
3. Fiksasi mulut tabung rekasi sebelum dan sesudah inokulasi
4. Diambil 1-2 ose biakan pada media TSIA kemudian diusapkan ose tersebut
pada dinding tabung
5. Diinkubasi di inkubator selama 1 x24 jam pada suhu 37oC
6. Setelah diinkubasi, tambahkan 5 tetes reagen methyl red ke dalam media,
kemudian homogenkan
7. Amati perubahan pada uji MR
Jika media berubah menjadi warna merah berarti media (+) mengandung
bakteri.
b) Uji Methyl Red Voges-Proskauer (MRVP)
1. Disiapkan Media Methyl Red Voges-Proskauer (MRVP)
2. Dipijarkan ose Lurus menggunakan api Bunsen
3. Fiksasi mulut tabung rekasi sebelum dan sesudah inokulasi
4. Diambil 1-2 ose biakan pada media TSIA kemudian diusapkan ose tersebut
pada dinding tabung
5. Diinkubasi di inkubator selama 1 x24 jam pada suhu 37oC
6. Setelah diinkubasi , tambahkan 0,6 ml α naftol + 0,2 ml KOH 40 % ke dalam
media, kemudian homogenkan
7. Amati perubahan pada uji VP
8. Jika media berubah menjadi warna merah berarti media (+) mengandung bakteri
6. Inokulasi media TSIA Ke Media SCA
1. Disiapkan alat dan bahan
2. Dipijarkan ose lurus menggunkan api Bunsen
3. Fiksasi mulut tabung rekasi sebelum dan sesudah inokulasi
4. Diambil 1-2 ose biakan pada media TSIA kemudian lakukan penusukkan pada
media SCA , perhatikan jangan sampai tusukan menyentuh dasar tabung
5. Inkubasi Media SCA di inkubator selama 1 x24 jam pada suhu 37oC
6. Setelah diinkubasi, amati perubahan warna yang terjadi pada media SCA. Jika
media berubah menjadi warna hijau berarti media positif (+) SCA.
7. Inokulasi media TSIA Ke Media INDOL
1. Sterilkan ose lurus dengan cara pijarkan osediatas api Bunsen dari ujung sampai
ke pangkal
2. Ambil biakan dari media TSIA dengan menggunakan ose yang telah difiksasi
3. Difiksasi mulut tabung reaksi sebelum diinokulasi
4. Diusapkan biakan tersebut pada dinding tabung media indol
5. Sterilkan kembali ose dari pangkal keujung
6. Inkubasi selama 1x24 jam pada suhu 37 ºC.
7. Indole : tambahkan reagen kovasch 5-10 dan lihat perubahan yang terjadi, jika
terbentuk cincin merah berarti indol positif (+)