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“AÑO DEL DIÁLOGO Y RECONCILIACIÓN NACIONAL”

FACULTAD DE INGENIERIA DE INDUSTRIAS


ALIMENTARIAS

PRACTICA N° 4: “Determinación de biomasa: recuento


microscópico en cámara neubauer”

Docente: Norma Gamarra Ramírez

Estudiante: Cacha Medina Edgar

Código: 113.0204.127

Semestre: 208-I
“DETERMINACIÓN DE BIOMASA:
RECUENTO MICROSCÓPICO EN
CÁMARA NEUBAUER”
I. INTRODUCCION:
En la agroindustria y en sus aplicaciones es importante conocer el número de
microorganismos presentes en una muestra. Este conocimiento puede ser utilizado en estudio
de curvas de crecimiento, análisis de alimentos, preparaciones de inóculos para fermentación,
etc.
Un parámetro clave en el modelado y monitoreo del funcionamiento de plantas de
agroindustriales dedicadas a procesos de fermentación, panificación entre otros en donde se
utilicen inóculo es la concentración de biomasa. Biomasa es un término general que se refiere
a los microorganismos presentes en un sistema. Existen muchas maneras de medir la
concentración de biomasa, como por ejemplo masa, volumen, extensión linear de filamentos,
dispersión de luz, conteo de células u organelas.
Existen diferentes métodos para cuantificar el número de microorganismos o peso (biomasa)
de células microbianas en un cultivo; los métodos pueden ser directos e indirectos. Entre los
directos se puede mencionar a la determinación de peso seco y el recuento de células en
cámara de Neubauer.
La determinación de peso seco es un método de cuantificación muy utilizado en cultivos de
gran densidad, sobre todo para hongos y levaduras. Como los cultivos se someten a varios
procesos (filtración, lavado, secado) se pueden causar pérdidas importantes de biomasa y
errores en la cuantificación. El método de cuenta directa en cámara tiene la ventaja de ser
muy rápido y económico, aunque no se pueden distinguir las células viables y no viables. Se
puede calcular el número de microorganismos en una muestra a partir del volumen de la
cámara y de las diluciones de la muestra que sean necesarias. Sin embargo, tiene el
inconveniente de que la observación y cuantificación se dificultan en células muy pequeñas
(1 – 5 µm) o en poblaciones de baja densidad debido al pequeño volumen de muestra que se
utiliza (0.1 – 0.2 mm3).
El presente informe se detalla a continuación todos los pasos a seguir para el recuento en la
cámara neubauer.
II. OBJETIVO

 Conocer el proceso de determinación de biomasa celular utilizando biomasa de una


población de saccharomyces cerevisiae NIT – 1.51 mediante el recuento
microscópico con la cámara de Neubauer.
III. FUNDAMENTO TEORICO

3.1.Medida del crecimiento

El crecimiento de una población bacteriana puede ser entendido desde diferentes


perspectivas y de acuerdo a éstas se puede llegar a determinar la medida del
crecimiento mediante diversas metodologías.

Para algunos, el crecimiento es la capacidad para multiplicarse que tienen las células
individuales, esto es iniciar y completar una división celular. De esta forma, se
considera a los microorganismos como partículas discretas y el crecimiento es
entendido como un aumento en el número total de partículas bacterianas (Franson,
1992).
Existen dos formas para determinar el número total de microorganismos en una
muestra:
 Recuento microscópico de partículas
 Recuento electrónico de partículas
Para otros, el crecimiento implica el aumento de los microorganismos capaces de
formar colonias debido a que sólo se tiene en cuenta el número de microorganismos
viables, esto es capaces de crecer indefinidamente. Las determinaciones que se
utilizan son:
 Recuento de colonias
 Método del número más probable
Para los fisiólogos bacterianos, bioquímicos y biólogos moleculares una medida del
crecimiento es el incremento de biomasa. Para ellos, la síntesis macromolecular y un
incremento en la capacidad para la síntesis de los componentes celulares es una
medida del crecimiento. Para este grupo la división celular es un proceso esencial
pero menor que rara vez limita el crecimiento, ya que lo que limita el crecimiento es
la capacidad del sistema enzimático para utilizar los recursos del medio y formar
biomasa:
 Determinación de peso húmedo
 Determinación de peso seco
 Determinación de nitrógeno total
 Determinación química de un ácido nucleíco
Un último grupo entiende al crecimiento sobre la base de la influencia que ejercen los
microorganismos en los cambios químicos de su entorno como consecuencia del
incremento de la biomasa (Tortora, Funke, & Case, 2007).
3.2.Recuentos Directos
Recuento microscópico: Es una técnica común, rápida y barata que utiliza un
equipamiento fácilmente disponible en un laboratorio de microbiología. Para estos
recuentos se utilizan generalmente cámaras de recuentos, aunque también pueden
realizarse a partir de muestras filtradas en membranas y transparentadas o teñidas con
colorantes fluorescentes (Naranja de acridina).
La mayor dificultad del recuento en cámara es obtener reproducibilidad en el llenado
de la cámara con líquido. Otra dificultad es la adsorción de las células en las
superficies del vidrio, incluyendo pipetas. Esta adsorción es crítica en el proceso de
dilución de la muestra y se minimiza al realizar las diluciones en medios de alta fuerza
iónica (solución fisiológica o medios mínimos sin fuente de carbono) (Rodríguez,
2005)
Las cámaras más utilizadas son las de Hawksley y la de Petroff-Hausser. La primera
tiene la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersión, aunque la mayoría
de los recuentos se realizan con objetivos secos. Una de las mayores ventajas del
recuento microscópico es brindar información adicional sobre el tamaño y la
morfología de los objetos contados (Palma, 2001)
3.3. La Cámara de Neubauer
La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo
claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el
centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una
cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una
separación entre dos líneas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y
marcada L corresponde a 1 milímetro cuadrado.
Es un instrumento utilizado en medicina y biología para realizar el recuento de células
en un medio líquido, que puede ser un cultivo celular, sangre, orina, líquido
cefalorraquídeo, líquido sinovial, etc. (Ames & Cañedo, 2004)
Esta cámara de contaje está adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste
de fases. Se trata de un portaobjetos que tiene dos zonas ligeramente deprimidas y
que en el fondo de las cuales se ha marcado con la ayuda de un diamante una
cuadrícula de dimensiones conocidas. Se cubre la cámara con un cubrecámaras que
se adhiere por simple tensión superficial.
Luego se introduce el líquido a contar, al que generalmente se ha sometido a una
dilución previa con un diluyente, por capilaridad entre la cámara y el cubrecámara;
puesto que tiene dos zonas esto permite hacer dos recuentos simultáneamente. Para
contar las células se observa el retículo al microscopio con el aumento adecuado y se
cuentan las celulas.
Con base en la cantidad de células contadas, conociendo el volumen de líquido que
admite el campo del retículo, se calcula la concentración de células por unidad de
volumen de la muestra líquida inicial.
La fórmula de valoración del número de células (válida universalmente) es la
siguiente: Partículas por mL=(partículas contadas) / (superficie contada (mm²) x
profundidad de la cámara(mm) x dilución). (Castillo 2004)

Figura 1. Representación de la cuadricula de la cámara de Neubauer con


el ocular de 10x y 40x

En el reticulo central, la camara de Neubauer posee un cuadrado primario que


contiene nueve cuadrados secundarios cada uno de ellos divididos a su vez en 16
cuadrados terciarios, el cuadrado central contiene 25 cuadrados, cada uno de ellos
dividido a su vez en 16 cuadrados cuaternarios. En los bordes de este cuadrado central
se cuentan los hematíes, utilizando sólo los cuadrados de los bordes del terciario
central y uno de los centrales. (Aquiahuati, 2004)

La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo


claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el
centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una
cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una
separación entre dos líneas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y
marcada L corresponde a 1 milímetro cuadrado. La depresión central del cubreobjetos
está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un
cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen
comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico, es
decir 0.1 microlitro.
Para contar las células de un cultivo líquido, se agrega una gota de este entre estas
dos placas y observar al microscopio óptico la cantidad de células presentes en un
campo determinado de las grilla. (Ames & Cañedo, 2004)
3.4. Manipulación de la cámara de Neubauer.
3.5.Conteo en cámara de Neubauer

1. Colocar el cubreobjetos sobre el portaobjetos de la cámara e introducir entre ambos


la muestra celular previamente preparada. Debe evitarse que la muestra rebalse, si
esto sucede las células a contar también se perderán.
2. La velocidad de llenado de la cámara debe ser homogénea, evitando así una mala
distribución de las células en el preparado que traerá aparejado errores en el recuento.
3. La muestra no debe secarse, por lo tanto es recomendable guardar la cámara de
Neubauer cargada dentro de una cámara húmeda para que sedimenten las células.
4. Luego se coloca la cámara en un microscopio óptico y se procede al conteo,
eligiendo para ello los cuadrados apropiados.
5. Se elegirá un criterio para definir qué células se cuentan y cuáles no, cuando las
mismas quedan sobre uno de los bordes del cuadrado.
6. Una vez contadas las células se calcula la concentración en la muestra original,
considerando: la dilución de la muestra hecha para el sembrado, la cantidad de
cuadrados considerados, el número de células contadas y el volumen de muestra
debajo de cada cuadrado.
Ejemplo de cálculo en cámara de Neubauer

Figura 3. Conteo realizado en el retículo de Thoma.

A. Se obtendrá el promedio de células. =10 células X


B. Las dimensiones del retículo será: 0.2x0.2x0.1.
IV. MATERIALES Y METODOS

1. Materiales:

- Cámara de Neubauer
- Microscopio
- Pipeta pasteurizada
- Material biológico, Saccharomyce cereviseae

2. Método:

Tomar la muestra a evaluar, la cual dependiendo de la


concentración se puede diluir (ej: 10-1 , 10-2 , etc) luego tomando
la muestra con pipeta pasteurizada se procede a cargar la cámara,
la cual debe estar bien limpia al igual que el cubreobjetos.

Aplicar la muestra desechando las primeras gotas,


colocando la punta de la pipeta al borde de la cámara,
dejando salir una pequeña gota para cubrir toda la
extensión. Dejar que la cámara permanezca en la posición
horizontal entre 2 a 3 minutos.

Colocar la cámara en la platina del microscopio y


observar con poco aumento para verificar la
uniformidad de las células, en caso contrario se limpia
y se carga nuevamente.

Dependiendo del tamaño de las células a


contabilizar, escoger los cuadrantes más
adecuados.
V. RESULTADOS Y DISCUCIONES

 Resultados

 UFC vistos a partir de la disolución 10-2

13 4  Promedio

9 𝟏𝟑+𝟒+𝟗+𝟐+𝟑
= 6.2
𝟓
2 3

 Calculo de UFC x ml

6.2 x 25 = 155  155 x 100 = 15500 1.55 x 10 4 UFC/ml

1.6 X 104 X 102 = 1.6 x 106 UFC/ml

 Discuciones
Según Aquiahuati, (2004); la cámara de Neubauer permite hacer un recuento superficial de
las células de levadura, sin embargo no permite distinguir las células viables de las no viables.
Esto se puede contrastar en el cuadro, en donde observamos que hicimos un conteo de 25
celdas.
Según Madigan, et al (1998), mediante el método de conteo directo en cámara de Neubauer
se debe utilizar fórmulas que expresen la concentración de células, mostrando diferencia a la
utilizada para el recuento de levaduras en laboratorio. Esto se observa en los datos hallados
en la Tabla donde determinamos la concentración de células en UFC/ml
Según Rodríguez et al, 2005), los métodos para estimar el número de microorganismos
medirán la cantidad de células. Los métodos que cuantifican la cantidad de células son útiles
principalmente para enumerar organismos como bacterias o levaduras, mientras los que
miden la masa o actividad celular pueden utilizarse para todos los microorganismos,
incluidos los hongos filamentosos, en los que es difícil cuantificar las células individuales.
Según lo expuesto por el autor en nuestra práctica hicimos conteo de levadura de
Saccharomyces cerevisiae por mililitro, para la determinación de su biomasa utilizando el
método directo por recuento en el microscopio.
VI. CONCLUCIONES

 Se logró determinar la concentración de células de la levadura Saccharomyces


cerevisiae en las 25 celdas la que nos dio 1.5 x 106 UFC /mL y en las 5 celdas al azar
nos dio un valor de 1.55 x 10 4 UFC/ml por lo que nos damos cuenta que la muestra de
5 celdas al azar es una muestra representativa de la general.se pudo determinar las
células por mililitro gracias a la cámara Neubauer.

 Es importante contar en total en total 10 cuadrados, cinco en cada cámara, es decir de


la cámara de arriba y la de abajo Aquiahuati, (2004) sin embargo en la práctica
realizada solo se contaron 5 cuadrados por lo que el porcentaje de error se
incrementará.

 Se pudo determinar el promedio de levaduras (Saccharomyces cerevisiae) contadas


en las 25 celdas, por el método de conteo directo, usando la cámara de Neubauer, que
es un método eficaz para el conteo de dichas levaduras.

VII. RECOMENDACIONES

 Se recomienda calibrar bien el microscopio, con la finalidad de poder observar de


manera más clara las levaduras, de esta forma facilitaremos el conteo de las células.

 Se debe agitar la dilución a emplear (10-1), de manera homogénea para que esta se
encuentra debidamente preparada y ser llevada adecuadamente a la lámina
portaobjetos.

 Verificar que mediante el uso de la pipeta que se pueda hacer un correcto llenado de
la muestra en la cámara de Neubauer.

 Mirar en el microscopio y contabilizar bien las células, las cuales no se tomarán las
células que estén la parte derecha del cuadro ni las de la parte inferior del mismo
cuadro, ya que ellas formaran parte del siguiente cuadro.

 Una inadecuada distribución de la muestra sobre la superficie del portaobjetos puede


ocasionar serios errores.
VIII. CUESTIONARIO

1. Indique que otros métodos existen para el recuento de microorganismos o


biomasa.
Métodos directos de determinación de biomasa:
 Métodos gravimétricos (Peso Seco)
 Métodos espectrofotométricos.
 Métodos microscópicos de recuento celular en cámaras
 Métodos microscópicos mediante epifluorescencia
 Métodos de siembra
Métodos indirectos de determinación de biomasa:
 Componentes celulares.
 Métodos bioquímicos.
 Métodos cinéticos.
 Métodos en continuo.

2. Explique para que se utilizan los métodos de recuento de microorganismos


en los alimentos y en los procesos alimentarios.
La determinación de métodos de recuento de microorganismos es muy importante
ya que su determinación nos lleva a la comprensión de la eficiencia del mismo.
Los métodos de recuento de microorganismos se realiza para así poder determinar
la carga microbiológica presente en la muestra de alimento, ya sea este
beneficioso o dañino todo ello de acorde a las normas técnicas y a el tipo de
microorganismo y cantidad máxima que debe poseer.
Dentro de ello es importante determinar la biomasa del producto el cual trata de
una variable clave para establecer las tasas de producción, consumo de nutrientes
y el cálculo de los balances de masa de cualquier proceso biológico. Los métodos
clásicos de determinación de biomasa son métodos directos que se basan en el
número de células o en el peso celular.

3. Cuáles son las causas más comunes de los errores para la cuantificación de
la biomasa utilizando la cámara de Neubauer.

ERROR EN LA ADQUISICIÓN DE LA MUESTRA.


“La muestra no es la población” Normalmente, se extrae una cantidad reducida
de una muestra original para realizar el conteo. Esta muestra tendrá una
concentración diferente que la de la muestra original. Y es a partir de aquí, donde
se pipetea a la cámara de recuento.
ERROR POR CARGA INCORRECTA DE LA CÁMARA DE NEUBAUER.
Es bastante común cargar la cámara de Neubauer con una cantidad de muestra
ligeramente superior o inferior a 10 microlitros. En el primer caso, el cubreobjetos
se levanta ligeramente para alojar el exceso de líquido ; en el segundo caso, la
cámara alojará menos de 10 microlitos introduciendo un error. Nuestra estimación
es que este error no supera el 3-5%.
ERROR ESTADÍSTICO.
Este error se produce al intentar aproximar una población (muestra original) con
una muestra de dicha población demasiado pequeña (volumen de recuento). La
mayoría de técnicos de laboratorio utilizan 4 ó 5 recuadros de la cámara de
recuento, independientemente de la concentración.
Este error alcanza frecuentemente el 20-30%.
ERROR EN LA DISTRIBUCIÓN DE LAS CÉLULAS EN LA CÁMARA.
En algunas ocasiones, la muestra no se distribuye de forma regular en la cámara
de recuento, debido a inclinaciones de esta o a su manipulación
ERRORES HUMANOS.
Existen varios tipos de errores que son provocados por la persona que realiza el
recuento, directa o indirectamente:
Mala visualización de la muestra. Si la persona que tiene que realizar el conteo
no visualiza correctamente la muestra, puede dejar de contar células, o contar
artefactos confundiéndolos con células
Dejar de contar células que están en otro plano. Si la persona que tiene que
realizar el conteo no visualiza correctamente la muestra, puede dejar de contar
células, o contar artefactos confundiéndolos con células
Perder la cuenta / confusión al contar. Si la persona que realiza el recuento
pierde la cuenta, deberá recomenzar.
Error en la aplicación de la fórmula. Si la fórmula de recuento se aplica mal o
se aplica la fórmula incorrecta, se obtendrán resultados erróneos. Esta es una de
las principales fuentes de error y de confusión al realizar recuentos celulares.
Error de recuento en los bordes. Si la persona que realiza el recuento celular no
toma las buenas decisiones a la hora de considerar una célula dentro o fuera del
conteo. Se estima que este error es muy bajo, menor del 1%.
Error de diferentes criterios de conteo en los bordes. Si la persona que realiza
el recuento celular no toma las buenas decisiones a la hora de considerar una
célula dentro o fuera del conteo. Se estima que este error es muy bajo, menor del
1%.
Error de diferentes criterios de conteo de células y definición de artefactos.
Si la persona que realiza el recuento celular no toma siempre las mismas
decisiones a la hora de considerar agregados, o artefactos se producirá un sesgo
en los resultados. Se estima que este error es significativo, pudiendo alcanzar más
del 10% y afectando a la reproductibilidad de los procesos de laboratorio.
ERROR EN LA DILUCIÓN
Cualquier error en la medida de líquidos al realizar una dilución, se trasladará
como un error en la concentración de la muestra diluida.
ERROR EN SIEMBRA DE CÉLULAS MUERTAS Y APOPTÓTICAS.
A la hora de sembrar células, es necesario saber el porcentaje de células muertas
y vivas (viabilidad). Si solamente contamos la totalidad, estamos introduciendo
un error proporcional a la viabilidad celular de nuestra muestra. Solamente
crecerán las células vivas.
ERROR DE CONTEO DEBIDO A AGREGADOS
Bajo ciertas circunstancias, algunos tipos de células se agregan (apelotonan),
dificultando o imposibilitando en algunos casos el recuento. Los citómetros de
flujo son especialmente problemáticos cuando se trata de agregados, ya que un
grupo de varias células será contado como una sola célula, y en algunos casos
como ninguna. Este error se estima que puede llegar a alcanzar el 20-30%, o
incluso más.

4. Cuáles son las ventajas y desventajas del método ejecutado en la práctica.

Ventajas:
 Rápido Exacto Barato Fácil
Desventajas:
 No se puede distinguir las células vivas y muertas Partículas
similares también se cuentan
IX. BIBLIOGRAFIA

 Arnáiz, Isac, & Lebrato. (2000). Determinación de la Biomasa en procesos


Biológicos. Sevilla - España.

 Madigan. (1998). Biología de los Microorganismos. En Madigan, Biología de los


Microorganismos (págs. 155-156). España: Prentice Hall.

 Unam. (1986). Biología Celular. En Unam, Manual de prácticas (págs. 20-28).


Mexico.

 Valencia. (2001). Manual de prácticas de Microbiología Básica. En Valencia, Manual


de prácticas de Microbiología Básica. Colombia.

 https://es.scribd.com/document/63629164/CUESTIONARIO-TURBIDIMETRIA

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