 Agar Citrato de Simmons

Fundamento
El Agar Citrato de Simmons es un medio diferencial utilizado para el estudio de bacilos
Gram negativos, sobre la base de la utilización del Citrato como una fuente de
carbono, y la utilización de sales de amonio inorgánico como única fuente de
nitrógeno. Estas reacciones metabólicas son dependientes del aporte oxígeno.
El sulfato de magnesio aporta cofactor magnesio para las diversas reacciones
enzimáticas, en tanto que el fosfato di potásico actúa como agente tamponante.
Los cambios en el pH se verifican gracias al contenido de azul de bromotimol.
El cloruro de sodio contribuye al equilibrio osmótico del medio de cultivo. El agar actúa
como agente gelificante
Uso
Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias en base a la capacidad de
usar citrato como única fuente de carbono y energía.

Control de Calidad
Resultados esperados tras 24 horas de cultivo a 35 °C-37°C.
Desarrollo de la prueba
Preparación del medio (Agar citrato de Simmons):
- En un matraz Erlenmeyer medir 100 ml de agua purificada y agregar 2.24g del
medio
- Poner tapón de algodón envuelto en gasa y dejar rehidratar por 15 minutos
- Calentar hasta su punto de ebullición sin dejar de agitar.
- Dejar enfriar sin solidificación
- Depositar 3ml del medio en un tubo de ensayo
- Meter a la autoclave a 121°C durante 15 minutos.
- Dejar que el medio solidifique en posición inclinada.
Muestras a cultivar:
Cepas aisladas de bacilos Gram negativos, que deban ser sometidas a pruebas de
identificación.
Inoculación:
Antes de realizar la siembra, permitir que el medio de cultivo alcance la temperatura
ambiente. Sembrar las muestras mediante estría en la superficie tendida. Realizar la
siembra bajo condiciones asépticas (uso de mechero y campana de bio seguridad). La
utilización del citrato requiere de oxígeno, incube con la tapa suelta.
Incubación:
Incubar por 24 a 48 horas entre 35º y 37ºC . Algunas cepas pueden requerir mayor
tiempo de incubación.
Interpretación de los resultados:
- positivo: crecimiento bacteriano con un intenso color azul en el pico de flauta.
- negativo: ausencia de crecimiento y permanencia del color verde del medio de cultivo.
 Prueba de la Urea
Fundamento
En el medio de cultivo, la tripteína y la glucosa, aportan los nutrientes para el desarrollo
de microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el rojo de fenol es
el indicador de pH. El agar es el agente solidificante.
Las bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa liberan amoníaco y dióxido de
carbono. Estos productos alcalinizan el medio de cultivo haciendo virar el indicador rojo de
fenol del color amarillo al rojo.
Es recomendado especialmente para la detección de la actividad ureásica en bacterias que
hidrolizan lentamente la urea ya que la fermentación de la glucosa presente activa la
enzima ureasa microbiana. Este es el caso de Klebsiella spp. Enterobacter spp y
Citrobacter spp.
Uso
Medio utilizado para diferenciar microorganismos en base a la actividad ureásica.
Se utiliza para identificar bacterias que hidrolizan urea, tales como Proteus spp. otras
enterobacterias y estafilococos.
Control de Calidad
Resultados esperados tras 24 horas de cultivo a 35 °C-37°C.

Desarrollo de la prueba
Preparación del medio Urea
- Colocar 3.8g del medio en 100ml de agua destilada
- Reposar de 10 a 15 minutos
- Luego de diluirse se pasa a esterilizar por filtración
- Distribuir en tubos de ensayo de 1 a 3 ml
- Dejar solidificar el medio en pico de flauta con fondo profundo.

Inoculación:
A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, estriar la superficie del medio
en el pico de flauta.
Se recomienda no punzar la capa profunda para controlar el color.
Incubación:
Incubar por 24 a 48 horas entre 35º y 37ºC . Algunas cepas pueden requerir mayor
tiempo de incubación.

Interpretación de los resultados:

- Microorganismos que hidrolizan la urea: el medio de cultivo es de color rosado-rojizo.

- Microorganismos que no hidrolizan la urea: el medio de cultivo permanece de color
amarillo.

 Medio M.I.O. (Motilidad – Indol – Ornitina)

Fundamento
Es un medio de cultivo ampliamente utilizado para la diferenciación de bacilos Gram
negativos entéricos, sobre la base de la producción de Indol, la actividad de la enzima
Ornitina decarboxilasa y la capacidad de motilidad.
Las peptonas y el extracto de levadura aportan aminoácidos y nutrientes esenciales, la
dextrosa constituye una fuente de energía. El agar actúa como agente gelificante.
Los cambios en el pH se verifican gracias al contenido de púrpura de bromocresol, la
actividad de la ornitina decarboxilasa se observa como un viraje hacia el color púrpura,
en tanto que la ausencia de la enzima produce un viraje hacia el color amarillo. La
motilidad se observa como un desplazamiento del desarrollo microbiano desde el
inóculo.
La producción de Indol se verifica mediante la adición de algunas gotas de Reactivo de
Kovacs en la superficie del medio de cultivo, la producción de un compuesto color rojo
fucsia es considerada como Indol positivo.

Uso
Medio utilizado en la identificación de miembros de la familia Enterobacteriaceae en base a la
movilidad, producción de indol y actividad enzimática ornitina decarboxilasa.

Control de Calidad
Resultados esperados tras 24 horas de cultivo a 35 °C-37°C.

Desarrollo de la prueba
Preparación del medio M.I.O
- En un matraz Erlenmeyer medir 100 ml de agua purificada y agregar 3.1g del medio
- Calentar el medio agitando suavemente
- Llevar a ebullición hasta completa disolución.
- Depositar 3ml del medio en un tubo de ensayo
- Meter al autoclave a 121°C durante 15 minutos.
- Dejar que el medio solidifique en posición vertical

Muestras a cultivar:
Cepas aisladas de bacilos Gram negativos (enterobacterias), que deban ser sometidas
a pruebas de identificación, específicamente producción de Indol, motilidad y ornitina
decarboxilasa.
Inoculación:
Antes de realizar la siembra, permitir que el medio de cultivo alcance la temperatura
ambiente. Sembrar las muestras mediante una picadura vertical y profunda en el
centro del tubo.
Incubación:
Incubar por 24 a 48 horas entre 35º y 37ºC . Algunas cepas pueden requerir mayor
tiempo de incubación.
Interpretación de los resultados:
Una vez completado el período de incubación, observar el desarrollo microbiano a lo
largo de la picadura de inoculación, y el viraje de pH por alcalinización (púrpura) o
acidificación (amarillo). Observe motilidad y actividad de la ornitina decarboxilasa, y
luego realice la prueba del Indol. Compare los resultados de acuerdo a los siguientes
patrones:
1.- Motilidad
- Resultado positivo: presencia de desarrollo microbiano que se observa como
enturbiamiento del medio de cultivo en todo el tubo, o desplazado fuera de la picadura
de inoculación.
-Resultado negativo: el desarrollo microbiano esta restringido solo en el trayecto de la
picadura de inoculación.
2.- Ornitina decarboxilasa:
- Resultado positivo: se verifica como alcalinización del medio de cultivo con un viraje
hacia el púrpura.
-Resultado negativo: se observa acidificación con viraje hacia el amarillo o no se
observan cambios significativos en el pH.
3.- Producción de Indol: Agregue 3 a 4 gotas de Reactivo de Kovacs sobre la
superficie del medio de cultivo y agite cuidadosamente.
-Resultado positivo: producción de un compuesto de color rojo fucsia. Cualquier indicio
de color es considerado positivo.
-Resultado negativo: ausencia de color rojo fucsia.

Bibliografía:
- Laboratorio Britania(2012) Simmons Citrato Agar Recuperado
http://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_5a29779bd2be8.pdf
- Valtek Diagnostic(2016) Agar Citrato de Simmons Recueprado
http://andinamedica.com.pe/wp-content/uploads/2016/08/Medio-Citrato-Simmons.pdf
- Laboratorio Britania(2012) MIO Medio Recuperado
http://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_5a2832fb81126.pdf
- Valtek Diagnostic(2016) Medio MIO Recuperado
http://andinamedica.com.pe/wp-content/uploads/2016/08/Medio-MIO.pdf
- Susana Gonzales (2013) Pruebas Bioquimicas para Enterobacterias Recuperado
https://es.slideshare.net/SusanaGG/pruebas-bioqumicas