5.

USO DE MARCADORES MOLECULARES:

A). PARA EVALUAR LA VARIABILIDAD GENÉTICA:

El término diversidad genética se refiere a qué tantas formas diferentes de

expresión del genotipo existen (variaciones en constitución genética) y qué tan
separadas están unas de otras. Se reconocen depósitos de esta información en forma
de genes, alelos, cromosomas y su expresión en poblaciones y especies.

Los marcadores moleculares, entre los que se incluyen los RAPD

(Polimorfismo del ADN Amplificado al Azar) constituyen una herramienta útil para
el estudio de la diversidad genética entre especies de Capsicum con fines
mejoradores, debido a que son una técnica poderosa para la identificación de
variaciones en la secuencia de ADN entre individuos (Gonzáles Ivonne, 2011).

La mayoría de los estudios realizados sobre diversidad del género Capsicum

se basan en la evaluación de entre cuarenta y cincuenta caracteres morfológicos.
Con la llegada de las sofisticadas técnicas de biología molecular para la
determinación de la variabilidad y caracterización genética aplicada a especies
animales y vegetales, se establece una nueva perspectiva sobre el estudio de la
biodiversidad (Acuña-Aguayo).

En el trabajo titulado “EVALUACIÓN DE MARCADORES

MOLECULARES PARA LA MEDICION DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DE
Capsicum annum L. DEL BANCO DE GERMOPLASMA DEL INIFAP-
ZACATECAS”; de las 480 accesiones de Capsicum annuum con las que cuenta el
banco de germoplasma, se seleccionaron 100 de importancia económica y
agronómica para los estados de la República Mexicana que son productores de chile
para secado. Se incluyeron colecciones de los estados de San Luis Potosí,
Chihuahua y Zacatecas. Dentro de estas colecciones se incluyen variedades como
chile mirasol, puya, pasilla, ancho, jalapeño, serrano y mulato (Acuña-Aguayo).

Para el proceso de germinación y extracción de ADN, se utilizaron 52

semillas de cada accesión, las cuales fueron germinadas en charolas con sustrato
estéril de una mezcla de peat moss y vermiculita, en el mes de febrero de 2013 bajo
condiciones de invernadero a una temperatura de 30 ± 2 °C. Al llegar a la etapa de
plántula, se tomaron las dos primeras hojas verdaderas de 10 plantas de cada
accesión como representante poblacional de esta, para la extracción de ADN con el
método de modificaciones (Dellaporta S. L., 1983).

En el análisis RAPDs, como una primera fase, se realizó un estudio

exploratorio con solo 24 accesiones, para comprobar la detección de polimorfismos
generados por ciertos RAPDs reportados en la literatura. De acuerdo con Baral y
Bosland (2002) y Fariando (2007); se propuso la serie de iniciadores mostrados en
la Tabla 1.

El volumen final para la mezcla de reacción de RAPD fue de 10 l con la

siguiente preparación: 1l de buffer 10X, 0.8 l de MgCl2 (50 mM), 0.2 l de
dNTPs (2mM), 0.4 l de primer, 0.15 l de Taq polimerasa, 6.05 de H2O destilada
y 1 l de DNA molde.

Se utilizó un termociclador (2720 Thermal Cycler, Applied Biosystems)

bajo las siguientes condiciones: desnaturalización del DNA a 94°C por 5 minutos,
y 40 ciclos de: desnaturalización a 94°C por 45 segundos, hibridación del primer a
35°C por 1 minuto, extensión a 72°C por 2 minutos; extensión final a 72°C por 5
minutos (modificado de Lopes, 2008).
 Los productos RAPD se visualizarán en un gel de agarosa al 2% con buffer
TAE 1 % teñido con bromuro de etidio (Farandio, 2007).

Finalmente se obtuvo la germinación y desarrollo de plántulas de 95

accesiones. Las 5 restantes fueron inviables, quizás debido a la longevidad de más
de 15 años que tenían estas accesiones, por lo que se descartaron del análisis.

La calidad de ADN obtenida de las 95 accesiones fue óptima. La Figura

muestra solo 24 extractos de ADN de accesiones de chile mirasol para el análisis
de RAPDs.

En un sondeo preliminar de 10 iniciadores (OPAS-01, OPR-06, OPAB-08,

OPA18, OPAA-11, OPAN-02, OPA-04, OPA-20, OPA-02, OPA-12) que
generaron alrededor de 48 bandas RAPDs de los cuales 21 se consideraron
polimórficas, con una tasa de polimorfismo de 2,04 polimorfismos por iniciador. El
número de bandas oscilo entre 3 a 18 productos RAPDs obtenidos y el tamaño de
las bandas varió de 250 a 1640pb. Se presentan solo los resultados de los iniciadores
con mayores polimorfismos
 Estos resultados preliminares sugieren que existe una relativa diversidad
genética de cultivares comerciales de chile del banco de germoplasma del INIFAP-
Zacatecas, lo cual significa que los cambios futuros en la estructura genética
podrían ser comparados in situ con las variedades locales de las que provienen las
accesiones evaluadas. Este estudio exploratorio, provee la justificación del
seguimiento de estudios concretados a enfocarla utilidad de los recursos genéticos
en los programas de mejoramiento del cultivo de chile (Acuña-Aguayo).

B). PARA SELECCIÓN ASISTIDA:

El método tradicional para el control de enfermedades consiste en frecuentes

aplicaciones de agroquímicos; sin embargo, la resistencia genética es el método más
deseable (Kim y Hartmann, 1985).

Una herramienta que se está utilizando es la selección asistida por

marcadores moleculares (MAS), la cual está incrementando su importancia en los
programas modernos de mejoramiento genético. La selección indirecta utiliza
métodos de genotipificado permitiendo la detección de los alelos y genotipos
deseables en etapas tempranas de las plantas y puede reducir o eliminar la necesidad
de ciclos de evaluación fenotípica (Dubcovsky, 2004), MAS es aún más valiosa
cuando los caracteres muestran recesividad, herencia poligénica o son difíciles o
imposibles de seleccionar directamente.
El trabajo titulado “IDENTIFICACIÓN DE FUENTES DE
RESISTENCIA A PUDRICIONES DE LA RAÍZ EN GERMOPLASMA DE
CHILE SERRANO (Capsicum annuum L.)”, tuvo por objetivo identificar fuentes
de resistencia a pudriciones de la raíz (P. capsici) en accesiones de chile serrano
que puedan ser utilizadas en programas de mejoramiento genético tradicional o
mediante selección asistida por marcadores moleculares de ADN (Reinaldo
Méndez Aguilar, 2015).

El trabajo de investigación se realizó de 2012 a 2013, en las instalaciones

del Campo Experimental Las Huastecas (CEHUAS), el cual forma parte del
Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias (INIFAP).

En esta investigación se incluyeron 142 accesiones de chile serrano

pertenecientes al Banco de Germoplasma de Chile del CEHUAS-INIFAP; las
cuales son procedentes de colectas de diferentes estados del país, y representan los
grupos raciales Rojo, Amarillo, Café y Anaranjado. Así también, se incluyeron dos
genotipos como testigo (SCM334, resistente y Mirasol, susceptible al hongo).

La extracción de ADN genómico se realizó de 2012 a 2013 en el Campo

Experimental Las Huastecas-INIFAP mediante el estuche comercial Wizard®
Genomic. Para ello se pesaron 80 mg de tejido de hojas jóvenes de 15 plantas de
cada accesión mismas que se maceraron en un mortero con adición de nitrógeno
líquido (-196 ºC), hasta formar un polvo fino. El polvo se transfirió a un tubo
Eppendorf de 1.5 mL que contenía 600 µL de buffer de lisis y se agitó en Vortex
por 3 s. La mezcla se incubó en baño maría a 65 ºC por 15 min. Transcurrido el
tiempo se agregó 3 µL de RNasa y se mezcló por inversión suave (cinco veces).

Las muestras se incubaron a 37 ºC por 15 min y se enfriaron por 5 min a una

temperatura de 17 ºC. Posteriormente, se agregaron 200 µL de la solución de
precipitación de proteínas y se agitaron en Vortex a alta velocidad por 20 s.
Enseguida, se centrifugaron por 5 min a 13 000 rpm en una microcentrífuga y
cuidadosamente se removió el sobrenadante que contenía el ADN y se colocaron
en un tubo Eppendorf de 1.5 mL con 600 µL de isopropanol a temperatura
ambiente, para precipitar el ADN. Inmediatamente se centrifugaron por 3 min a 13
000 rpm, se eliminó el sobrenadante, se lavaron con etanol al 70% y después se
centrifugaron por 3 min a 13 000 rpm. Finalmente, el ADN se re-suspendió en 80
µL de solución de rehidratación de DNA y se almacenaron a -20ºC. Este proceso
se realizó en 142 accesiones de chile serrano y los testigos (Reinaldo Méndez
Aguilar, 2015).

Se utilizó el marcador SCAR OpD04.717 asociado con la resistencia a

pudriciones de la raíz para determinar su presencia en el germoplasma de chile
(Quirin, 2005).
 Las 11 accesiones identificadas como resistentes en el presente estudio
tienen uso potencial como nuevas fuentes de resistencia al fitopatógeno en
programas de mejoramiento genético para la obtención de variedades/híbridos que
permitan disminuir las pérdidas de rendimiento causadas por P. capsici. A pesar que
estos materiales genéticos no amplificaron el marcador SCAR OpD04.717, pueden
ser utilizados para la búsqueda de otros marcadores asociados a genes que confieren
resistencia

La selección asistida por marcadores moleculares (MAS) ha sido propuesta

para facilitar el manejo de caracteres complejos como la resistencia a P. capsici en
combinación con análisis fenotípicos como una vía fácil para introgresar altos
niveles de resistencia al fitopatógeno en chile (Thabuis, 2004) o para seleccionar
genotipos resistentes. Es necesario evaluar nuevamente las 11 accesiones
sobresalientes para verificar la resistencia al hongo pero ahora bajo condiciones de
invernadero/cielo abierto y evaluar otros caracteres de interés como rendimiento,
precocidad, características de fruto (largo, diámetro, peso, color en madurez
comercial), entre otros, y obtener progenie de cada uno de los materiales genéticos
para realizar futuras investigaciones. El problema que se ha tenido en los programas
de mejoramiento genético de chile al introgresar la resistencia a P. capsici utilizando
como donador a SCM334 son las características desfavorables de fruto que este
genotipo tiene, y este problema puede ser resuelto con alguna(s) de las accesiones
identificadas
 Como resultados se obtuvo que el marcador SCAR OpD04.717 no permitió
la discriminación entre accesiones resistentes y susceptibles a P. capsici. Se
identificaron 11 accesiones de chile serrano con resistencia al hongo mediante
pruebas de reacción in vitro; de éstas, la accesión BGS41 mostró mayor porcentaje
de supervivencia (45.8%) a la cepa del patógeno en comparación al testigo
resistente SCM334 (20%). Existen accesiones de chile serrano con utilidad
potencial como nuevas fuentes de resistencia a pudriciones de la raíz causada por
P. capsici para programas de mejoramiento genético tradicional, pero no para
selección asistida por marcadores moleculares mediante OpD04.717 (Reinaldo
Méndez Aguilar, 2015).

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

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MOLECULARES PARA LA MEDICION DE LA. Actualidades y desafíos de la
Investigación en Recursos Bióticos de Zonas Áridas, 577-586.
 Akbar N, A. H. (2010). Estimation of genetic diversity in Capsicum germplasm
using Randomly Amplified Polymorphic DNA. . Asian J Agr Sci. , 53-56.
 Bahrami Rad M, H. M. (2009). EVALUATION OF GENETIC DIVERSITY IN
CAPSICUM SPP. AS REVEALED BY RAPD MARKERS. . ACTA HORT.
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 Baral, J., & Boslan, P. W. (2002). GENETIC DIVERSITY OF A CAPSICUM
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 Dellaporta S. L., T. W. (1983). A PLANT DNA MINIPREPARATION. Version II.
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 Fariando, D. (2007). CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LA
COLECCIÓN DE AJIES (CAPSICUM SPP) Y CALABAZAS.
 Gonzáles Ivonne, Y. A. (2011). VARIABILIDAD MOLECULAR DE
GENOTIPOS DE PIMIENTO (Capsicum annuum L.) DEL PROGRAMA DE
MEJORAMIENTO GENÉTICO PARA LA RESISTENCIA A PVY. SCIELO,
69-72.

 Quirin, E. A.; Ogundiwin, E. A.; Prince, J. P.; M. 2005. DEVELOPMENT OF

SEQUENCE CHARACTERIZED AMPLIFIED REGION (SCAR) PRIMERS
 FOR THE DETECTION OF PHYTO.5.2, A MAJOR QTL FOR RESISTANCE
TO PHYTOPHTHORA CAPSICI LEON. IN PEPPER. Theor. Appl. Genet. 110:
605-612.

 Reinaldo Méndez Aguilar, R. R. (2015). IDENTIFICACIÓN DE FUENTES DE

RESISTENCIA A PUDRIIONES DE LA RAÍZ. Revista Mexicana de Ciencias
Agrícolas , 1507-1518.