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All content following this page was uploaded by Ruth Marina García García on 30 June 2016.
INTRODUCCIÓN
La variación genética es un componente esencial de la biodiversidad y su es-
tudio se reconoce como una parte muy importante para salvaguardar el futuro
evolutivo y de programas de conservación de las especies [1]. Por lo tanto, para
que estos programas sean efectivos, deben considerar la variación genética de las
especies, su distribución y los impactos potenciales de la actividad humana sobre
su habitas natural. Aunque la utilización de técnicas de genética molecular es im-
portante a la hora de establecer programas de conservación, éstas por si solas no
proveen una respuesta final para la conservación de las especies; son una herra-
mienta adicional primordial, que pueden ser utilizadas como ayuda al fijar prio-
ridades para la conservación, particularmente cuando hay limitada información
ecológica [2]. Los análisis genéticos tienen como objetivo determinar la diversi-
dad a varios niveles (individual, poblacional o de especie) y pueden ser más efec-
tivos cuando se emplean en conjunto con datos ecológicos y demográfico [3].
Un acercamiento combinado es también benéfico porque los métodos tradi-
cionales de campo producen poca información respecto a la estructura de la po-
blación y el estatus de las especies más crípticas, acuáticas y subterráneas. Los
problemas de estas especies serian irreconocibles sin los estudios genéticos, aun-
que éstos no proveen información sobre varios aspectos biológicos como la tasa
de crecimiento, la dieta, la longevidad y la fecundidad. Por lo tanto, para obtener
toda la información necesaria acerca de una población o especie, es importante
gránulos del chelex. Este enlaza los iones de Mg, los cuales las nucleasas necesitan
para digerir el ADN, protegiendo así que el ADN no sea digerido por la contami-
nación de las nucleasas en las células [25].
El método de extracción de ADN con fenol-cloroformo es un proceso labo-
rioso y complicado. Esta técnica de extracción es larga, costosa y poco practica,
especialmente cuando se tiene un gran número de muestras. En el presente estu-
dio se realizó una comparación del método de extracción con fenol cloroformo y
dos diferentes técnicas basadas en el uso de resina Chelex-100. El método con
esta resina es un procedimiento simple, rápido y sobre todo no requiere de múlti-
ples pasos. Se analizó la extracción de ADN procedente de varias clases de tejidos
como cáscara de huevo, contenido del huevo, tejido de caparazón y cordón umbi-
lical, en los cuales se utilizaron los diferentes métodos de extracción como la pre-
cipitación con solventes orgánicos y con resina de Chelex-100. Los resultados
demuestran que el Chelex es un método eficaz en la extracción de ADN en los
diferentes tejidos de la especie. Algunos de los protocolos utilizados a través de la
investigación se modificaron hasta obtener óptimos resultados.
MATERIAL Y MÉTODOS
La obtención del ADN nuclear de las tortugas madres adultas se realizó a
partir de la cáscara de huevo ya eclosionados o huevos no fertilizados. Las mues-
tras de cáscara de huevo se sometieron a tratamiento con EDTA al 0.5 M por una
noche a temperatura ambiente, con el fin de remover las endonucleasas que de-
gradan el ADN. Posteriormente las muestras fueron maceradas hasta formar un
polvo casi homogéneo, para el cual se aplicó la metodología previamente descrita
con algunas modificaciones (K. Moore, comunicación personal).
Las muestras de los neonatos se obtuvieron después de la eclosión. Se toma-
ron cuidadosamente dos milímetros del caparazón por medio de una biopsia. En
esta etapa del desarrollo el caparazón es blando y sana rápidamente, por lo cual
no se pone en riesgo la supervivencia de la tortuga; además es más seguro para
las crías que tomar muestras de sangre siguiendo la metodología descrita y reco-
mendada por K. Moore. A una de las crías recién eclosionadas se le tomó una
muestra de saco vitelino, para conocer la viabilidad de este tejido en estudios mo-
leculares. Las muestras se guardaron en tubos Eppendorf previamente esteriliza-
dos, con alcohol al 95 %. Posteriormente se almacenaron a -20ºC; exceptuando la
cáscara de huevo, la cual fue bien lavada y congelada. El corte, procesamiento y
extracción del ADN de las muestras se realizó aplicando diferentes metodologías,
las cuales se describen a continuación.
Método A
Método B
Método C
Método D
PCR
F: 5’TGCATTGCTTGACCAATTAGTGAG3’, R: 5’ACATGTATAGTTGAGGAG
CA 3’, R: 5’TAGTACGTCTGGCCTGACTTTC3’.
Electroforesis
RESULTADOS
5%) realizado al cordón umbilical (pocillo 13). Sin embargo estas muestras dieron
positivo al realizar su reamplificación (pocillo 14 y 15 respectivamente).
Los métodos que dieron resultados positivos a la primera amplificación fue-
ron el C realizado en muestras de cáscara entera sin macerar (pocillo 11) y de teji-
do caparazón (pocillo 12) y el método D realizado en tejido cáscara sin macerar
(pocillo 10) Ver tabla y figura 1.
Estandarización de la PCR
DISCUSIÓN
Las extracciones con fenol, cloroformo, alcohol isoamílico y cloroformo al-
cohol isoamílico aunque han sido utilizadas con éxito en otros estudios5, en el
presente los resultados fueron negativos. Una de las razones por las cuales estos
protocolos no funcionaron podría ser que para garantizar la extracción se debe
tener una muestra de tejido más grande [32]. Esto es una dificultad para el tipo
de muestras que se manejan en el presente estudio, ya que para las especies en
cuestión las crías miden aproximadamente 6 cm y no se les pueden realizar biop-
sias muy grandes debido a que se pone en riesgo su supervivencia. Según K Moo-
re, no se deben tomar muestras con un tamaño mayor de 3 mm, esto con el objeto
de no causarse lesiones al animal que pueda ponerlo en peligro [5]. Además este
método es largo y tedioso especialmente cuando se trabaja con un número gran-
de de muestras. También el costo de los reactivos es elevado en comparación con
el chelex 100 [32]. Por último, el estado y la pureza de los reactivos deben ser ópti-
mos, para asegurar un buen resultado.
Los diferentes protocolos realizados con chelex fueron efectivos. Se hallaron
muchos beneficios: aun en pequeñas muestras de tejido el chelex funciona bien
corroborando lo encontrado por García González [32] en un estudio hecho en
carcinomas de cabeza y cuello. También encontramos que son mucho más fáciles,
cortos y requieren pocos reactivos adicionales. Además de ser económicos, tam-
bién son menos riesgosos para la salud del investigador. Extracciones que se pen-
saba eran negativas por los resultados de la amplificación, se comprobó por
medio de su reamplificación que había ADN pero en muy pocas cantidades para
ser observado en la electroforesis. Aumentando la cantidad de PCR mix y de
ADN templado se solucionó y estandarizó la amplificación de las muestras.
Uno de los objetivos de este estudio fue comparar la eficacia de los métodos
de extracción de ADN utilizando resina Chelex-100 con el procedimiento clásico
de precipitación con solventes orgánicos. La resina Chelex-100 actúa como una
resina quelante de iones metálicos polivalentes, iones que actúan como cataliza-
dores en la ruptura de ADN a altas temperaturas las cuales pueden inhibir la PCR
[33]. Estudios previos muestran que el uso de la resina Chelex sin proteinasa K
proporciona una adecuada cantidad de ADN para amplificar [22]. Sin embargo,
estos estudios también indican algunos límites considerando el tamaño de los
productos que pueden ser amplificados. Se podrían amplificar fragmentos de
hasta 650 pb en muestras tratadas sólo con la resina Chelex-100, y fragmentos de
hasta 1000 pb en las que se ha utilizado la resina y digestión con proteinasa K. To-
dos los fragmentos de ADN que se amplificaron en este trabajo tienen un tamaño
máximo de 400 pb, por lo que la aplicación de los métodos basados en la resina
Chelex-100 no presenta esta dificultad técnica. Algunos estudios han puesto de
manifiesto un descenso en la amplificación de fragmentos mayores de 600 pb
cuando se utilizan muestras almacenadas con proteinasa K, quizás debido a una
mayor ruptura del ADN [34].
Algunas recomendaciones en el manejo del Chelex son las siguientes: pre-
parar la solución de Chelex en el momento de la extracción; para pesar el Chelex
y su manipulación debe usarse papel estéril, guantes, tapa boca, gorro, bata y no
usar espátula; la extracción debe hacerse frente a un mechero cuando no se tiene
una cabina de flujo adecuada, siempre resuspender la solución de chelex cada vez
antes de usarse. Al tomar el sobrenadante, tener mucho cuidado para no tomar
partículas de Chelex que son inhibidoras de la Taq polimerasa durante la amplifi-
cación. A veces la amplificación de las extracciones debe realizarse el mismo día,
pero a veces hay que esperar por una noche, debe encontrarse el mejor método
para la muestra estudiada. En este estudio se encontró que las muestras amplifi-
can mejor cuando la PCR se hace el mismo día de la extracción. Las amplificacio-
nes realizadas de extracciones con Chelex pueden llevar hasta la mitad del
volumen de PCR mix en ADN templado. Debido al tipo y cantidad de muestra, el
ADN extraído puede ser poco. Se recomienda probar con diferentes cantidades
de ADN templado en la PCR mix hasta encontrar la adecuada. En esta investiga-
ción fueron suficientes 10 µl de ADN templado para un volumen final de PCR
mix de 30 µl.
CONCLUSIONES
Se ha comprobado que para la utilización de resina Chelex-100 se precisan
menores cantidades de tejido, lo cual generalmente no es posible cuando se pro-
cesan las muestras con el método de fenol, cloroformo, alcohol isoamílico. Ade-
más, lo dispendioso de este ultimo proceso mencionado y los múltiples pasos
hacen que este protocolo no sea adecuado para su aplicación rutinaria y simul-
tánea con una cantidad grande de muestras. Atendiendo a los hallazgos obteni-
dos hemos encontrado que los diferentes protocolos de chelex 100 son más efec-
tivos para estos tipos de muestras.
Para la realización de la determinación de paternidad múltiple en tortugas
marinas, son más viables los tejidos de cáscara de huevo, para hallar el genotipo
materno, y tejido de caparazón, para el de las crías. No solo por el éxito obtenido
en su extracción y amplificación, si no además por la facilidad de toma de mues-
tra, viabilidad de encontrar y poco daño producido a la especie.
AGRADECIMIENTOS
Esta investigación se realizó gracias al apoyo financiero de la Universidad
del Atlántico, convocatoria: Pensar el Caribe II y al Departamento de Investiga-
ción de la Universidad de la Guajira.
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