4, TEORIA DEL QUIMIOSTATO SIMPLE 4.1, Antecedentes E! cuttvo por lotes ofrece como principal caracterstica su simpleza, tanto desde el punto de vista del equipo necesario como de su operacién. Al mismo tiempo esa modalidad de cultivo presenta limitaciones, como la falta de control sobre diversos pardmetros ciel cultivo y el hecho {Que las células se desarrollan en un estado fisiolSgico poco definido y cambiante. ‘La modalidad de cultivo continuo supera las deficiencias del cultivo por jotes unto a su alla productividad volumétrica, la caracteristica més saliente del culivo continuo 8 su gran fiexiblidad que posibiita una amplia gama de aplicaciones muy diversas. Al res- ecto es interesante notar que la teoria del cutivo continuo fue publicada por primera vez en forma casi simulténea por dos grupos de investigadores independientes que trabajaban en temas muy distintos: cinética de crecimiento (Monod, 1950) y mutaciones esponténeas y selec: ‘clon de mutantes (Novick y Szilard, 1950). 42. Sistemas Continuos de Cultivo Las fermentaciones continuas pueden realizarse en diversos equipos y bajo sistemas de control de la operacion. La Tabla 1 entrega un resumen de las diversas opciones. ‘Los distintos tipos de fermentadores tienen las mismas caracteristicas y comportamiento general que los correspondientes reactores quimicos, sdlo que parcialmente modificadas y complicadas por la presencia de materia viva TABLA 12 Equipos y modalidades de operacin en culivo continuo Tipo de fermentador. ‘Tanque agitado Tubular vo piston (apn) Columna: tbo de taje (ait) reliena platos (Cheulnclén (loop) Modalitad de operacién ‘Quimostato simple de una etapa Quimiosteto mutietapa Cuimiostato con reireulacion de cblulas ‘Quimiostato con recirculacién de liquide (Quimiostato con retencion de células Turbidostate pH estat ‘ODestato Auxostato Owes 23El tanque agitado es el fermentador continuo mas ampliamente empleado por su versatili- dad, simpleza y costo. Su concepcidén tedrica implica una perfecta homogeneidad de su conte- nido, porlo que la composicidn de salida es la misma del fermentador: pa este hecho se deri- van upon antes conclusiones, como por sere q is cé Ss estal odo ento El fermentador de flujo piston es una idealizaci6n que puede ser aproximada en mayor oO menor grado en equipos de una alta raz6n longitud a didmetro y con altas velocidades lineales de flujo. El intercambio de gases tipico de la mayoria de las fermentaciones dificulta el logro de un comportamiento de este tipo. El fermentador tubular de flujo pistén tiene un comportamiento del todo similar a un tanque agitado operado sin limitacién de nutrientes, como es el caso del cultivo por lotes, donde la sucesién de acontecimientos respecto al tiempo se reemplaza por los diversos estados a lo largo del fermentador tubular. kos equipos de columna tienen diversas caracteristicas que los hacen aptos para aplicacio- nes especificas: altas»velocidades de transferencia de oxigeno (air-lift), posibilidad de creci- -miento microbiano en peliculas superficiales (rellenas), sustrato insoluble (rellenas), incorpora- (platos) y otras. En la configuracién de circulacién se obtiene un buen mezclamiento y adecuados coefi- cientes de transferencia haciendo circular el caldo a alta velocidad por un circuito cerrado (loop). Tal vez su uso mas extendido sea en forma de canales en el tratamiento aerobio de efluen- tes liquidos y enel cultivo de microalgas. puede presen- po tema de cultivo mas usado. En el turbidostato el control se ejerce regulando la velocidad de flujo de acuerdo a la turbi- dez del caldo, equivalente a la concentracién celular. Esta modalidad requiere un equipo mas complejo, pero presenta algunas ventajas sobre el quimiostato, en especial respecto a la opera- cién a velocidades de flujo altas. Es posible operar también un fermentador continuo controlando otros parametros, como son el pH 0 la concentracién de oxigeno disuelto. Estas técnicas de operacién presentan ven- tajas atractivas en determinados casos y su implementacion se facilita significativamente con la utilizacion de sistemas de adquisicién de datos y control con computador en linea. 4.3. Descripcion Cuantitativa El tratamiento cuantitativo del quimiostato simple de una etapa se basa en la aplicacién de balances de masa y ecuaciones cinéticas, junto a un cierto numero de suposiciones y restriccio- nes que es necesario tener presentes al momento de aplicar las ecuaciones resultantes a un sistema real. La Figura 8 muestra un esquema de un quimiostato, con sus corrientes de entrada y salida y la nomencliatura correspondiente. En el esquema no aparecen las corrientes gaseosas, lo qué constituye una primera restriccién: no hay alimentacién de nutrientes en la fase gas. Una supo- sicién importante es que el fermentador sea perfectamente agitado, de modo que la composi- cién del efluente sea la misma que la del fermentador, que a su vez se supone completamente homogéneo. 24Fig. 8. Esquema del quimiostato simple de una etapa A continuacién se plantean los balances de células, nutriente limitante y producto de acuerdo a la ecuacién general: (35) Para saber cuantas ecuaciones independientes son necesarias para describir totalmente el comportamiento del sistema, se debe saber cuales son las incégnitas: X, S, y P. Se conside- raré que durante una operacién no varian los valores de X,, F, Ve Y,, Y Estrictamente el rendi- miento es funcién de ~~ y de considerarse necesario se puede inciulf esta dependencia (ecua- ciones 17 y 24). X pusras Balance de células Variagidn = entrades — salida? 4 produce? — con sur ve oak = FX - FX + KV — DP i nome’ 6) nS E 5 P Bian Dado que se operara a volumen constante OX ar Gt = Wy %o- X) + UX (37) Se define D, velocidad de dilucién: : Yo=0 1 2 pe £ (FYI) _ veloeited, fc) or => —= Vv NIP de djlouor - —S \ troaudD Qlimentoad? Sn ell : Con Gye ole a NQ-a sislenn: Se debe notar que D es el valor reciproco del tiempo de residencia en el fermentador, si la densidad del liquido es constante. Si establecemos que la alimentacién es estéril, entonces X, = Oy 25BAale US MUI ine dS_ " ux ar = ~OS) = (40) Balance de producto Si no hay producto en la alimentaci6n, dP aoe DP + Q, (41) Se han planteado 3 ecuaciones y se tienen 4 variables, por lo que se requiere una ecuacion mas. Cualquier otro balance (nutriente no limitante, protones, oxigeno disuelto, etc.) introduciria una nueva variable, por lo que no resulta de utilidad. Para completar la descripcién del quimiostato se recurre a una expresi6n cinética del tipo: pn = f(S,l) (42) En el caso mas simple, en ausencia de inhibicion, se utiliza la ecuacion de Monod (Ec. 6). Las ecuaciones (19), (40), (41), (42) 0 (6) describen el comportamiento de! quimiostato ope- rado bajo cualquier régimen. Sin embargo, en la mayoria de las ocasiones el interés esta cen- trado en la operacién en régimen o estado estacionario. Este estado se caracteriza porque el valor de todas las variables permanece constante respecto al tiempo, lo que equivale a estable- cer que todas las derivadas respecto al tiempo se hacen cero. Por tanto, en régimen estacionario la ecuacién (39) se reduce a: wX = DX 43) nh=D be (44) Veloaidad \ 16 . Veloudadde = YC 4 De la ecuacién (40) Ceuenert® rae x = tm? js, -5) (45) Introduciendo (44) en (45): X = Yyxp (S, -S) (46) De la ecuacion (41): Q, = OP (47) El sistema de ecuaciones algebraicas (6), (44), (46) y (47), representan la operacién del qui- miostato en estado estacionario. Se debe notar que si el cultivo no produce un producto P, las ecuaciones (41) y (47) no rigen, pero el resto de las ecuaciones no se ven afectadas. La solucién del sistema de ecuaciones es: pe=aD (44) 26S =——s— -— hiferod. (48) o> ie es By > \ P=—+ 2 ©) En la Figura 9 se representa el comportamiento de X,S yQ, (Q, =X = DX) en funciodn de D. Qy = % CONCENTRACION PRODUCTIVIDAD i Dorit i VELOCIDAD DE DILUCION Fig. 9. Perfiles caracteristicos de un quimiostato simple de una etapa en funcién de la velocidad de diluci6n. Es interesante analizar el significado fisico y fisiologico de las ecuaciones, ya que de él sur- gen las propiedades y caracteristicas de esta modelidad de cultivo. A diferencia de lo que ocu- rre en cultivo por lotes, en el quimiostato el valor de ~ puede ser variado a voluntad, entre cier- tos rangos, por el simple expediente de modificar la velocidad de dilucién, normalmente mani- pulando F. La igualdad entre y D sdlo se da en el quimiostato simple, pero en todos los sis- temas continuos ~ depende de D y puede igualmente ser ajustada a voluntad. La ecuacién (45) constituye una buena definicién de Y en el quimiostato. El valor de X sera siempre menor que el X final en cultivo por lotes en e &thismo medio de cultivo, debido a que S nunca puede ser cero, como se desprende de la ecuacién Monod. Sin embargo, como se ve en la Figura 9, el valor de S es normalmente bajo, del orden del respectivo K, (Tabla 3). La ecuacién (48) revela que el valor de S depende sdlo del parametro de operacién D y de las constantes caracteristicas del microorganismo y su medio, uy Ky, y por lo tanto es inde- pendiente del valor de S,: En la Figura 9 se aprecia que a un cierto valor de D la concentraci6n celular se hace cero; ese valor se denomina_ velocidad de dilucion critica, D crit Y valores mayores, se dice que el Cultivo se lava, esto es, las células desaparecen del fermentador ya que el término de dilucion (- DX) de la ecuacién (39) se hace mayor que el de crecimiento (4X). D crit, S© relaciona con 4, a través de la ecuacién de Monod, imponiendo las condiciones de lavado (X = 0, w= D=D crit!” 2h en esfuco ¢S = Mite fagionao Qk prodechacld udone- Dx 4Dan = tw “KS, wy Por lo tanto D,, es conceptualmente distinto a Ay aunque numéricamente puedan ser casi iguales, ya que normalmente S> Kg. 4.4, Determinacién de Parémetros Para determinar 4, y K, se deben obtener datos de varios estados estacionarios, lo que per- mite construir experimentalmente un grafico tipo Monod (Fig.2). En principio, de este grafico se podria calcular Ks como el valor de S al cual « = aw y,/2, ya que: s ee hee ed Sietks 63) Por otra parte “se podria calcular del grafico como el mayor valor dev, lo que equivale a su valor asintdtico. Sin embargo el valor asi estimado resulta muy impreciso, lo cual repercute en el calculo de K,, que es un numero sensible a pequefias variaciones, por lo que esta forma de calculo no es recomendable. Una mejor forma de determinar 4,, y K, es graficando los valores reciprocos de “ y S, obteniendo “c., del intercepto de la recta con él eje de I/« y K, del intercepto con el eje de So de la pendiente K./ Ay Este método es formalmente inoBjetable, pero aun asi los valores obtenidos pueden presentar variaciones apreciables. Ello es debido a que los datos experi- mentales se ubican relativamente alejados de los ejes, por se ellos valores reciprocos. Por lo tanto pequenas diferencias en la pendiente de la recta trazada se amplifica notoriamente en la interseccién y afecta el valor de <<, . También es importante el hecho que obtener cinco 0 seis estados estacionarios requiere de alrededor de una semana o mas de trabajo. Otra alternativa es el denominado método del lavado (Pirt y Callow, 1960), que consiste en aumentar el valor de D de un cultivo en estado estacionario sobre dD, at de forma de producir intencionalmente el lavado y graficarlos datos obtenidos en la forma de {nx vs T En la situacién de lavado rige la ecuacién diferencial (39) y dado que D > Daa las células creceran a su maxima velocidad ,,. aX ee eek re) dt 2 demedXast din x thy ai sxe me MenEn ny Cat &) Por lo tanto «se calcula determinando la pendiente de un grafico In X vs t, restandola (la pendiente es negativa) del valor de D escogido para producir el lavado. El experimento debe prolongarse lo suficiente para obtener una buena recta, dejando de lado los primeros puntos que corresponden a un periodo transitorio de ajuste a las nuevas condiciones. El valor de «, obtenido de lavado es tan bueno como lo es su determinacion a partir de la fase de crecimierifo exponencial de un cultivo por lotes. Pero en ambos casos se trata solo de una aproximacion, ya que “,, es un limite tedrico (a infinita concentracién de sustrato) y no se la puede medir directamente, sino que aproximar u obtener por extrapolacién, como en el método de los reciprocos. El valor obtenido por el método del lavado mas bien es D We Hy La Figura 9 muestra que Qy presenta un maximo a una determinada D. EI valor de D al que se presenta ese maximo, On puede determinarse derivando la expresion analitica de Q, res- 28pecto a D y haciéndola igual a cero: Q, = WX = OX = DYy_ (S,-—> .) ‘ dQ. ciy e” = = Ww Dy = ww (1 = (Ke/(So+K) as El signo positivo de la raiz se descarta porque D,, no puede ser mayor que 4). Introduciendo el valor de D,, en la ecuacion cag} se calcula Xw el valor de X"al cual se pre- senta el maximo de productividad, Q,,. Xm eS Yuys (S5* K. (Ky (S5+ Kk)? 58) y luego Qy = Dy Xy (60) Es posible demostrar que Q,, es siempre mayor que el valor maximo de Q. que se obtiene en Cultivo por lotes (Aiba y col., $673, Sikyta y Slezak, 1964) y que esta diferencia es tanto mayor mientras mas prolongado sea el periodo de operacién continua. Esta propiedad constituye una importante ventaja de las fermentaciones continuas respecto a la modalidad por lotes. 5. SISTEMAS CONTINUOS MULTIETAPA Y CON RECIRCULACION 5.1. Quimiostato de dos Etapas Es posible, y a veces resulta conveniente, conectar dos 0 mas quimiostatos en serie. EI trata- miento matematico de los quimiostatos en serie se puede generalizar an etapas y con esa base es posible determinar el numero de etapas necesarias para cumplir con una cierta tarea (Aiba y col., 1973). En esta ocasién se analizara el quimiostato de dos etapas, que es el arreglo que ofrece mayores oportunidades practicas de aplicaci6n (Figura 10). Fig. 10. Representacién esquematica de un quimiostato de dos etapas. 2gEn este caso las variables son seis: X,,X,.S,,S,, 5. > $| S¢ Imponie ia contwmn we 4 Vs Var ¥, fe 1 Winds Site, pa 1 La etapa 1 se comporta como un quimiostato simple, por lo que, considerando X,, = O. ax, Be DK + mV % donde D, = FN, En operacién en estado estacionario Balance de nutriente limitante, etapa 1. —- 9s, eee: a 0, S En estado estacionario Relacién cinética, etapa 1 En ausencia de inhibicion Balance de células, etape Nene Toes Po =D, X, = DX 4 eX eae Saad n= Balance de nutriente limitante, etapa 2. 8s, x, ae 2pse—ee = D, 8, - 0, S,--# En estado estacionario x = —t_ 0,5,-0,8) ‘sean constantes y no ge considera la formacién de producto P. @)rene aT ROT ra s, He te eg 9 Las ecuaciones (61), (63), (65), (66), (68) y (70) representan el comportamiento del quimios- tato de dos etapas en cualquier régimen de operacién, mientras que la operacién en estado ‘estacionario esta dada por las ecuaciones (62), (64), (65), (67), (69) y (70). ‘Algunas restricciones razonables pueden simpilficar las ecuaciones. Si se establece que ‘ambas etapas operan con el mismo volumen de liquido (V = V, = V,yD = D, = D,) y que Yyyg = Yuyst = Vys2 entonces en régimen estacionario: ve 04 ) ” X= Xs + Yen BS) @ Es interesante notar que 11, < D, dado que (KyX,)% < 1. ‘Dado que generaimente el valor de S, es bajo, del orden de Kg, en la equacién (72) se apre- ccia que es muy poco el crecimiento adicional que se obtiene en Ia segunda etapa. Por ello, se ‘acostumbra a disponer una alimentacidn secundaria en la segunda etapa (en linea punteada en la Figura 10), por lo que la ecuacién (72) se modifica a: X, =X, + Yyg (8, + 8,-S) 73) Dada sus caracteristicas, los sistemas muttietapas resuitan adecuados para la degradacion de sustratos reacalctrantes (alto K.) y para aquellos procesos en los cuales las condiones ambientales de crecimiento y produécién sean distintas. También se menciona la producci6n de metabolitos secundarios, para lo cual la segunda etapa puede ser de mayor volumen (menor ) y la fuente de carbono puede ser otra, a través de la alimentacién secundaria, lo cual puede también contener inductores y precursores (Fencl y col, 1972). 5.2. Quimiastato con Recirculacién de Células Una eficaz forma de conseguir una alta concentracién de biomasa, la cual trae aparejada una ata concentracién y productividad volumética de producto y un buen aprovechamierto de los ruttientes, es el quimiostato con reciculacién parcial de células. El esquema de un fermentador continuo de tanque agitado con recitculacion decélulas apa recen en ia Figura 11. Fig. 11, Quimiostato con recirculacién parcial de clus. 31ECE CE COTETEREE! PERE FT UN Se en Ce ee ee fitro © combinacién de ellos) que produce una corriente clara de baja o nula concentracién ‘celular y una corriente concentrada ¢ veces en biomasa y de fiujo % veces el flujo de alimenta- ‘ion fresca al sistema. La purga F, proporciona flexibilidad a la operacin en estado estaciona- fio, Siguiendo el mismo procedimiento anterior se tiene: Balance de céiulas en el fermentador 5 DeX- (art) OK 6 wx 09 Endondea>o y c>1 En estado estacionario w= (1t+a-ac)D co) {Al igual que en la segunda etapa del arregio anterior (ecuacién 71), D es mayorque 2, ya que es facil demostrar que (1+. -«.¢) 1. Esta caracteristica permite alimentar el sistema a una velocidad de dilucién mas alta que «propiedad muy util cuando se quiere procesar gran can- tidad de liquido mediante una poblactin microbiana de lento crecimiento; esta situacién es una ccaracteristca saliente de los efluentes municipales e industriales, Balance de sustrato en el fermentador. os WX. B= 05,4008 (160) 08 -— ° y, ie) ey La ecuacién (77) permite visualizar las altas concentraciones celulares que se pueden alcan- zar, dependiendo de la velocidad de recicculacién y del factor de concentracién. Relacién cinética. w= wR va (140) FX = FX 4F eX a Fer Co) Se tone ademds que: Pon Fey ~ De las dos ecuaciones anteriores se obtiene: see F, @) Si se tiene un separador 100% eficiente, entonces X, =0 y de la ecuacién (81) se obtiene el flujo F, (y por lo tanto la purga F,) requeridos: 32“oe © i Por otra parte la productividad volumétrica de células del fermentador es: Q, = WX = D (1swus) X 3 Las atlas productividades de células y productos que son posibles de obtener en este arre- {glo lo hacen muy atractivo para la produccién de metabolites tales como etanol y otros, ademas de su aplicacién ya tradicional al tratamiento biolégico de aguas, 5.3. Otros Arregios Relacionado con la idea de recirculacién de células, surge el concepto de retencién de céiulas. Si el objetivo es aumentar la poblacién celular en el fermentador, aparece como mas directo tetene’ las células dentro de la vasija que retiarlas con el efluente y iuego recircularlas, Una forma de obtener la retencién parcial de biomasa es dotar al fermentador de dos sal- das, una de las cuales tenga un fitro absoluto de manera que s6lo permite la salida de liquido Claro (Pin y Kurowski, 1970). Si f es la raccién de F que constituye la corriente sin células del efivente, (Ff) sera la fraccién con células, de modo que en estado estacionario se tiene: we (10 _ 4 x= te — 6.9) a $= Shea - ‘También se pueden retener células utilzando un fermentador de columna vacia con alimen- taci6n por el fondo. Es posible operar a velocidades de flujo tales que las células estén practi camente en equilibrio respecto a las fuerzas gravitatorias, de empuje y de arrastre 0 roce. Si la concentracion celular aumenta lo suficiente, se llega al concepto de fermentador de lecho fiuii- zado. ‘Como se mencion6 en 4.2., resuita interesante examinar el comportamiento de un fermenta- dor continuo tubular de flujo piston, pese a que en la practica esa condicion de operacién sdlo ‘Se puede aproximar en mayor 0 menor medida, La Figura 12 entrega un esquema de un fermentador de flujo pistén. Es necesario contar con inéculo continuo, ya sea recirculando parte del efluente, como se muestra en la figura, © uti lizando un propagader. Fig. 12, Esquema de un fermentador continuo de flujo piston,GENCE CONES COO ——E—E—Ex=- ox Vier gpearley, - \ 3S vs BO « Como ya se mencioné, estas ecuaciones son equivalentes a los de un reactor agitado por Jotes, ya que la velocidad v, igual a F/A, esta relacionada con el tiempo a través de: levt @ d= vat ~ La concentracin celular de entrada X, segin un balance de células alrededor del punto 1 sera roc 1) Un balance de sustrato alrededor del punto 1 entrega la concentracion de entrada S_° 8, +4S (92) +e 6, DINAMICA DEL CULTIVO CONTINUO. 6.1 Oscilaciones Es un hecho establecido que los sistemas biolégicos son oscilantes. Dado que el metabolismo cconstituye una compleja red cerrada de reacciones (Dean y Hinshelwood, 1966), la concentra. cidn de cada constituyente de la célula presenta un componente oscilatorio sostenico, Estas ‘oscilaciones, de amplitud y frecuencia determinadas por todo el conjunto de condiciones ‘ambientales, no son en general percibidas al cuantiicar propiedades poblacionales, debido ‘que suceden individualmente en cada célula y los eventos fisiologicos no estan normaimente ‘sincronizados. Sin embargo las oscilaciones pueden ser percibidas en poblaciones que hayan sido casual o intencionalmente sincronizadas (Dawson, 1972), En poblaciones asinciénicas se producen también oscilaciones sostenidas 0 amortiguadas fen determinadas condiciones, Cuando se puede presentar mas de un estado estacionario en las mismas condiciones de operacién, surge la posibilidad de oscilaciones por Ia alternancia ‘entre dos estados. La interacci6n del cultivo con el ambiente, la interaccién entre mecanismos de regulacién metabdlica que pueden entrar en resonancia y ciertos artficios experimentales han sido citados entre las causas de cuitvos oscilantes (Harrison y Topiwala, 1974); Borzani y col, j1977; Borzani y Hiss, 1979; Jobses y col, 1986). ‘Dado que, al igual que cualquier sistema, las poblaciones mictobianas presentan una cierta inercia 0 resistencia al cambio de sus trayectorias, se pueden producir oscilaciones amortigua das en el paso de estados transitorios de crecimiento no limtado a estados estacionarios de crecimiento limitado. Esta situaci6n se presenta en el cambio de un estado estacionario @ otro y fen la puesta en marcha de un quimiostato.ee eae era Las ecuaciones que describen al quimiostato simple sin inhibicion tienen una sola solucién den ito de las restriceiones fisiolégicas ya establecidas, a cual representa un Unico estado estacio- nario. Sin embargo, estrictamente es también un estado estacionario la situacién de lavado, ‘aunque no revista interés como cultvo; por ello se le denomina un estado estacionario rival. La situacién es diferente en sistemas que presentan complejidades adicionales. En esos casos se pueden presentar dos 0 més estados estacionarios ademas del trivial. Los casos dis- utidos en la Iiteratura son muchos, entre los que se puede citar Ia inhibicién por sustrato 0 ‘sustancia exégena, la presencia de fuentes multiples de un elemento, los cultivo de levaduras: ‘que se reproducen por fisi6n, as limitaciones por N y P, el crecimiento en superticies y los cul- os mixtos de dos 0 més microorganismos con asociaciones simbicticas 0 de comensalismos y {que compiten por el mismo sustrato. Un estudio teérico (Aris y Humphrey, 1977) predice 31 festados estacionarics posibles en el caso de dos miroroganismos y un sustrato, ‘Los diversos estados estacionarios difieren entre si en cuanto su estabilidad. Se dice que un ‘estado estacionario es estable cuando resiste una perturbacion externa de magnitud moderadi La perurbacién saca al sistema de su estado estacionario por un periodo transitorio, pero éste vuelve a su posicion original siguiendo una trayectoria oscilante alrededor de la posicion esta Cionaria. Un estado estacionario es inestable si no resiste la perturbacién, la cual lleva al sis- tema a otra posicién de equilbrio o estado estacionario, el cual sera estable, Se debe notar que tn estado estacionario, ya sea estable o inestable, puede permanecer indefinidamente en esa situacién, si no es perturbado. El estudio de la estabilidad de los estados estacionarios puede realizarse rigurosamente mediante métodos matematicos bien establecidos, tal como el de Lya- ‘punov, pero su desarrollo excede el marco de esta discusion y puede ser consultado en la lite- tatura (Koppel, 1968; Mihail y Straja, 1988). Sin embargo resulta ilustratvo intentar un analisis ‘cualittivo sobre la estabilidad en el caso de inhibicién por sustrato. hy 55 55% 8S Fig. 13. Estados ato y su estabiidad, tacionarios en el eas0 de inhibicion por En la Figura 13 se puede ver que para la misma conclcién de operacién dada por D,, s2 pueden presertar dos estados estacionaios, 1 2 eracterizados por S, yS, respectvarénte Biel cutivo se encuentra operando en 1y una gequeia perurbacion auinena a concentracion de sustato lmitante en el fermentador eS, a SJa poblacion podra crecer a «, mayor que D, Por lo tanto el euvo demanda's mas sustrato Ia concentracion de este tended a dsminut hasta aleanza’ neovamente el puto 1 Po ainercia de! sstema, fa vayectogia hacia t tendera a ser oseiante. Si otra perurbacion hace bajar S, aS," el culvo creceré a, menor que D, por fo.que se acumulra sustrato no uiizado y ae vole al punto 3. De este afsis se despiende que el punto 1 es un estado estacionatio estable. 35CONCENTRACION OR TACGGENG BAO GC FONE 0 CONCRNDET Ge oF Pat & percatarse que, segin sea la perturbacién, el cultivo adpta ci disminucién en S, causa que el sistema se estabilice en el estado 1, estable, mientras que un ‘aumento en S, produce el lavado, punto 3, estado estacionario también estable 6.3. Régimen Transitorio ‘Se dice que un sistema se encuentra en régimen transtorio 0 no estacionario cuando se produ: ‘cen en él variaciones del valor de las variables respecto al tiempo. En un estado transitoio la poblacion celular pasa por una serie de estados fisiolégicos que ‘dependen de la trayectoria temporal dl sistema. Por esta razon su respuesta es diferente a la ‘que se obtiene en estado estacionati, puciendo presentar variaciones no sélo en las concen ttaciones, sino que también en rendimiento y productividades. Las trayectorias transitorias $e obtienen resoiviendo las ecuaciones (38) a (42). Dado que se trata de un sistema de ecuaciones diterenciales no lineales, no es posible encontrar analtica- mente soluciones generales y se debe recurtir ala comprobacién de la validez de soluciones pparticulares 0 a su solucin por métodos numéricos. La forma generaizada de estas trayectorias se ejempiifica en la Figura 14a para X y S. Resuta util para el andlsis de las trayectorias y de la estabilidad de los estados estacionarios elminar el tempo y representar las trayectorias como X vs S, tal como se aprecia en la Figura ‘4b, generdndose asi un diagrama o plano de fase. TIEMPO Fig. 14.2) Trayectoria de un estado estacionario 1 a otro estado estacionario 2. ») Representacién de las mismas vayectorias en un plano de tase La Figura 14 muestra un hecho interesante: la trayectoria de un estado estacionario a otro es tal que pasa por zonas en las cuales el valor de X (y eventualmente de P) es mayor que el del estado estacionario correspondiente. Dado este hecho, es concebible plantear una estrategia, de cuttivo continuo en estado no estacionario mediante la cual las condiciones de salida sean permanentemente las de esas zonas de mayor produccion (Pickett y col., 1979; Cooney y col, 4975; Borzani y col, 1976; Hong y Lee, 1987; Torrico y col, 1988). 7. ASPECTOS FISIOLOGICOS, OPERACION Y APLICACIONES DEL CULTIVO CONTINUO 7.1. Aspectos Fisiolégicos Ya se menciond como caracteristica saliente del cutive continuo la posibilidad de manejar a voluntad la velocidad especifica de crecimiento de las células, manteniendo la poblacién en 36eueseseu eoeiqeise 08 oyeisolwind (@ Us eIUaseid 9s anb up}rEUUWEIUOD 0 UO!oeINW BPO} CU ‘anb sej0u eqap 08 ‘oisedsa1 Jy "SOpeIUAWITe SeI0| 0 $910] 101 Ono Ue enb Up!ZeINUI EP PEPIIA, =eqoid s0XeWw Cun e1sixe ‘ugjoeiado ap sopouied sopebuojoid so} ‘uoze) ews ¥| e OPIGed ‘Sep $-1 @pB0 ¥7IIN6159 a8 aPUOP 39I0| Od NNO Ue epsons enb 0} ep Uoiperedwoo Ue UpReUIUEIUOD Bp PepIiqisod e| ueIUeWNe JezWIeISee) U's UO!DEIEdO ep sodiuion SopeBuojoid $0) anb ‘oBieqwe U's 1900U090) agap ag “seTe Bp SejqejoNUODU! SesneD Jod onjes esieulrewvoo en sod ouan ou opesedo A opeuasip siueuwe}ze1100 ojeysowinb UN, @ soe = oe =1 ba wfo- BJ: » bod wa- = We {8 BAall W 8p BoUEIeG UN “1W BsIUENOUe 2s OU OUBUOIDEISe Opes OneNU Jo us onb A yy uoisenusauco Us eisinbjend eoueIsns wun ap ejuasald e| od eqeZueIDEIeD ‘98 soueive Opeise 9 anb sesued epand ag ‘VeUOIDeIse Opelse Oren [ap e2YS}/9!DeIe UO! "sodwod e} ap 966 |e Je7URDIe Bred odwall ja eILeseice1 OUBIH0 9183 “OVUOIDEISE OpEIse J9P Senyewaseida: seuoiaipaw se0e4 ap selue e:ouepIses ap sodwn so ep osinosueN 9 SOUR! fe seiedse ewuepnid so oB:equie ug ‘ofnpoid 0/A ojesisns ‘seinjgo ep up!DeIU—DUCO B| ep ‘se2|pqued s@UOIDIpeW UsDBY eS OLEUOEIS® OPeIse |@ OPEZUEDIE EY OS 1S JLUNUIEIEP Bed jerouauodxe ojvalui‘2910 oUe|d Ue BiIUeNUE 2s A eoUEIE| ap Ose} e| OPEL -opuege ey upioeigod 21 enb ‘seuonipaw sepnadas 1od ‘opeqoidwoo ey es oWvoxd Uel olny 9 se}21U! $8 ONUIUCO CAINS [9 BYOTEW UA J8UOd @P BULIO} JOlewW B7 “IS!!! eyNSed eNb OUOIE}OSO ‘o1UalUIeo10dwo2 ap OVOUSUeN poled UN e JeA9I| epend olny Jap OyPIE} OIL! UN Ope} OHIO 30d ‘900/q8i80 95 OU UNE [eOLEvOGX® O}UENWID [@ |S OAIIND [@ JeAR| |p OBsa)s [9 61100 9s ‘aIvaW) -epediouue ej as olny j9 1S “eqwenye A saiuavinu 9p olny |e ze1u1 on) ered ‘odwont OOD Un ajuesnp $e10| 10d Onno A Up!2e;MOOU! e| BOydUH OjeIsolWWIND UN ep eYoVEW US eWSeNd e orersolwing jep uproesedo 'L (6961 ‘sojoreyy A 19m 12961 ‘orejeuBiy A vig (0961 ‘1UeUI04) soverawe A soveleueW ered seiBerENSe op ojjoueSep ja A conggeiew j11u00 ep sowsiveveW 60} ap olpniso ja Wied epencepe Anus s@ PepyepoU eis “(€861 ‘openeoy A epeseg) eInigo e] P YNNY AP OPIUEIUOD [981408 vr 9p OU ‘oreja Jo PUNO) BSE U2 BsoPURIOeIde “eWEISUCD (UOKONIIP BP PEPIOOJEA e} ep SNE e) CIUOI [Seno ep eaypedse pepcojen e| oPuelUeIUEW ONIN [9 o1G0S seinIe:edwies SESIOA ep OxD8}0 Je Reprise epend es ‘ojduiole 00D “se1UeIsUC9 SPW Se] SEDOI OPUaIUE|UEW ‘OAL [9 81908 Sigevven eun op oFeje |@ pepuera vod Jeoyuen ap peprunuiodo e] EpuuG onuNCD CANO 13 ‘(re6t “yoo A uuewredwinyy '6261 ‘ite A @Bpeney ‘E261 ‘Aeuc0g A opensoy) sowewieje SOON d 'H “g 'D 'N 2p kas ek sauoDeNUU SeUBD Oleg SEWIZUE O SONOGEIaW SoPEUMWeIEP sONPO:da/GOS: gigised s9 enb opeqovduios ey 9s ‘eIueWeNIDe)3 “OWSIOTeIeW JOP So\UNsIP SoIUNd EDee Upbouise! Epes end eA “oiUENu eWUeNINU Jo Wes fend UN6Os eiuNSID pins viny9D w| op eisond ‘sei &| Ue SeYV. 3010] JOd ONO Ue epeons OWCD ‘OPED OU ClUEIWiDE!D ep UO}oENYS BUN 0 #1 © a1ua0a1)) eaI6o}oIsy etsandse) Eun snes onb o} ‘oUelAnU UNBje ep upeMUY oleq e7 19) 98 UQIDEIGOU &| @P OIUSIWIDE:D [9 eb se OIEISOLWIN jap sWeLOW! EoNsVe_eD ENO “s9jqeu010998 f SOpIINeD dacitinsnniat-eitaiisiaady-iiaiy ta eden ep eataanens minced nO SaRURS SSrp iirsen-vedhecnthecmgmbpreeeelnms veh eloped ata ‘esté bien adaptada a su condici6n de operacién, como se aprecia en la Figura 15. (a) (b) fe feo s 54 Fig, 15. Carketer selective del quimiostato, a la cepa 8 (mutante o contaminants) se lava por crecer 2 una velocidad ce civeén de ermentadorb) a cepa 8 se estabece y la cepa original se ava Otros aspectos de operacion que deben cuidarse son los que se refieren a la agitacion y al crecimiento en superticies. La falta de homogeneidad en el contenido det fermentador llevan a notorias desviaciones en ‘el comportamiento del cultive respecto al predicho por la teoria ya expuesta. La perfecta agita- ‘cin es una concepcién tedrica que se alcanza mejor en fermentadores pequefios y que es mas dificil de realizar en equipos grandes y en los casos de reologias complejas. En esos casos resulta necesario incluir en el modelo matemnética el efecto de la imperfecta agitacién (Sinclair y Brown, 1970). La tendencia de algunos microorganismos a crecer adheridos a superficies (paredes del ferentador), acrecentada por los largos petiodos de operacién, provocan también desviacio- nes importantes en el comportamiento de la fermentacion, ya que las células que crecen en la pared y se desprenden de ella actiian como un indculo permanente no considerado en el ‘modelo de Monod y Novick y Szilard. 7.3. Aplicaciones Las aplicaciones del cutivo continuo se desprenden de sus caracteristicas y propiedades y pue- Gen agruparse en aplicaciones de a nivel de investigaci6n y aplicaciones industrales. En el campo de la investigacién, el cultivo continuo se ha constituido en una herramienta dk ‘gran utlidad y de cardcter préticamente insustiuble. Esta modalidad se presta admirablemente para el estudio de aspactos fisioldgicos relacionados con requerimientos nutricionales y optimi zacion de medics, condiciones ambientales y mecanismos de control. La cinética y sobreproduccion de metabolitos por métodos ambientales puede ser ventajo- ‘samente aboradada, con especial mencién de los metabolitos secundarios El estudio de sistemas microbianos complejos, tales como las poblaciones mixtas y los sus: tratos mixtos y recalcitrantes, también se benefician de esta técnica. Una aplicacién destacable del quimiostato simple es su capacidad de seleccionar cepas de ccaracteristicas predeterminadas, a partir de poblaciones heterogéneas de origen natural 0 mutada, En el campo industrial las principales ventajas de las fermentaciones continuas son su alta productividad, su faciidad de instrumentacion y automatizacion, la calidad pareja de su efiuente, la posibilidad de operar permanentemente en las condiciones éptimas y su versatilidad para ‘eludir los mecanismos de control metabdlico que impiden la sobreproduccién. 38Pese a esas ventajas, es indudable que el cultivo continuo no ha ganado la pret las industrias como s@ prevela hace 20 afios atras. Ello se debe a temores relacionados con problemas de contaminacién y mutacion, a un cieto conservantismo del sector productivo y Muy importante, a que no siempre resulte positivo el andlisis econémico al piantearse el cambio ‘de una instalacion existente, que opera por lotes, al sistema continuo.Cretexen promis eee 8.1. Introduccién Muchos procesos fermentativos que a priori parecen de interes, no pueden en la practica real- zarse a escala industrial debido a las pequefas productividades que presentan, 10 que eleva Cconsiderablemente los costos de inversion y de funcionamiento (energia, agua, etc). La produc- tividad global, Qp, puede ser definida como el producto de la velocidad especifica de produc: cién de producto, ap, y la concentracién celular, X. Qp = qpx + produchuded ap = (1%) (a) La productividad especitica es caracteristica de un microorganismo determinado y de las condiciones de fermentacién (concentracién de sustrato, concentracién de inhibidor, tempera- tura, pH, etc), Por tanto la nica manera de aumentar Qp, una vez optimizado gp, es elevando la Cconcentracion celular en el fermentador a través de los cultvos de alta densidad. Existen diver. ‘sas formas de obtener estos cultivos densos, siendo los las técnicas mas utlizadas: reciclado Celular (ya sea por centrifugacién, uitrafitracién 0 decantacién), fermentadores de membranas, floculacién e inmovilizacién, que es el caso a analizar en este curso. 8.2. Caracteristicas Generales de los Cultvos de Alta Densigad Las principales caracteristicas de estos sistemas de alia densidad celular son la siguientes: 2) En general, los culivos de densidades normales (X < 50 g/l) son tratados como si el ‘medio fuese homogéneo. Sin embargo las celulas son en realidad particulas sOlidas que pue- «den, y de hecho lo hacen, inliren el comportamiento del fuido. SiX>50 g/L, mas det 15 % del ‘cultivo se encuentra en fase sdlida sin sumar el aporte del soporte. Por otro lado se genera una ‘gran cantidad de gas; por ejemplo, en una fermentacion alcohdlca en un reactor de 60 m?, con ‘._50.q/L de celulas se goneratén alrededor de 1250 m? de CO, En consecuencia en es tipo de ~cutivo se tendrdn tes fases (solida: 15-30%, lquida: 20.25% y gaseosa: 10-25%), lo que hace dificil la interpretacién y el estudio de la fermentacion. Si el culo es aerobio la situacién se complica ain mas ya que fuera del gas generado hay que suministar el oxigeno requerido por el microorganismo. Este hecho se confirma en un estucio realizado en un reactor de lecho fo (Chamy etal, 1969) con S.cerevisiae inmovilzada en k-carragenato, en donde se analizaron las Caractersticas de las bioparticulas a diferentes aturas observandose grandes diferencias en las concentraciones y viabilidad celular. Uno de los problemas que afectan la fata de homogeneidad es la mayor concentracién de Células que se orientan hacia la superficie dela particula, lo que aumenta los problemas de difu- si6n [Axelsson y Persson, 1987]. Este efecto fué observado por Nagashima [1989] y Godia et a. {1987}, al analzar una secciSn transversal de una bioparticula de S.cerevisize inmoviizada en alginato y carragenato respectivamente. 'b) En muchos casos el comportamiento reoiégico cambia, y el uid se comporta como no- rewtoniano. Este hecho allerara los fenémenos de transporte en el reactor: tempo de mezcia para el sustrato,transterencia de oxigeno, estuerzo cortante,transterencia de calor, eic, io que puede originar problemas difcies de resolver ¢) Finalmente todos los parémetros fisicos adquieren imponancia, no ya desde un punto de Vista macroscépico, sino de una manera micioscopica. EI microambiente que rodea a la célula (temperatura, pH, actividad del agua (aw), etc) puede diferc notablemente del observado en el fermentado, lo que puede hacer cambiar drésicamente el comportamiento fsioloyico de las Celuas. Asi, por ejemplo las células inmovilzadas disminuyen su mutipicacién, aunque mantie: Ten su abil, realizan su sintesisproteica e incrementan su contenido de DNA y RNA hasia en unas 6 veces. También pueden presentar una morfologia y caracterstcas completamente diferentes.