EFECTO HIPERCRÓMICO DEL ADN

Al calentar DNA se rompen los puentes de hidrógeno y las hebras se separan, lo

que se conoce como denaturación. Si se vuelven a juntar las cadenas bajo
condiciones adecuadas se habla de renaturación.

Al agregar a una cadena otra molécula con secuencias que interaccionen,

se habla de hibridización.
Existen moléculas que degradan el DNA y RNA, las endonucleasas lo
hacen desde el interior, las exonucleasas, desde los extremos. Las enzimas de
restricción son endonucleasas para una secuencia específica.
Las proteínas se pueden cuantificar leyendo a luz ultravioleta: 220-230 nm
(unión peptídica); 280 nm (aromáticos: triptofano, fenilalanina). Los ácidos
nucleicos absorben luz ultravioleta, con un máximo de absorción a 260 nm, por
las bases, que son aromáticas. De esta manera se puede medir la concentración.
Ambas cadenas se mantienen unidas por puentes de hidrógeno y
reacciones hidrofóbicas. Las cadenas se separan por calor.
Si el ADN es calentado por 5 minutos y se hace el espectro, se obtiene un
espectro de absorción más alto que el ADN no denaturado porque las bases
absorben más, lo que se conoce como efecto hipercrómico.
Si se mide la absorbancia a 260 nm pero a distintas temperaturas (curva de
denaturación térmica), a cierta temperatura la absorbancia aumenta abruptamente
en un 25 a 30%.
Distintos ADN aumentan la absorbancia abruptamente a distintas
temperaturas dependiendo del número de puentes de hidrógeno.
La temperatura de fusión de DNA, es aquella donde el ADN está 50%
denaturado.
El efecto hipercrómico se utiliza para cuantificar la cantidad de ADN que
se tiene en forma de doble hebra o de cadena sencilla. Al representar la
temperatura frente a la absorción a 280 nm se observa una curva sigmoidea, con
lo que se deduce que las fuerzas que estabilizan la estructura helicoidal son
cooperativas, es decir, cuesta mucho romper las primeras interacciones
estabilizantes, pero una vez conseguido el resto se rompe muy fácilmente. Hay
un umbral mínimo de energía a partir del cual el proceso de desnaturalización es
muy rápido.
El efecto hipercrómico es el incremento de absorbancia en un material. El caso opuesto es el
efecto hipocrómico. El caso más conocido es la hipercromicidad del ADN, que ocurre cuando el
dúplex se desnaturaliza, dando dos cadenas sencillas que absorben más en el ultravioleta. Esta
característica del ADN es una forma de seguir el proceso de desnaturalización de la molécula: a
medida que el proceso avanza, se observa un incremento en la absorbancia.

DESNATURALIZACIÓN DEL DNA

Cuando se rompen las fuerzas de unión entre las dos hebras
del DNA, éstas acaban por separarse. Por tanto, el DNA
desnaturalizado es de una sola hebra. La transición entre el
estado nativo y el desnaturalizado se conoce como
desnaturalización.

La forma más corriente de desnaturalizar el DNA es por calentamiento. Otro agente desnaturalizante
es el pH elevado porque cambia la carga de algunos grupos que forman parte de los puentes de
hidrógeno. En agua destilada (con una fuerza iónica muy reducida) se produce la separación de las
hebras. Este fenomeno se debe a que en agua muy pura, la fuerte repulsión entre las cargas negativas
de los grupos fosfato no es contrarrestada por los correspondientes contraiones (Na +, Mg+2).
La gráfica que representa la medida de A260 en función de la temperatura se llama curva de fusión del
DNA (Figura inferior). Esta curva presenta las siguientes características:

1.- La A260 permanece constante hasta

temperaturas bien por encima de las
fisiológicas. En este intervalo, la
molécula está en forma de doble hebra.

2.- El aumento de A260 tiene lugar en un

estrecho rango de temperaturas (6-8 ºC).
La A260 empieza a aumentar cuando
comienzan a romperse las uniones entre
las bases en varios segmentos de la
molécula. El número de PB que se
rompen aumenta con la temperatura, y
con ella la A260. Al final del tramo
ascendente, las dos hebras se mantienen
juntas por unos cuantos PB.

3.- La A260 máxima es

aproximadamente un 37% mayor que el
valor inicial, y corresponde al estado en
que las dos hebras están completamente
separadas.

Un parámetro muy útil para caracterizar la evolución de la fusión es la temperatura a la que el aumento
de la A260 ha llegado a la mitad de su camino. Esta temperatura se llama temperatura de fusión (Tm).
Se ha comprobado que la Tm aumenta con el contenido de G+C (Figura de la derecha). Como el par
de bases G-C está unido por tres puentes de hidrógeno (a diferencia del par A-T que sólo presenta 2) se
requiere una temperatura más alta para desnaturalizarlo.
 Dependencia de Tm con el
Temperatura de fusión del DNA (Tm)
contenido en G+C del DNA

Los reactivos que incrementan la solubilidad de las bases

(como el etanol) disminuyen la Tm, ya que reducen la
interacción hidrofóbica que las mantiene unidas (Figura de la
izquierda).

De esto se deduce que tanto los puentes de hidrógeno como

las interacciones hidrofóbicas cooperan para formar una
estructura estable. Si se reduce o elimina cualquiera de estas
interacciones, la estabilidad disminuye y la Tm es menor.

http://www.ehu.eus/biomoleculas/an/an42.htm

EFECTO HIPOCRÓMICO

Las interacciones de apilamiento de las bases de los ácidos nucleicos provocan una disminución
de la absorción de la luz UV, en relación con una solución de nucleótidos libres de la misma
concentración. La disminución de la absorción de la luz UV disminuye aún mas cuando se forma la
doble cadena. Este fenómeno se denomina efecto hipocrómico y la desnaturalización provoca el
efecto contrario, es decir, un incremento de la absorción de la luz (efecto hipercrómico). De este
modo, es posible seguir el proceso de la desnaturalización midiendo la absorción de la luz UV.

TEMPERATURA DE FUSIÓN (tm)

Cada especie de ADN tiene una temperatura de desnaturalización específica llamada PUNTO DE
FUSIÓN (tm). Cuanto mayor es el contenido de GC más alto es el punto. Esto es porque se
requiere mayor energía calórica para disociar los enlaces de hidrógeno GC que los AT. La
determinación cuidadosa de tm de una muestra de ADN en condiciones de pH y fuerza iónica
definidas puede proporcionar una estimación de la composición de bases.