Cultivo de bacterias

y hongos in vitro
Irasema J. Yela Miranda
Edgar Alfonseca Silva
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Objetivo general
El alumno realizará las diferentes técnicas de siembra para el cultivo de bacterias y hongos
in vitro; que conozca la clasificación de los medios de cultivo según su estado físico y utilidad
práctica y que describa la morfología colonial.

Objetivos específicos
]]   Conocer la importancia del cultivo de bacterias y hongos in vitro.
]]   Enunciar las condiciones necesarias para el cultivo in vitro de las bacterias y hongos: nutrimentos
y factores fisicoquímicos.
]]   Enunciar la utilidad de los medios según sus características físicas y los clasificará de acuerdo
con el propósito de su uso.
]]   Definir los conceptos de los diferentes medios de cultivo: básico, enriquecido, diferencial,
selectivo, de enriquecimiento, de transporte y especiales.
]]   Realizar las técnicas de siembra en medios de cultivo líquidos, semisólidos y sólidos.
]]   Observar las reacciones metabólicas de bacterias y hongos en algunos medios diferenciales.
]]   Conocer la utilidad de la descripción morfológica de las colonias bacteriana y fungal, con base en
las siguientes características: tiempo de crecimiento, tamaño, color de la colonia, pigmentación
del medio, estructura interna, borde y hemólisis.

Introducción
Para realizar el estudio de los microorganismos es necesario recuperarlos del hábitat natural
donde se encuentran y hacer que proliferen en medios artificiales que les proporcionen sus
requerimientos nutrimentales. A este procedimiento se le conoce como cultivo in vitro.
40 Manual de Prácticas de Laboratorio de Bacteriología y Micología Veterinarias

Tanto las bacterias como los hongos necesitan para su metabolismo fuentes de energía,
fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, minerales y factores de crecimiento; además de estos
nutrimentos debemos tomar en cuenta factores o agentes fisicoquímicos como temperatura,
pH, humedad relativa y atmósfera de incubación.

Nutrimentos
]]   Fuentes de energía. Los microorganismos obtienen su energía a partir de reacciones
metabólicas de óxido-reducción; requieren de compuestos orgánicos como los sustratos
oxidables, de ellos el más comúnmente utilizado es la glucosa, y aceptores de hidrógeno
que conducen a la síntesis de ATP. Las bacterias aerobias necesitan O2 como aceptor de H,
mientras que las bacterias anaerobias utilizan compuestos orgánicos o inorgánicos (sulfatos,
nitratos) como aceptores de H.
]]   Fuentes de carbono (C). Todos los microorganismos utilizan fuentes de C para la síntesis
de compuestos orgánicos celulares, generalmente los mismos compuestos que sirven como
fuentes de energía pueden ser fuentes de C.
]]   Fuentes de nitrógeno N2. Es un elemento esencial de las proteínas y de muchos otros
componentes celulares. El tipo de sustrato requerido puede variar de un microorganismo a
otro, pero en términos generales la mayoría de los microorganismos pueden obtener N2 a
partir del amoniaco (NH3).
]]   Otros minerales. Los microorganismos necesitan otros minerales que actúen como cofacto-
res enzimáticos en la gran diversidad biomolecular; por ejemplo, el magnesio y el potasio son
constituyentes de diversos compuestos orgánicos; el azufre está presente en grupos sulfhí-
dricos de muchas proteínas; el fósforo se encuentra en los grupos fosfatos de ácidos nucleicos
de ATP y de algunas coenzimas. Estos minerales son generalmente incorporados en los medios
de cultivo en forma iónica o como sustratos inorgánicos.
]]   Factores de crecimiento. Son factores que deben adicionarse para favorecer el crecimiento,
ya que intervienen en pasos metabólicos intermediarios. Por ejemplo, la adición de colesterol,
vitaminas, etc. Estos factores son esenciales para que los microorganismos crezcan.
]]   Factores fisicoquímicos. Son importantes porque pueden afectar el crecimiento de bacterias
y hongos; entre éstos se encuentran:

Temperatura. Ésta puede variar tanto para hongos como para bacterias. Aunque existen
divergencias entre los autores respecto a los rangos de temperatura, se pueden clasificar
en:
Psicrofílicas (gr. psychros: frío): crecen a temperaturas de refrigeración, por ejemplo,
a 10ºC.
Mesofílicas: crecen en un rango de 21 a 40ºC.
Termofílicas: crecen a temperaturas mayores de 41ºC.

La mayoría de los hongos y bacterias patógenas se encuentran en el rango

de las mesofílicas. Los recientes hallazgos de microorganismos bajo los casquetes
 Práctica 2 ❚ Cultivo de hongos y bacterias in vitro 41

polares y en salidas de agua hirviente en el fondo del mar han obligado a emplear
neologismos como termodúricos o extremofílicos; uno de ellos, la denominada cepa
121, resiste y puede replicarse a temperatura de la autoclave (121°C).

pH. Se refiere a la concentración de iones de hidrógeno, lo cual indica el grado de acidez

o alcalinidad. La mayoría de las bacterias patógenas crecen mejor en un pH de 6.0 a 8.0
y casi todos los hongos patógenos, en un pH de 5.5 a 5.7.
Humedad relativa. Se encuentra relacionada con el valor de la actividad del agua,
que se refiere a los valores mínimos de actividad para diferentes microorganismos; es-
tos valores son, a título orientativo: bacterias aw>0.90; levaduras aw>0.85; hongos
filamentosos aw>0.80. De lo anterior se observa que los hongos pueden crecer con un
mínimo valor de la actividad del agua (secos) comparado con el crecimiento de bacterias
y levaduras.
Atmósfera. Las bacterias, según sus requerimientos de oxígeno, se clasifican en cinco grupos:
Anaerobias obligadas. Crecen en medios bajos de potencial de óxido-reducción.
El oxígeno es letal para ésta. Ejemplos: algunas especies de Clostridium, Bacteroides,
Fusobacterium.
Anaerobias facultativas. Son capaces de crecer en condiciones de anaerobiosis y
aerobiosis. Ejemplo: las enterobacterias.
Anaerobias aerotolerantes. La condición óptima para su desarrollo es la anaerobiosis,
aunque pueden permanecer viables en presencia de O2. Ejemplo: Clostridium perfringens.
Microaerofílicas. Requieren de una baja tensión de oxígeno y de 5 a 10% de CO2.
Ejemplo: Campylobacter.
Aerobias obligadas. El O2 es indispensable para su desarrollo. Ejemplo: Pseudomonas y la
mayoría de los hongos.

Características físicas de los medios

El estado de los medios está directamente relacionado con las técnicas de siembra de bacterias
y hongos.

]]   Medios líquidos. No contienen agar (agente solidificante), son envasados en tubos, bote-
llas y matraces. Se siembra por agitación del asa (figura 1), por medio de pipetas o deposi-
tando una porción de la muestra. El crecimiento en este tipo de medios se manifiesta como
turbidez. La utilidad de los medios líquidos es aumentar las posibilidades de crecimiento,
diluir los efectos tóxicos y observar la motilidad en preparaciones húmedas.
]]   Medios semisólidos. Son medios que contienen de 0.5 a 0.75% de agar. Se envasan en
tubos y se siembran con asa recta por picadura (figura 1). El crecimiento se observa por
turbidez en el sitio de inoculación en bacterias no móviles y turbidez a los lados de la línea
de inoculación en bacterias móviles. La utilidad es observar la motilidad bacteriana, la cual
se confirmará con una preparación húmeda a partir de medios en caldo, y conservar cepas
bacterianas.
42 Manual de Prácticas de Laboratorio de Bacteriología y Micología Veterinarias

]]   Medios sólidos y duros. Los primeros contienen 1.5% de agar y los últimos, de 3 a 7%.
Pueden envasarse en cajas de Petri, botellas o tubos. La utilidad de estos medios es el ais-
lamiento de colonias de bacterias o levaduras, la realización de pruebas de susceptibilidad
a quimioterapéuticos y guardar cepas bacterianas y micóticas. Los medios duros se utilizan
para disminuir el crecimiento invasivo de algunos microorganismos.

Como puede observarse en la figura 1, la técnica de siembra de estos medios cuando se

encuentran envasados en cajas de Petri es la de estría cruzada para obtener aislamiento de la
muestra o bacteria; con esto se realiza una dilución para tener colonias separadas. Cuando se
envasa en tubo, se siembra por estría continua o picadura. Para el cultivo de hongos en cajas o
tubos, la siembra se realiza con la técnica de punto aislado.

Siembra por agitación Picadura en el centro Siembra por picadura en el fondo del
de asa del agar tubo y en estría

Estría cruzada: Siembra en punto aislado con asa en “L”

• Depositar el inóculo en el cuadrante 1.
• Flamear y enfriar el asa entre cada cuadrante
para realizar el aislamiento.
• Asegurar que exista contacto entre las estrías de
cada cuadrante (1 con 2, 2 con 3 y 3 con 4).
• En el caso de siembra de muestras se realiza la
técnica de primoaislamiento, sembrando en los
cuatro cuadrantes sin flamear el asa entre cada
uno de ellos.

Figura 1. Técnicas de siembra en medios de cultivo.

 Práctica 2 ❚ Cultivo de hongos y bacterias in vitro 43

Figura 2. Técnica de siembra de estría cerrada con hisopo.

Para pruebas de susceptibilidad a quimioterapéuticos se utiliza la técnica de siembra de

estría cerrada con hisopo (figura 2).

Clasificación de los medios de cultivo basada en su utilidad

Los medios sirven para dos propósitos principales: fomentar el crecimiento y facilitar la observación
de algunas reacciones metabólicas; esto dependerá de la composición del medio, por lo que se clasi-
fican como sigue:
]]   Medios de cultivo básicos o generales. Promueven el desarrollo de bacterias y hongos
poco exigentes, ya que contienen los mínimos requerimientos nutrimentales. Son utiliza-
dos para análisis cuantitativos, conservación de cepas y muestreo del medio-ambiente o
superficie. Ejemplos: agar nutritivo, TSA, caldo nutritivo, caldo tripticasa soya y SDA.
]]   Medios enriquecidos. Son medios que se suplementan con factores de crecimiento para el
desarrollo de bacterias y hongos de requerimientos nutrimentales exigentes. Estos medios ge-
neralmente contienen uno o más de los siguientes ingredientes: sangre, suero, líquido ascítico,
huevo, carne, vitaminas y aminoácidos específicos, entre otros. Ejemplos: agar sangre, agar
Sabouraud con ácido nicotínico, agar Lowenstein-Jensen, caldo infusión cerebro corazón, agar
de MH, MHS, agar chocolate, PPLO, etcétera.
]]   Medios selectivos. Estos medios contienen sustancias inhibitorias para suprimir parcial
o totalmente el desarrollo de microorganismos no deseados. Las sustancias utilizadas con
mayor frecuencia son los colorantes, las sales inorgánicas, las sales biliares, los antibióticos
y los detergentes. Los medios selectivos tienen una gran utilidad para el aislamiento de
microorganismos patógenos a partir de muestras clínicas que contengan microflora normal.
Ejemplos: agar McC, VB, micobiotic, MSA. (Véase cuadro 1).
Es importante recordar que también se logra un efecto selectivo hacia ciertos grupos de micro-
organismos simplemente variando factores como la temperatura y la atmósfera de incubación.
]]   Medios diferenciales. Estos medios contienen indicadores que permiten diferenciar géne-
ros o especies de algunos microorganismos por el aspecto característico de sus colonias. La
mayoría de los medios selectivos son también diferenciales; por ejemplo, McC, VB, MSA,
niger, Biggy, PPLO con acetato de talio y penicilina (vease cuadro 1).
44 Manual de Prácticas de Laboratorio de Bacteriología y Micología Veterinarias

]]   Medios de enriquecimiento. Estos medios son líquidos y poseen efectos inhibitorios
sobre ciertos géneros bacterianos, favoreciendo al mismo tiempo el desarrollo de otros
que se encuentren en menor proporción en la muestra. Son medios muy utilizados para
el enriquecimiento de Salmonella y evitar otros gérmenes intestinales. Ejemplo: caldo
tetrationato y caldo selenito. El caldo tioglicolato permite el desarrollo de bacterias anae-
robias y aerobias.
]]   Medios de transporte. Son medios utilizados para el transporte de las muestras clínicas
desde el lugar de su colección hasta el laboratorio. Su finalidad es preservar la viabilidad
de los microorganismos para aislamiento. Intentarse posteriormente el ejemplo: Stuart,
Campy-thio, Carry-Blair, SSF.
]]   Medios especiales. Son los medios que no pueden ser fácilmente agrupados bajo alguna de
las categorías anteriores. Se emplean para comprobar características bioquímicas.

Morfología de las colonias

La interpretación de los cultivos a las 24 o 48 horas de incubación requiere la observación de las
características morfológicas y el número relativo de cada tipo de colonias.
El estudio de la morfología de las colonias es de gran importancia debido a que permite
iniciar una identificación preliminar de los microorganismos aislados.
Cuando una célula bacteriana o micótica prolifera sobre una superficie sólida da lugar a
la formación de un cúmulo de millones de células que pueden observarse a simple vista. Esto
recibe el nombre de colonia o clona.
Las características morfológicas son constantes para cada especie en idénticas condiciones de
cultivo. Para su descripción debe tomarse en cuenta lo siguiente: tiempo de crecimiento, tamaño,
color, borde, superficie, pigmentación, hemólisis y estructura interna. No siempre será necesario
detallar todas las características morfológicas, generalmente se toman en cuenta aquellas que son
más relevantes.
En cuanto al número relativo de colonias bacterianas, este es calculado por inspección de
los cuadrantes, las lecturas son: escaso 1-2; moderado 2-3; abundante 3-4.

Material
]]   General
Por sección
Medios demostrativos
- SIM y caldo nutritivo (con crecimiento)
- agar sangre (α y β hemólisis)
- TSA y Niger (pigmento)
- McC y VB (fermentadoras y no fermentadoras)
 Práctica 2 ❚ Cultivo de hongos y bacterias in vitro 45

]]   Por equipo

- tubo con agar inclinado que contenga cultivo de E. coli
- tubo de agar inclinado que contenga cultivo de Salmonella spp.
- tubo con caldo nutritivo con mezcla de E. coli y S. aureus
- tubo con agar inclinado con Aspergillus fumigatus
- tubo con agar inclinado con Cryptococcus neoformans
- tubo con agar inclinado con Candida albicans
- tubo con caldo nutritivo
- tubo con medio semisólido SIM
- caja con agar MacConkey (McC)
- caja con agar verde brillante (VB)
- caja con agar manitol sal (MSA)
- caja con agar Niger
- caja con agar Sabouraud (SDA)
- caja con agar tripticasa soya (TSA)
- asa bacteriológica, asa recta y asa micológica

Procedimiento
1. Realice la siembra en el medio líquido (caldo nutritivo) con una asada del cultivo de
Candida albicans.
2. Realice la siembra en el medio semisólido (SIM) con el asa recta a partir de un cultivo de E. coli.
3. Realice la siembra de la mezcla bacteriana en la placa de TSA, utilizando la técnica de estría
cruzada para obtener el aislamiento de colonias.
4. Realice la siembra de la mezcla bacteriana utilizando la técnica de estría cruzada para obte-
ner el aislamiento de colonias, en la mitad de las placas de McC, VB, MSA. En la otra mitad
siembre el cultivo de Salmonella spp. de la misma manera.
5. Realice la siembra por estría continua del cultivo de Cryptococcus neoformans en la mitad del
medio Niger. En la mitad restante siembre por estría continua el cultivo de Candida albicans.
6. Realice la siembra del cultivo de Aspergillus fumigatus utilizando la técnica de punto aislado
en el medio de SDA.
7. Identifique adecuadamente sus cultivos e incube a 37ºC las bacterias y levaduras, y a 30°C
los hongos filamentosos (Aspergillus spp.) por 24-48 horas.
8. Observe los medios de cultivo demostrativos agar sangre, Niger, TSA, MSA, McC, VB y MSA, el
crecimiento en cada uno de los medios de cultivo y realice la descripción de lo que se observa en
cada una de ellas.
9. Observe a las 24 o 48 horas cómo es el crecimiento en cada uno de los medios de cultivo
sembrados y realice la descripción de las colonias y características de los medios de cultivo
diferenciales y selectivos.
46 Manual de Prácticas de Laboratorio de Bacteriología y Micología Veterinarias

Descripción básica de las colonias

]]   Tamaño
Diámetro en milímetros
]]   Superficie
Lisas
Rugosas
]]   Estructura interna Forma débilmente irregular, bor-
des débil e irregular, y estructura
Mucoide interna granular opaca.
Granular
Filamentosas
]]   Opacidad (transmisión de luz)
Translúcida
Elevación plana, superficie lisa,
Opaca borde liso aparente con presencia
Transparente (brillante) de pigmento verde obscuro.
]]   Borde
Enteras
Onduladas
Lobuladas
Forma circular, superficie lisa,
Erizadas borde entero, β-hemólisis (medio
Filamentosas agar sangre).
]]   Elevación
Difusas
Convexas
Planas
Umbilicadas Forma circular, borde entero, opa-
]]   Pigmento co con pigmentación amarilla.

De la colonia
En el medio
]]   Hemólisis en agar sangre
Forma irregular, superficie rizoide,
β hemólisis completa borde lobulado, estructura interna
α hemólisis incompleta filamentosa con pigmento amarillo
Hemolisina soluble caldo sangre naranja.
 Cuadro 1. Medios de cultivo selectivos y diferenciados

Organismos Sustancia
Nombre Organismos inhibidos Substrato Indicador de ph Apariencia de colonias
favorecidos inhibitoria
Algunos grampositivos Fermentadoras de la lactosa: rosas o rojas.
MacConkey Enterobacterias permiten el crecimiento Sales biliares y Lactosa Rojo neutro No fermentadoras de la lactosa:
de Staphylococcus cristal violeta incoloras u opacas.
y enterococos
Lactosa y Fermentadoras de la lactosa: rojo intenso.
Sulfito de sodio
Endo Enterobacterias Grampositivos sulfito Fucsina básica No fermentadoras de la lactosa:
y fucsina básica de sodio grisáceas o incoloras.
Fermentadoras de la lactosa: café oscuro o
Eosina azul Eosina azul
Enterobacterias Grampositivos Lactosa y sacarosa Eosina y azul de metileno centro negro. E. coli verde metálico.
de metileno de metileno No fermentadoras: incoloras.
Grampositivos, Fermentadoras de la lactosa:
Agar verde Salmonella coliformes, y la Verde brillante Lactosa y sucrosa Rojo de fenol verde amarillo. No fermentadoras
brillante mayoría de las Shigellas de lactosa: rojas o rosa.
Sales biliares, Fermentadoras de la lactosa: rojas o rosas.
Salmonella Salmonella Grampositivos, citrato de sodio, No fermentadoras de lactosa: incoloras.
Lactosa Rojo neutro
y Shigella y Shigella coliformes. tiosulfito de sodio Productoras de H2S: rodeadas
y verde brillante de un precipitado negro.
Staphylococcus aureus: colonias con
Manitol sal halo amarillo alrededor.
Manitol Rojo de fenol
agar Staphylococcus epidermidis: colonias
pequeñas con zonas rosas alrededor.
En el área donde ha
crecido una colonia y
ha sido removida del
Es inhibida la mayoría medio, se agrega una gota
de los géneros bacterianos, Cloruro de púrpura de bromocresol.
Chapman Staphylococcus
con excepción de de sodio Lo mismo se hace en el Staphylococcus aureus: colonias amarillas
Stone Manitol,
Staphylococcus medio sin crecimiento. o anaranjadas.
fosfato dipotásico, Cualquier diferencia Staphylococcus epidermidis: colonias blancas
sulfato de amonio de color entre las gotas o incoloras.
indica que la bacteria
fermenta el manitol

Staphylococcus El mismo que en el agar

110 Chapman Stone
Medio de
Práctica 2 ❚ Cultivo de hongos y bacterias in vitro

Bacterias. Retrasa
prueba para Hongos Ciclohexamida y Dermatofitos.
el crecimiento de Dextrosa Rojo de fenol
dermatofitos dermatofitos cloranfenicol El medio cambia de color rojo a amarillo.
hongos contaminantes
(DTM)
47
48 Manual de Prácticas de Laboratorio de Bacteriología y Micología Veterinarias

Literatura consultada

]] Bailón L, et al. Atlas interactivo de Pruebas bioquímicas para identificar bacterias. Universidad
Nacional Autónoma de México, Facultad de Estudios Superiores de Zaragoza, 2004. 06/09/12.
En: http//es scribd.com/ doc/39602083/
]] Balows A, et al. Manual of clinical microbiology. 5a ed. Washington, D.C.: American Society for
Microbiology, 1995.
]] Carter GR. Diagnostic procedures in veterinary bacteriology and micology. 4a ed. Springfied, 
Illinois (EE.UU.): Charles C. Thomas Publisher, 1984
]] Cowan ST. Cowan and Steel´s manual for the identification of medical bacteria. Londres:
Cambridge University, 2003.
]] Jawetz E, et al. Medical microbiology. 25° ed. Lange Medical Publications: / Mc. Graw-Hill,
2010.
]] Pérez MJ, et al. Procedimientos de laboratorio para bacteriología y micología veterinarias.
México: UNAM, FMVZ, 1990.
]] Siembra y aislamiento. http://mail.fq.ed.uy/microbio/MGral/practico/siembra,html. 2010-02-02
]] Tipos básicos de medios de cultivo. http:/danival.org/medioscult. 2010-03-26
 Práctica 2 ❚ Cultivo de hongos y bacterias in vitro 49

Evaluación

1. Realice un dibujo del sembrado del medio de cultivo en caldo:

2. Realice un dibujo del sembrado del medio de cultivo SIM:

3. Realice un dibujo del sembrado de estría cruzada en placa de TSA:

4. Describa la morfología colonial que se observa en la placa de TSA, después de incubar la placa a
________°C durante ________horas e indique cómo se clasifica este medio, de acuerdo con su
uso: ________________.
50 Manual de Prácticas de Laboratorio de Bacteriología y Micología Veterinarias

5. En relación con lo anterior, ¿cuántas colonias observa? Describa la morfología colonial, el tipo de superficie,
bordes, tamaño, pigmento y elevación de las colonias observadas.

6. Realice un dibujo de lo que se observa después de incubar los medios MSA, VB, McC, Niger, describa por qué
suceden los cambios y señale su clasificación según su utilidad:

7. Realice un dibujo del sembrado del medio de cultivo de SDA:

8. Describa la morfología colonial que se observa después de incubar el medio de cultivo de SDA a _______°C
durante ________horas e indique cómo se clasifica este medio ____________________.

Firma del profesor de laboratorio: __________________________________________________________