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GORROD Y LA ALCAPTONURIA.
La orina era negra. Es uno de los primeros errores congénitos del metabolismo encontrados, de los que 8/17 casos era de la
descendencia de primos-hermanos. Esto se producía por la reacción del ácido homogenístico (HGO).Se establece así una
relación entre un gen y una actividad enzimática, obteniéndose una de las primera rutas metabólicas conocida; proteínas--
>AA-->HGO--X--> (?)
TEST DE DOMINACIA/RECESIVIDAD.
Sirve para ver si una mutación será recesiva o dominante. Para ello se cruzan dos individuos haploides, uno con la mutación
y otro sin ella; si la descendencia posee la mutación, esta será dominante. Si la descendencia no la posee, la mutación será
recesiva.
A x a(m) = A a(m)----------> Fenotipo NO mutante.
A(m) x a = A(m) a----------> Fenotipo SI mutante.
En individuos diploides, sería necesario un cruce con la mutación en homocigosis, Si el Fenotipo de la F1 es mutante,
entonces la mutación estaría en el dominante. Si no, lo estaría en el recesivo.
TEST DE COMPLEMENTACIÓN.
Se lleva a cabo para determinar si las dos mutaciones diferentes están en el mismo gen o en genes diferentes. Se cruzan dos
células haploides y se obtiene el fenotipo diploide.
Si las mutaciones están en el mismo gen (esto es, si el gen defectuoso en el mutante Arg1 es el mismo gen que está
defectuoso en el mutante Arg2) entonces el diploide resultante será incapaz de reproducirse en medio mínimo. Dado que
ambos mutantes portan mutaciones en el mismo gen, el diploide carece de una enzima funcional: el diploide no puede
reproducirse si no se le añade arginina a su medio.
Cuando Arg1 y Arg2 portan mutaciones en el mismo gen y el diploide resultante muestra un fenotipo mutante, entonces los
mutantes Arg1 y Arg2 no se complementan mutuamente. Se dice que están en el mismo grupo de complementación.
Si las mutaciones están en genes diferentes (esto es, si el gen defectuoso en el mutante Arg1 es un gen diferente al
defectuoso en el mutante Arg2), entonces el diploide resultante se reproducirá en medio mínimo. Cada mutante tiene una
mutación en un gen diferente; por lo tanto, el mutante posee todas las encimas funcionales y puede reproducirse en medio
mínimo.
Cuando Arg1 y Arg2 portan mutaciones en genes diferentes y el diploide resultante muestra un
fenotipo salvaje, entonces los mutantes Arg 1 y Arg2 se complementan mutuamente. Se dice que están
en grupos de complementación diferentes.
En general, las mutaciones en genes diferentes se complementan entre sí, se restaura la prototrofia en
el diploide (cada mutante rescata el defecto de los otros).
Se puede realizar un test de complementación entre diferentes haploides y crear una tabla:
“+” significa complementación, el diploide tiene fenotipo salvaje.
“-” significa no complementación, el diploide tiene fenotipo mutante.
Se observa que todos los mutantes son recesivos
con respecto al tipo salvaje.
Los mutantes 1 y 2 no se complementan: por lo
tanto, están dentro del mismo grupo de
complementación y se supone que están en el
mismo gen.
Los mutantes 3 y 4 no se complementan: por lo
tanto, están en grupos de complementación
diferentes, por lo que están en genes distintos.
En individuo DIPLOIDES es necesario hacer un cruzamiento prueba porque no se puede ver el genotipo directamente.
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Ambos casos son explicables por las RUTAS METABÓLICA, es decir, para que la mutación se vea en el fenotipo es necesario
que se cumpla la siguiente ruta; m1---->m2---->mutante. Si están en el mismo gen, la enzima no podrá sintetizar alguno de
los dos mutantes, por lo que se interrumpe la ruta.
EJEMPLO:
Como a+b muestra el fenotipo de la mutación b,
a iría antes que b. En el mismo caso con a+c. Mutaciones A B C ARG
Mutacion a - + + +
Enz a Enz b Enz c Mutación b - - + +
A------------>B----------->C----------->ARG Mutacion c - - - +
a+b - - + +
Si se corta, por ejemplo, b, entonces se acumulará B. a+c - - - +
De la misma forma pasaría con el resto de cortes.
TRANSFORMACIÓN BACTERIANA.
Frederick Griffith experimentó con S.pneumoniae para crear una vacuna contra ella.
Tenía dos cepas, una virulenta (IIS) y otra no virulenta (IIR). De este modo, si se le inyecta IIR a un ratón, éste sobrevivirá. Por
el contrario si se le inyecta la IIS morirá.
Griffith mató con calor a una cepa IIS, y al inyectarla al ratón, sobrevivió.
(Obviamente porque la bacteria está muerta).
Mezcló con IIR con la IIS; con ambas por separado el ratón sobrevivía, sin
embargo al juntarlas e inyectarlas, el ratón moría.
Aisló las bacterías de tipo IIS de la sangre del ratón muerto, y éstas que inyectó
muertas, ahora estaban vivas.
A ese "algo" que había en las IIS muertas que transformó a las IIR vivas en IIS, lo
llamo PRINCIPIO TRANSFORMANTE.
Existen tres tipos de hélices de ADN; Forma A, forma B, y forma Z (Imagen izq)
UNIONES INTRACATENARIAS:
La estructura de varios tipos de ARN viene determinada por la
complementariedad de bases, es el caso de la forma de "trebol"
del ARNt, la estructura presente en el ARNr, o la del ARNm.
Además también existen otras formas referentes al ADN, que
aparecen de forma ocasional, como los palíndromos (imagen), o
las uniones G-quadruplex, con cuatro guaninnas unidas entre sí
por puentes de hidrógeno.
La HIBRIDACIÓN se produce por complementariedad, hay dos tipos; SOUTHERN (ADN-ADN) y NORTHERN (ARN-ADN).
En la HIBRIDACIÓN IN SITU, las sondas de ADN se utilizan para determinar la localización celular o cromosómica de un gen.
ADN POLIMERASA I:
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Para que pueda actuar sintetizando una nueva
cadena de ADN es necesario que tenga un ADN molde,
un cebador, y dATP, dCTP, dGTP y dTTP.
En el caso de que queramos la unión de dos trozos de
cadena de ADN o de dos cebadores, necesitariamos la
enzima ligasa.
Los nucleótidos de la cadena nueva serían sintetizados
en sentido 5'-3', debiendo coincidir el extremo 3' de la
molde con el 5' de
la nueva cadena. Las cadenas son antiparalelas.
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MODELO SIGMA: Este modelo empieza por un corte en una de las cadenas. La extremidad 3'-OH servirá de cebador para
hacer una copia de la cadena complementaria. La polimerasa se unirá y utilizará esa cadena como molde. Por lo que en este
modelo no es necesario un cebador, es el mismo ADN el que actúa como tal.
MODELO THETA: Se tiene un origen de replicación y esta será bidireccional. Se llama así porque tiene la forma de esa letra.
Es necesario un cebador.
POLIMERASAS EN E.COLI:
- Polimerasa I (Kornberg y colaboradores, 1957):
- Eliminación de cebadores de ARN.
- Relleno de huecos entre fragmentos de Okazaki.
- Reparación.
- Polimerasas II, IV y V: Todas las ADN polimerasas sintetizan en sentido 5’ a 3’
- Reparación.
- Polimerasa III:
- Replicasa: síntesis de ADN durante la replicación
REPLICACIÓN EN EUCARIOTAS:
Existe mayor cantidad de ADN, con cromosomas lineales y cromatina, el tamaño del genoma es mayor comparado con
procariotas, para combatir todas estas diferencias existen múltiples origen de replicación.
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Además los fragmentos de Okazaki son más cortos en eucariotas superiores por los nuecleosomas en el ADN, la velocidad
de las polimerasas es menor, y existen más niveles de regulación.
LA TELOMERASA:
APLICACIONES DE LA REPLICACIÓN:
-SECUENCIACIÓN:
-REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR): Amplificar un fragmento específico de ADN, Requerimientos;
ADN molde, dNTP, Cebadores complementarios de los extremos, Polimerasa termorresistente (Taq).
Protocolo: Desnaturalizar a 95ºC, Enfriar para aparear cebadores, Polimerizar a 72ºC, Repetir ciclos de
desnaturalización, apareamiento y síntesis.
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TEMA 3: EXPRESIÓN GÉNICA.
FLUJO DE INFORMACIÓN; EL DOGMA CENTRAL.
EXPERIMENTO DE PULSO Y CAZA: Se marca uracilo con radiactividad, en el mismo cultivo tras varios pasos, obtendremos
uracilo normal y se deja crecer el organismo durante un largo periodo de tiempo. Este proceso se denomina Pulso. Tras esto,
comenzamos la Caza, en la que se sigue el procedimiento de la marca que pusimos añadimos sin añadir nuevas marcas.
o RESULTADOS: Tras infectar E.coli con el fago T2 se produce una explosión de síntesis de ARN marcado tras el pulso.
Pero tras la caza no está marcado. La composición del ARN después de la infección es similar a la del ADN del fago.
o CONCLUSIONES: El ARN se sintetiza rápidamente, tiene una vida media muy corta y se sintetiza a partir del ADN.
Con otro experimento de pulso y caza muy similar, se ve que durante el curso la mayor parte de la marca está en el núcleo, y
tras la caza el ARN está en el citoplasma. La conclusión aquí es que el ARN se sintetiza en el núcleo y posteriormente se
transporta al citoplasma.
RESULTADOS: El ARN del fago se asocia a los ribosomas pesados y no hay ribosomas ligeros.
CONCLUSIONES: La síntesis de proteínas del fago tiene lugar en ribosomas que ya estaban sintetizados antes de la infección.
La información no esta en los ARN ribosómicos, sino en otro tipo de ARN.
TIPOS DE ARN:
INFORMATIVO: Se traduce a proteínas (ARNm) y FUNCIONAL: No se traduce (ARNr, ARNt, Otros...)
Ciertos ARN no se replican o se reotrtranscriben.
ARN POLIMERASA:
Polaridad 5'--->3'
ADN molde.
Ribonucleótidos trifosfatos (ATP, CTP,
GTP, UTP)
Cadena simple.
No necesita cebador.
Sin actividad correctora.
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FASES DE LA TRANSCRIPCIÓN EN PROCARIOTAS:
INICIACIÓN, ELONGACIÓN, Y TERMINACIÓN.
En procariotas el ARNm es policistrónico, lo que quiere decir que una sola molécula de ADN puede codificar más de una
proteína., acoplamiento transcripción-traducción.
El ARN polimerasa son 4 subunidades, dos alfa y dos beta. Esto se unen al facto sigma formando una holoenzima que se
unirá al promotor y comenzará la transcripción, en un sitio concreto denominado "sitio +1". Todo lo que está detrás de él
llevara el signo negativo, y todo lo de detrás tendrá el positivo (contando por nucleótidos).
Al principio, en el 5', habrá una secuencia llamada "no traducida", al igual que el trozo en el 3' terminal del ARN.
Diez nucleótidos detrás del +1 (-10) se encuentra una secuencia que siempre es muy parecida, al igual que a 35
nucleótidos (-35), llamadas secuencia consenso.
UTR= NO
TRADUCIA
INICIACIÓN: El ARN polimerasa rastrea la doble hélice en busca del promotor y se une a ella, entonces se forma un
complejo cerrado y se abrirá una pequeñita burbuja en el ADN. Cuando se inicia la síntesis el factor sigma se va.
ELONGACIÓN: Una vez iniciada las transcripción, el factor sigma se suelta y el núcleo central de la ARN polimerasa
comienza a sintetizar ARN en el sentido 5`- 3` a partir de los ribonucleótidos trifosfato libres. A la vez, la región del ADN
que se está transcribiendo se va desenrollando. La tasa de elongación es aprox 50 nucleótidos por segundo. La cadena no
molde es la cadena codificante, ya que la molde será complementaria de la que se está sintetizando.
TERMINACIÓN: Gracias a un terminador intrínseco, en la que existe una secuencia que hace que se deje de transcribir. Es
palindrómica, en el ARNm, haciendo que se forme una especie de horquilla. Justo después de ese trozo de la secuencia
hay una otro rico secuencia rica en A en el ADN (U en el ARNm) que hará que se ralentice la transcripción, haciendo que
se desenganche el ARNm del molde y la polimerasa también.
Otro tipo de terminación es el Factor Rho, que sigue a la ARN polimerasa hasta que esta encuentre una secuencia
complicada de transcribir, entonces el Rho la alcanzará. Rho hará que el ARNm se deshibride del ADN, haciendo que se
suenten él y la polimerasa.
TRANSCRIPCIÓN EN EUCARIOTAS:
• La transcripción ocurre en el núcleo, la traducción en el citoplasma.
• Los ARNm se procesan antes de la traducción.
• No hay acoplamiento transcripción-traducción.
• Los ARNm eucarióticos son monocistrónicos.
• Hay tres polimerasas de ARN.
• Numerosos factores de transcripción implicados, así como potenciadores y silenciadores.
• Terminación peor definida que en procariontes.
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PROCESAMIENTO DEL PRE-ARNm:
CAPERUZA: Guanina con un grupo metilo que se une con un enlace
con tres P a otro igual, unión 5'-5'. Sirve de protección frente a
nucleasas, transporte núcleo-citoplasma, y ayuda en la traducción.
COLA DE POLI-A: 125-200 A, donde existe una secuencia consenso
a 11-30 nucleótidos antes del corte con una exonucleasa , el trozo
de ADN entre la secuencia y el corte se degradará. Tras este trozo
aparecerá la cola de poli-A.
EXONES: regiones de un gen que permanecen en el ARNm maduro
y contienen la información para producir la proteína.
INTRONES: regiones de un gen que separan a los exones y no
forman parte del ARNm maduro. (Más importante es el madurosoma")
MADURACIÓN DEL PRE-ARN: Se han encontrado secuencias que se repiten en los intrones, como G-U que aparece siempre
tras un exón, o un punto cercano al final donde hay un A que se encuentra en todos los intrones (punto de ramificación), así
como un A-G al final del intrón.
La
MADURACIÓN ALTERNATIVA: Depende de cómo se reconozcan los sitios de corte-empalme, gracias a una alta regulación,
dependiendo del tipo de célula por cada intrón que se elimina pueda llevarse consigo un exón, dando lugar a poder procesar
100.000 proteínas diferentes según las necesidades de la célula.
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INTRONES AUTOPROCESABLES: Para que los exones puedan ligarse es necesario que los intrones desaparezcan;
GRUPO I: Un cofactor de guanosina G que no es parte del ARN se asocia con el sitio activo, y su extremo 3' participa en una
reacción con el extremo 5 del intrón. Se libera una molécula lineal.
GRUPO II: Se libera una molécula en lazo. El stio de corte y empalme en el extremo 5'se cortará y el trozo que queda hara un
lazo antes de llegar al sitio de corte y empalme 3', rompiéndose la cadena y eliminándose el intrón.
HIBRIDACIÓN IN SITU:
Las sondas de ADN se utilizan para determinar la localización celular o cromosoma de un gen o su
producto.
SOUTHERN BLOT: Detectar la presencia de una secuencia de ADN en una mezcla compleja de este ácido nucleico. Para ello,
emplea la técnica de electroforesis en gel de agarosa con el fin de separar los fragmentos de ADN de acuerdo a su longitud
y, después, una transferencia a una membrana en la cual se efectúa la hibridación de la sonda.
NORTHERN BLOT: Es una técnica de detección de moléculas de ARN de una secuencia dada dentro de una mezcla compleja
Para ello, se toma la mezcla de ARN y se somete a una electroforesis en gel a fin de separar los fragmentos en base a su
tamaño. Tras esto, se transfiere el contenido del gel, ya resuelto, a una membrana cargada positivamente en la cual se
efectúa la hibridación de una sonda molecular marcada radiactiva o químicamente.
WESTERN BLOT: Es una técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una muestra determinada De esta
forma se puede estudiar la presencia de la proteína en el extracto y analizar su cantidad relativa respecto a otras proteínas.
Un código genético solapante daría lugar a que un cambio en un nucleótido podría originar un cambio en tres aa
adyacentes, eso es falso, por lo que se sabe que el código genético es NO SOLAPANTE.
El código genético también es DEGENERADO, ya que par 20 aa existentes existen 64 tripletes posibles.
En un codón se sabe que hay tres nucleótidos en un AA porque existen 4 nucleótidos y 20 aa en total, para demostrarlo;
o Se usaron mutantes en un locus de un fago, del cual se conocía bastante información. Las muraciones eran de
deleción, inserción y supresores intragénicos. Por ejemplo, en deleción e insercción, al meter o quitar una base
se cambia toda la pauta de lectura, por lo que cambian todos los aa a partir de la mutación.
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Los supresores intragénicos eran dos mutaciones, una que anulaba a la otra dentro del mismo gen, sin ser una
reversión la una de la otra. Por procesos de entrecruzamientos se pueden separar la mutación y el supresor del
gen. Así, a partir de combinaciones de mutaciones de inserción o deleción se pudo interpretar y saber que el
código de tres letra o múltiplo de tres eran los nucleótidos necesarios para un AA.
GRUNBERG-MANAGO Y SEVERO OCHOA: La polinucleótido fosforilasa permite la síntesis in vitro de ARNm sin molde, al
añadirle un exceso de rNDP.
NIRENBERG: Un sistema de síntesis de proteínas libres de células permite obtener la proteína correspondiente al ARNm
previamente sintetizado. Utilizó 20 aa, 19 normales y 1 radiactivo en un tubo, añadiendo en cada tubo diferente un aa
distinto radiactivo también. En los tubos introdujo extracto de E.Coli y RNA poli-U. Luego purificó la proteína y midió la
radiactividad, observando que en uno de los tubos había casi 40.000 cpm/mg prot (el que tenía marcado el Phi) mientras
que el resto solo tenía 70 cpm. La CONCLUSIÓN es que, en ese caso, la Phi estaba formada por tripletes de U.
HIPÓTESIS DEL TAMBALEO: Permite a un mismo ARNt leer distintos codones para un mismo aminoácido. Los ARNt que
forman el anticodoon tienen una posición de tambaleo que lo permite en la primera posición de su extremo 5'.
TRADUCCIÓN:
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Metilinosínico (Im) y metilguanílico (Gm).
Pseudouridílico. ()
Ribotimidílico. (T)
Hidroutidílico (Uh)
Además, debe adherirse pCpCpA al extremo 3'.
FASES DE LA TRADUCCIÓN:
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1. INICIACIÓN: Secuencia de Shine-Dalgarno en procariotas. La iniciación procariótica es el resultado de la asociación
de las subunidades pequeña y grande del ribosoma y el acoplamiento del primer aminoacil-ARNt (fmet-ARNt) con
el codón de iniciación mediante el emparejamiento de basesanticodón-codón.
En procariotas el primer codón es AUG (a veces GUG) y la secuencia de Shine-Dalgarno es antes de ese codón. En
ARNt iniciador lleva formilmetionina. Sin embargo, en eucariotas el primer codón siempre es AUG y la secuencia se
llama Secuencia de Kozak, que se encuentra en torno al AUG. El ARNt iniciador lleva metionina.
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