Actual. Osteol 2014; 10(1): 85-90.
Internet: http://www.osteologia.org.ar
CONTROVERSIAS / Controversies
CONTROVERSIAS EN LA MEDICIÓN DE 25-HIDROXIVITAMINA D
Erich Fradinger*
Instituto de Investigaciones Metabólicas, Buenos Aires, Argentina.
Resumen
En los últimos años ha habido un impor-
tante incremento en la demanda a los labo-
ratorios de determinaciones de vitamina D.
Como consecuencia se han desarrollado va-
rios ensayos automatizados para tratar de cu-
brir esa demanda, reemplazando los ensayos
manuales. Los ensayos automatizados afron-
tan dificultades técnicas, como la naturaleza
hidrofóbica de la 25-hidroxivitamina D, múl-
tiples compuestos relacionados circulantes,
fuerte afinidad a proteínas, linealidad de los
ensayos, etc. La utilización de un método de
referencia internacional, materiales estándar
de referencia y procedimientos específicos
proveen los medios para que los fabricantes
estandaricen sus métodos. No hay duda de
que los últimos ensayos automatizados y cro-
matográficos han mejorado sus performan-
ces pero aún existen discrepancias, lo que
obliga a analizar cada ensayo con precaución.
Dados los múltiples problemas que afectan el
desempeño de los ensayos de 25-hidroxivi-
tamina D sería esencial que los laboratorios
implementaran estrictos procedimientos de
control de calidad. La participación en con-
* Correo postal: Instituto de Investigaciones Metabólicas, Buenos Aires, Argentina. Libertad 836 1er piso.
CABA. Correo electrónico: efradinger@idim.com.ar
Actualizaciones en Osteología, VOL. 10 - Nº 1 - 2014
troles de calidad externos es también esen-
cial, así como recomendable que los pacien-
tes sean monitorizados en el mismo laborato-
rio y con la misma metodología.
Summary
CONTROVERSIES IN MEASURING
25-HYDROXYVITAMIN D
There has been an important increase in
demand for the laboratory assessment of
vitamin D. As a consequence, a number of
automated assays have been developed to
cope with that demand, replacing manual
techniques. Automated assays confront with
technical difficulties such as hidrophobic
nature of 25-hydroxyvitamin D, multiple re-
lated compounds in serum, strong binding
to proteins, assay linearity, etc. The use of
an International Reference Method, Stan-
dard Reference Materials and specific pro-
cedures provide the means for manufactur-
ers to accurately standardize their methods.
There is no doubt that the latest automated
85
 Fradinger E: Medición de 25-hidroxivitamina D
and chromatographic assays have improved
their performances, but discrepancies are still
present so that each assay must be analyzed
carefully. Given the multiple problems affect-
ing the performance of 25- hydroxyvitamin D
assays it would be essential that laboratories
implement strict quality control procedures.
Participation in external quality assessment
schemes is also essential and it is recom-
mended that each patient must be followed
always at the same laboratory and with the
same methodology.
Introducción
La vitamina D3 (colecalciferol) se sintetiza
en piel a partir de su precursor 7-dehidroco-
lesterol por acción de los rayos ultravioleta
tipo B, o se absorbe a nivel intestinal por in-
gesta. Circula en sangre unida a su proteína
ligadora (DBP). En el hígado es hidroxilada en
carbono 25 por la 25-hidroxilasa (enzima que
no tiene regulación homeostática) generando
25-hidroxivitamina D (25OHD). Esta molécula
tiene vida media larga y es utilizada como in-
dicador del estado nutricional de vitamina D.
La vitamina D2 (ergocalciferol) es de ori-
gen vegetal, se absorbe a nivel intestinal por
ingesta y se hidroxila de forma similar a la vi-
tamina D3.
La 25OHD también circula unida a DBP
y en riñón es hidroxilada en carbono 1 por
la enzima 1 alfa-hidroxilasa generando la
1,25-dihidroxivitamina D. Si bien esta última
es el metabolito activo, no se lo utiliza como
marcador de estado nutricional por su vida
media corta y porque su síntesis está estric-
tamente regulada por la hormona paratiroi-
dea, el calcio, el fósforo y el FGF23.
El primer ensayo de 25OHD fue desarro-
llado por Haddad y col. en 19711; usaba como
ligando la DBP y 25OHD tritiada como traza-
dor, aislando la 25OHD con cromatografía a
baja presión. Belsey y col.2 lo simplificaron
eliminando el paso cromatográfico (lo que se
llamó ensayo directo), pero este tenía muchos
86
problemas de matriz y daba como resulta-
do valores más elevados por interferencias
de metabolitos que no eran purificados en la
cromatografía. Este dato no es menor, ya que
trabajos muy conocidos y citados a lo largo
de los años usaron este método de análisis.3
El primer radioinmunoensayo que utilizó un
anticuerpo específico para 25OHD2 y 25OHD3
fue desarrollado por Hollis usando como tra-
zador 25OHD tritiada.4 Luego se modificó
usando 25OHD yodada como trazador.5
Este ensayo se ha usado durante años
para informar el estado nutricional de vitami-
na D internacionalmente y con él se han defi-
nido los actuales niveles de corte de deficien-
cia o suficiencia de vitamina D.6
Paralelamente también se desarrollaron
técnicas como cromatografía líquida de alta
eficacia (HPLC) y cromatografía líquida aso-
ciada a espectrometría de masa (LC-MS/MS).
Ambos métodos pueden cuantificar por se-
parado la 25OHD2 y la 25OHD3.
Con el avance del conocimiento científico
asociando niveles circulantes de 25OHD a ac-
ciones clásicas (metabolismo fosfocálcico) y no
clásicas (enfermedad cardiovascular, diabetes,
esclerosis múltiple, cáncer de mama, de colon,
de próstata, etc.), las solicitudes de determina-
ciones de 25OHD a los laboratorios se ha in-
crementado en niveles difíciles de manejar con
técnicas manuales. Por eso se han desarrollado
ensayos comerciales adaptables a plataformas
automáticas de más fácil acceso para facilitar
la tarea a los laboratorios. La mayoría de estos
ensayos usan anticuerpos coespecíficos para
25OHD2 y 25OHD3 y sus principales caracterís-
ticas se hallan bien descriptas.7
Las controversias que rodean la medición
de 25OHD están directamente relacionadas
con los problemas que existen para deter-
minarla en el laboratorio: su naturaleza alta-
mente hidrofóbica, su fuerte unión a la DBP,
la presencia de múltiples metabolitos de vita-
mina D que pueden interferir en los ensayos,
la estandarización adecuada, la linealidad de
los ensayos, etcétera.
Actualizaciones en Osteología, VOL. 10 - Nº 1 - 2014
 Fradinger E: Medición de 25-hidroxivitamina D
Disociación de la 25OHD de su proteína
ligadora
Este paso es clave en el ensayo ya que
se requiere para el análisis que la 25OHD no
esté unida a su proteína ligadora. Con el ra-
dioinmunoanálisis (RIA) la precipitación de la
muestra con acetonitrilo asegura la liberación
de la 25OHD y el ensayo se lleva a cabo en
un tubo distinto de aquel en el cual se hace
la separación.
En los ensayos automatizados, cada pro-
veedor tiene su propio sistema de liberación
(cambios de pH, reactivos en concentracio-
nes no divulgadas, etc.) y aseguran que la
disociación de la 25OHD es total. Cabe des-
tacar aquí que el ensayo se hace en la misma
copa en la que se realiza la disociación, lo que
hace que sea susceptible de interferencia con
otros compuestos. Un estudio muy interesan-
te demuestra que la misma DBP puede inter-
ferir en los ensayos automatizados al obser-
varse una relación inversa entre concentra-
ción de DBP y 25OHD.8 Es decir, no todos los
ensayos existentes podrían utilizarse en pa-
cientes con distintas patologías en las que se
encuentre alterada la concentración de DBP.
Tener muy en cuenta a los pacientes hemo-
dializados, pacientes críticos y embarazadas.
Especificidad
Este problema también es central. Resulta
indispensable que el anticuerpo reconozca a
la 25OHD3 y la 25OHD2 ya que en varios paí-
ses medican a los pacientes con vitamina D2.
Cruzamientos menores con 25OHD2 pueden
subestimar los valores de 25OHD total. El
caso más conocido fue el del inmunoensayo
automatizado de Nichol’s, que al poco tiempo
de comercializado tuvo que ser dado de baja
por subestimar la concentración de 25OHD2.
Todos los ensayos (RIA y automatiza-
dos) cruzan 100% o más con el metabolito
24, 25 (OH)2 D cuyos valores oscilan entre 10
y 15% del valor total de 25OHD. Esto obvia-
mente sobreestima los valores de 25OHD total.
Los epímeros son moléculas con estruc-
Actualizaciones en Osteología, VOL. 10 - Nº 1 - 2014
tura idéntica pero con configuración este-
reoquímica diferente. Se ha informado que el
C-3 epi-25OHD circula tanto en niños como
en adultos. El cruzamiento con este com-
puesto está descripto según los fabricantes7
y la mayoría de los ensayos basados en
LC-MS/MS cruzan con él.
Los isóbaros son moléculas con el mis-
mo peso molecular que la 25OHD y que
interfieren específicamente en los ensayos
LC-MS/MS, ya que generan pares ióni-
cos con la misma relación carga /masa
que la 25OHD. Ejemplos de isóbaros
son el 7a-hidroxi-4-colesten-3-uno (precur-
sor de ácido biliar) y el 1a-OHD3, fármaco uti-
lizado en pacientes renales crónicos.9
Estandarización
Según informes recientes del Programa de
Control de Calidad Externo DEQAS (Vitamin
D External Quality Assessment Scheme), se
ha verificado una mejora en la precisión en-
tre todas las metodologías utilizadas en los
laboratorios participantes.10 Sin embargo,
esto no implica una mayor exactitud en los
resultados. Para avanzar en el tema se nece-
sitan un método de referencia internacional,
materiales de referencia estándar (SRM) y
procedimientos específicos para asegurar la
estandarización. Estos temas ya han sido pu-
blicados y explicados en detalle.11-13
El SRM 972 ha sido suplantado por el SRM
972a por problemas de conmutabilidad para
los inmunoensayos, pero el SRM 2972 (cali-
bradores en solución alcohólica) sigue vigente.
Un problema muy común en el análisis
bioquímico de esteroides es la preparación
de los estándares utilizados en cada ensa-
yo. Algunos se presentan como “basados
en suero humano” (“human serum based”),
preparados con sueros a los que se les efec-
tuó la remoción de los esteroides con carbón
activado, técnica que requiere la acidificación
de estos. Esto crea una matriz distinta del
suero del paciente y puede ser otra causa de
diferencias entre métodos.
87
 Fradinger E: Medición de 25-hidroxivitamina D
Para proseguir con el proceso de mejora
continua, el NIH (National Institute of Health)
en colaboración con el NIST (National Insti-
tute for Standards and Technology), el CDC
(Centers for Disease Control and Prevention)
y la Universidad de Ghent en Bélgica han lan-
zado el Programa de Estandarización de En-
sayos de vitamina D (VDSP), con el que se es-
pera que todos los proveedores de reactivos
y laboratorios con ensayos propios (in-house)
logren una adecuada estandarización.14
Ensayos
La literatura en los últimos dos años es
abundante en cuanto a comparaciones entre
los recientes ensayos automatizados vs. RIA o
vs. HPLC o vs. LC-MS/MS.15-23 Es esperable que
por todo lo planteado anteriormente se com-
pruebe variabilidad entre los ensayos automati-
zados, variabilidad con respecto a LC-MS/MS,
variabilidad en respuesta a los SRM, distinta
linealidad, etc. Diferentes cálculos estadísticos:
regresiones Passing-Bablock u otras, análisis
de Bland-Altman, coeficientes de correlación
de concordancia (CCC), análisis Kappa, con-
firman esas diferencias. Es imprescindible que
cada método sea evaluado con precaución, ya
que dos métodos pueden ser comparables en
ciertos rangos de concentración de 25OHD y
no en otros rangos. Las diferencias entre méto-
dos ponen en duda el uso de un único valor de
corte y sugieren que la prevalencia de déficit es
dependiente del ensayo. Es decir, un paciente
puede ser clasificado como suficiente o insu-
ficiente según el método que se use. Más aún,
debido a estas diferencias se ha propuesto cal-
cular un valor de corte específico para cada en-
sayo, lo que dificultaría también el seguimiento
del paciente en el tiempo, ya que el laboratorio
puede cambiar el método.
Es muy interesante observar el comporta-
miento de los ensayos en programas condu-
cidos por organismos especializados. El NIST
instauró el “Vitamin D Metabolites Quality
Assurance Program” (VitDqap). En forma gra-
tuita, los laboratorios pueden inscribirse, re-
88
cibir las muestras del programa y evaluar sus
resultados comparando con valores medidos
en el NIST con métodos de referencia.24 Para
casi todos los SRM enviados por VitDqap,
los laboratorios que usan inmunoensayos y
los que usan LC-MS/MS informan resultados
más altos que el NIST; muy probablemente
este desvío se deba a los factores anterior-
mente expuestos.
La clínica
Con todas las fuentes de variables expues-
tas, la pregunta que puede surgir en la comu-
nidad médica es qué hacer ante un resultado
de vitamina D. Por supuesto que lo ideal es
que los proveedores continúen (y lo hacen)
mejorando sus ensayos para lograr mayor pre-
cisión, mayor exactitud, trazabilidad a méto-
dos y utilización de estándares de referencia,
reformulación de sus curvas de calibración,
disminución de la variabilidad lote a lote, etc.
Se debe considerar que todo valor que se ob-
tiene de una técnica analítica es solo una esti-
mación del valor real, debido a la incertidum-
bre de la medida.25 Si hablamos de un valor
de corte, siempre es importante conocer la
incertidumbre alrededor de ese valor de corte.
Mientras tanto, las Guías Clínicas de la Endo-
crine Society 6 sugieren textualmente: “todas
las metodologías son adecuadas si uno apun-
ta a valores más altos que los actuales puntos
de corte”. Esto concuerda con Cavalier y col.,
26
en un trabajo de 2009 en el cual (por la fe-
cha en que se realizó) no se evaluaron todos
los ensayos hoy disponibles. Considerando la
incertidumbre de la medida, sugirieron que el
valor “real” de un paciente va a ser mayor de
32 ng/ml, si el valor medido es mayor de 40
ng/ml. Textualmente: “si el médico considera
que el status adecuado de vitamina D es de-
finido como mayor a 32 ng/ml, deberá asegu-
rarse que el paciente tenga un valor mayor a o
igual a 40 ng/ml”. En un editorial reciente, un
reconocido experto en el tema 27 sugiere que
no hay mayores problemas (desde el punto de
vista clínico) si los informes del control de cali-
Actualizaciones en Osteología, VOL. 10 - Nº 1 - 2014
 Fradinger E: Medición de 25-hidroxivitamina D
dad de cada laboratorio entran en la media del
control externo DEQAS, sumado a un estricto
control interno (CV interensayo <10%).
En esta misma sección y revista, Masta-
glia y col.28 describieron perfectamente las
diferencias de criterios entre el IOM (Institu-
te of Medicine) y la CMI (Comunidad Médi-
ca Internacional especializada en vitamina D)
acerca de los niveles adecuados de vitamina
D. Un análisis muy detallado sobre la base de
Medicina Basada en la Evidencia se ha publi-
cado recientemente.29 Asimismo, Sánchez y
col.3 publicaron la Guía práctica de diagnós-
tico, prevención y tratamiento de la hipovita-
minosis D, donde también se analizan estos
temas. Cuando se habla de valores de corte
tan definidos (20 ng/ml o 30 ng/ml) sería muy
importante tener en cuenta todos los factores
aquí enunciados.
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Actualizaciones en Osteología, VOL. 10 - Nº 1 - 2014
Cabe hacerse otra pregunta: con el adve-
nimiento del método de referencia LC-MS/
MS establecido por organismos especializa-
dos, ¿no sería necesario reevaluar el corte de
30 ng/ml? ¿o el de 20 ng/ml? Es una tarea ex-
tremadamente difícil, ya que habría que vol-
ver a estudiar la 25OHD poblacional (medida
por ese método) y relacionarla con absorción
de calcio, supresión de hormona partiroidea,
densidad mineral ósea, reducción del riesgo
de caídas y fracturas, riesgo de osteomalacia,
acciones no clásicas, etcétera.
Conflicto de intereses
El autor declara no tener conflictos de
intereses.
(Recibido: enero 2014.
Aceptado: marzo 2014)
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