VALIDACIÓN DE MÉTODOS CON

RESPUESTA BINARIA

Subgerencia de Análisis y Diagnóstico

Grupo de Gestión de Calidad analítica,

BPL y Registro de Laboratorios

Preparado por: Luz Myriam Moncada R.

Mayo 2016
 Contenido
• Referentes
• Etapas de la validación
• Escalas de medición
• Métodos analíticos (cualitativos y cuantitativos)
• Atributos o características de los métodos
• Análisis de resultados binarios (Cualitativos)
• Análisis de resultados continuos (Cuantitativos)
• Zona umbral e Incertidumbre de medición
• Determinación de puntos de corte.
 Referentes técnicos

• OIE. Principios y métodos de validación de las pruebas de diagnóstico de las enfermedades

infecciosas. Manual de la OIE sobre animales terrestres 2014, capítulo 1.1.5.
• OIE. Principios y métodos de validación de las pruebas de diagnóstico de las enfermedades
infecciosas. Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2014, capítulo 1.1.2.
• OIE. Directrices sobre validación. Manual de pruebas de diagnóstico de las vacunas para los animales
terrestres 2014,sección 3.6
• Gestión de calidad en los laboratorios de pruebas veterinarias. Manual de la OIE sobre animales
terrestres 2012, capitulo 1.1.3.
• ISO/IEC 17025:2005. Requisitos generales para la competencia de laboratórios de ensayo y
calibración 2005.
Criterios para Desarrollo
Validación y verificación Idoneidad para el propósito

de Métodos Reproducibilidad

Especificidad diagnóstica

Sensibilidad diagnóstica

Definición de Umbrales

Especificidad analítica

Sensibilidad analítica

Repetibilidad

Estandarización
Optimización

Selección del método

Definición del propósito

 Optimización de métodos
• Es el proceso por el cual los parámetros físicos, químicos o biológicos
más importantes de un ensayo se evalúan y se ajustan para asegurar
que las características de desempeño son las mejores para el objeto de
la aplicación.
• RANGO:
• MUESTRAS DE REFERENCIA: por lo menos 3 muestras de referencia
• NEGATIVAS
• POSITIVAS DÉBILES
• POSITIVA EN ZONA UMBRAL
• POSITIVAS FUERTES
• REACTIVOS QUÍMICOS, COMPONENTES DEL KIT, SOLUCIONES BUFFER:
DEFINIR PUREZA Y CALIDAD
• pH, molaridad u otra expresión de concentración
• Reactividad cruzada en productos biológicos
 Optimización de métodos M
É
T
O
D
O
Especificaciones Especificaciones Definir items de control
críticas y críticas y Criterios
cumplimiento D
• Reactivos • Criterios de aceptación y
de desempeño • Controles internos rechazo del lote de análisis O
• Equipos • MRC • Criterios para interpretación C
de resultados
• Instrumentos • ROBUSTEZ U
M
E
N
Selección T
Implementación en el laboratorio
Optimización establece especificaciones críticas del método
A
Desarrollado in house D
De una fuente externa O
 ESCALAS DE MEDICIÓN

• Binaria (dicotómica): Positivo o negativo, porque así es

como se presenta el resultado, o positivo/negativo en un
valor umbral (de corte) determinado cuando los resultados
se midan en una escala ordinaria o continua.
• Continua: Teóricamente es posible un número infinito de
valores de medición, en función del sistema de medición,
por ejemplo, la densidad óptica o el porcentaje de valores
positivos en una prueba de ELISA, o los valores de ciclo
umbral en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo
real
• Ordinal: Se mide en una escala con valores discretos en que
valores más altos suelen indicar más analito, por ejemplo,
títulos de neutralización vírica en el suero.
 ALGUNAS CARACTERISTICAS DE LOS METODOS

CUALITATIVO CUANTITATIVO
1. Análisis que tiene por objeto 1. Análisis que tiene por objeto
identificar los componentes de una determinar la cantidad de cada
sustancia. componente de la sustancia.
2. Busca establecer la presencia o 2. Busca determinar la concentración
ausencia de un analito del analito
3. Resultado de una observación 3. Resultado de una medición
natural no controlada, subjetiva controlada, objetiva
4. Próxima a los datos “perspectiva 4. Apartada de los datos “perspectiva
de inclusión” de exclusión”
5. Orientada al proceso 5. Orientada al resultado
6. Información válida, real, rica y 6. Información fiable. Replicable
profunda
Expresión de resultados de análisis
Resultado valor binario
(SI/NO); (+/-)

Esperado
X X O O X
X O O X O
Resultados Análisis O O X X O

Obtenido
Cualitativo O O X X X
O X O O X
X O O X X
X X X O O
X O O O O

Probabilidad de error
asociado a la decisión
 REPRESENTACIÓN IDEAL DE UN RESULTADO
CUALITATIVO

Respuesta ideal para un resultado cualitativo

12
Concentración Resultados Resultados
ng/g positivos negativos 10

Número resultados
1 150 10 0
8
2 120 10 0
3 100 10 0 6
4 90 10 0
4
5 80 10 0
6 80 0 10 2
7 75 0 10
8 50 0 10 0
0 20 40 60 80 100 120 140 160
9 25 0 10
Concentración ng/g
10 0 0 10
Positivos Negativos
 REPRESENTACIÓN REAL DE UN RESULTADO
CUALITATIVO
Respuesta para un método cualitativo
12
Concentración Resultados Resultados
ng/g positivos negativos 10
1 200 10 0

Número resultados
2 150 10 0 8
3 120 10 0 6
Sospechoso o
4 100 10 0 Zona umbral
5 90 9 1 4
6 80 1 9
2
7 75 0 10
8 50 0 10 0
9 25 0 10 0 50 100 150 200 250
-2
10 0 0 10 Concentración ng/g

positivos negativos
Expresión de resultados de análisis
Resultado análisis
Cuantitativo

VALOR
OBTENIDO

Valor directo o estimado Valor de Incertidumbre

por cálculo matemático േ asociado a la dispersión
como verdadero del resultado
REPRESENTACIÓN DE UN RESULTADO CUANTITATIVO

Respuesta para un método cuantitativo

Concentración Resultados Resultados
ng/g positivos negativos 12
1 150 10 0 10
2 120 10 0

Número resultados
3 100 10 0 8
Sospechoso o
4 90 6 4 6 Límite de Zona umbral
5 80 5 5 detección
4
6 70 4 6
7 60 3 7 2
8 52 0 10 0
9 25 0 10 0 20 40 60 80 100 120 140 160
10 0 0 10 -2
Concentración ng/g

Positivos Negativos
 ATRIBUTOS A VERIFICAR
Atributos Medición Continua Medición binaria
Ensayo Cuantitativo Ensayo Cualitativo
Sensibilidad Límite de detección Sensibilidad analítica ASe
Especificidad Selectividad/especificidad Especificidad analítica ASp
Repetibilidad Coeficiente de variación (CV) Coeficiente de Kappa
Precisión intermedia
Coeficiente de variación (CV) Coeficiente de Kappa
(reproducibilidad lab)
Reproducibilidad
Coeficiente de variación (CV) Coeficiente de Kappa
entre laboratorios
Punto de corte ASe ± Incertidumbre No aplica
Incertidumbre Asociada a zona umbral No aplica
 ATRIBUTOS A VERIFICAR OIE

SENSIBILIDAD •ENSAYOS DIRECTOS

•Es la cantidad más pequeña del analito en una muestra
que puede ser detectado por ensayo directo en al menos
ANALÍTICA el 50% de las réplicas en cada dilución, en una serie de
diluciones seriadas del analito en la matriz. N° de copias
de un genoma, dosis infecciosa, UFC,
ASe

• ENSAYOS INDIRECTOS
LÍMITE DE • Es la menor cantidad de anticuerpos detectada,
usualmente la penúltima dilución de la muestra en la
cual la respuesta del analito no se distingue de la
DETECCIÓN actividad de una muestra control negativa
 ATRIBUTOS A VERIFICAR OIE

ESPECIFICIDAD • Grado con el cual el ensayo es capaz de distinguir el

analito objeto y otros componentes que pueden ser
detectados por el ensayo
ANALÍTICA • SELECTIVIDAD,
• INCLUSIVIDAD,
ASp • EXCLUSIVIDAD
 SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD EN
RESULTADOS BINARIOS
• Sensibilidad: Proporción de muestras positivas (con el objeto de
estudio presente), identificadas correctamente por la prueba
• Especificidad: Proporción de muestras negativas (sin el objeto de
estudio), identificados como tales por la prueba
• Exactitud: Proporción de todos los resultados VP y VN en una
población
Esperadas Obtenidas Sensibilidad Especificidad Exactitud
ASe ASp
Muestras positivas 25 18 positivas 18/25=0,72 18 VP
7 negativas
Muestras negativas 30 6 positivas 24/30=0,80 24 VN
24 negativas
Total de muestras 55 55 25 30 42/55=0,76
 SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD EN
RESULTADOS CONTINUOS

VALOR DE
CORTE Valor definido que
permite distinguir
entre resultados
positivos y negativos
-Escala continua de
Threshold
Cut-off
valores del ensayo
 SENSIBILIDAD
β= Probabilidad de
error de FN

Región de
incertidumbre

Zona
falsos
positivos
ZONA DE ZONA DE
CORRECTOS NEGATIVOS CORRECTOS POSITIVOS
Zona
falsos
negativos

ESPECIFICIDAD
α = Probabilidad de
error de FP
 ATRIBUTOS A VERIFICAR ASp
La selectividad es el grado en que un método puede cuantificar con exactitud el analito
buscado en presencia de:
a. Interferentes, tales como componentes de la matriz (por ejemplo, inhibidores de enzimas
en la mezcla de reacción);
b. Productos de degradación (por ejemplo, factores tóxicos);
c. Una unión inespecífica de los reactivos a una fase sólida (por ejemplo, conjugado de un
ELISA adsorbido a un pocillo de la placa de microtitulación);
d. Anticuerpos contra la vacunación, que pueden confundirse con anticuerpos contra la
infección activa.
La inclusividad es la capacidad de una prueba de detectar varias cepas o serovares de una
especie, varias especies de un género o una agrupación similar de microorganismos o
anticuerpos estrechamente emparentados. Caracteriza el ámbito de aplicación de una
prueba de screening.
La exclusividad es la capacidad del método analítico de detectar un analito o secuencia
genómica que es propia del microorganismo buscado, y excluye todos los demás
microorganismos conocidos que pudieran dar una reacción cruzada. Esto también definiría
una prueba confirmativa
 ATRIBUTOS A VERIFICAR
REPETIBILIDAD
Grado de concordancia entre los
resultados de réplicas de una muestra
dentro y entre lotes de análisis usando el
mismo método en el laboratorio
REPRODUCIBILIDAD
Capacidad del método de ensayo para
proporcionar resultados consistentes cuando se
aplica a alícuotas de la misma muestra en
diferentes laboratorios
RESULTADOS BINARIOS
CLASIFICACIÓN DE RESULTADOS BINARIOS
TABLA DE CONTINGENCIA 2X2
Resultados
obtenidos 2
Positivos Negativos Totales
A B A+B
obtenidos 1
Resultados

Positivos
(VP) (FP) (VP+FP)
C D C+D
Negativos
(FN) (VN) (FN+VN)

A+C B+D (A+B+C+D)=N

Totales
(VP+FN) (FP+VN) (VP+FP+FN+VN)
A= VP (verdadero positivo): Resultado positivo que corresponde a muestra positiva,
B= FP (falso positivo) Resultado positivo que corresponde a muestra negativa,
C= FN (falso negativo) Resultado negativo que corresponde a muestra positiva,
D= VN (verdadero negativo): Resultado negativo que corresponde a muestra negativa,
N= A+B+C+D Total de resultados
 Taller 1
En el laboratorio ZR Se programó la verificación del método
cualitativo AX con un panel de 10 muestras para las que se realizaron
9 repeticiones por montaje por 3 días para un total de 27 resultados
por muestra. Con la información binaria obtenida elabore la tabla de
contingencia de 2x2, para realizar en análisis de los resultados.
Muestras Panel 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Resultados positivos esperados 27 - 27 - - 27 27 27 -
Resultados negativos esperados 27 27 27 27 27
2+ 14+ 16+
Resultados obtenidos 27+ 27- 27+ 27- 27+ 27+ 27-
25- 13- 11-
 Taller 1 Resuelto
Resultados
obtenidos 2
Positivos Negativos Totales
A (VP) B (FP)
obtenidos 1
Resultados

Positivos
122 18 140
C (FN) D (VN)
Negativos
13 117 130

Totales 135 135 270