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FUSARIUM OXYPORUM

ERIKA PAOLA FONSECA CANO


WILSON JAVIER MARTINEZ
MARIA JOSE RODELO PULIDO

Trabajo presentado a la docente:


MÓNICA JOVANNA PATIÑO PACHECO
FITOPATOLOGÍA

Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia


Facultad de ciencias agropecuarias
Tunja, Colombia
2018
INTRODUCCION

La papa es un producto de gran relevancia en la seguridad alimentaria, reducción de la


pobreza, intensificación de los sistemas agrícolas sostenibles y aprovechamiento sostenible
de la biodiversidad, razones por las que la Organización de Naciones Unidas declaró el
2008 como el Año Internacional de la Papa (FAO,2009). Después del maíz, trigo y arroz, la
papa es el alimento no cereal más consumido a nivel mundial. Se cultiva de norte a sur, y
de este a oeste del planeta en 157 países, cuya producción total para 2010 fue superior a las
334 millones de toneladas(Barrientos & Ñústez, 2014).
A nivel mundial la papa ocupa el tercer lugar en importancia como producto alimenticio
después del arroz y el trigo, El 90% área sembrada de papa en Colombia se concentra en
cuatro departamentos; Cundinamarca: 37%, Boyacá: 27%, Nariño: 20% y Antioquia: 6%.
La producción de papa en Colombia es de minifundio. El 95% de los productores siembran
menos de 3 hectáreas y el 80% menos de 1 hectárea. (FAO 2013).
En las condiciones ambientales de la región andina, el cultivo de la papa enfrenta
numerosos problemas, tales como la incidencia de heladas, sequías, granizadas, plagas y
enfermedades Arcos, (Jesús, & Zúñiga, Doris. 2015). Muchas de las enfermedades son
causadas por hongos cuyas estructuras de resistencia se encuentran en el suelo, y ocasionan
pérdidas económicamente significativas en la producción de este cultivo, pudiendo alcanzar
hasta 20% (Torres, 2002). En la papa, se han identificado más de 30 enfermedades
causadas por hongos; de las cuales, en las condiciones de clima frío y húmedo, entre las
cuales se encuentra Fusarium oxysporum .
Fusarium oxysporum es una de las especies de mayor importancia fitopatológica, una de las
que cuenta con mayor número de plantas hospedantes y una de las especies que mayor daño
económico ocasiona entre los patógenos de plantas. La especie tiene la capacidad de atacar
un gran número de plantas de importancia agrícola y ocasiona principalmente
marchitamientos vasculares, seguidos de la muerte de la planta (Nelson, 1981). Algunas
especies pueden ocasionar también pudrición de la corona y de las raíces de algunas plantas
(Farr et al., 1989; Jones et al., 1997).
Los síntomas que se presentan en las plantas de papa Solanum tuberosum se expresan en
hojas pudiendo observar amarillez de hojas inferiores y moteadas en hojas superiores,
seguido de un marchitamiento y amarillamiento generalizado, producto de la pudrición del
tubérculo semilla. La planta puede llegar a secarse por completo. En cuanto al tallo,
las plantas que han emergido de un tubérculo enfermo, pueden presentar lesiones hundidas
alargadas color marrón; mientras que en los tubérculos, lo más común es ver pudrición seca
en almacenaje y pudrición de tubérculos semilla en campo. La pudrición que se presenta en
almacenaje es seca y firme, alcanza de 3 a 5 cm. El tubérculo presenta primero lesiones
oscuras, ligeramente hundidas, que luego se extienden superficialmente con pudrición
interior, dejando cavidades internas. Posteriormente, el tubérculo se deshidrata. Tubérculos
enfermos, si son usados como semilla, producen plantas débiles y pálidas que pueden llegar
a marchitarse y morir. Tubérculos enfermos, si son usados como semilla, producen plantas
débiles y pálidas que pueden llegar a marchitarse y morir(Torres, 2002).

Esta investigación va enfocado al estudio de un Fitopatógeno que tenga relevancia en la


región de tal manera que se abarque el diagnóstico, proceso de patogénesis y los síntomas
y signos producidos por la enfermedad.
GENERAL
Realizar aislamiento y purificación del hongo Fusarium oxyporum obtenido a partir de
tubérculos de papa solanum tuberosum.

OBJETIVOS
Reconocer las estructuras básicas fungosas tales como hifas, micelio y esporas y cuerpos
fructíferos.
Reconocer los tipos más comunes de esporas y cuerpos fructíferos.
Describir una técnica que permita cultivar e identificar hongos en láminas portaobjetos.
Familiarizar al estudiante con las técnicas utilizadas en el diagnóstico de enfermedades
causadas por hongos, virus, bacterias, nematodos y sus métodos de aislamiento.

MARCO TEORICO

Reseña histórica del patógeno Fusarium oxysporum


Fusarium oxysporum, es un hongo que se presenta principalmente como saprófito en el
suelo, o también como patógeno especializado, denominado forma especial (f. sp.) según la
planta hospedante u hospedantes relacionados que afecte. Se caracteriza por producir
colonias de rápido crecimiento, con una tasa diaria cercana a un centímetro en medio papa-
dextrosa agar (PDA) a 25ºC. La morfología de las colonias es muy variable y puede
presentar dos tipos, siendo relevante aquella de tipo micelial caracterizada por la
producción de abundante micelio aéreo, algodonoso, con una coloración variable, de blanco
a rosado durazno, pero usualmente con un tinte púrpura o violeta más intenso en la
superficie del agar y pocas microconidias (Garcés et al, 2001).
Entre los fitopatólogos es tan conocido el género Fusarium por su importancia agraria,
como por la dificultad existente para diferenciar especies. La elevada variabilidad existente
en los aislamientos obstaculiza la identificación de especies, y buen ejemplo de ello lo
aporta CARRERA (1954) cuando relata cómo el género Fusarium creado por LINK en
1809 en base a Fusarium roseum, fue dividido por su autor en cuatro géneros diferentes:
Fusarium, Fusisporium, Fusidium y Atractium. Y desde entonces, ésta ha sido la tónica que
ha acompañado la taxonomía de los Fusarium. El desacuerdo entre los especialistas del
género es una antigua cuestión todavía sin zanjar.

La aplicación de Fusarium oxysporum ha sido una de las alternativas planteadas para la


erradicación de cultivos de coca (Errythroxylum coca. Lamarck) en Colombia. Esto ha
desatado gran controversia a nivel social, político y académico en el ámbito nacional e
internacional, debido a la alta patogenicidad del agente, a su desconocida estabilidad
genética y a la posible influencia que pueda ejercer sobre otras plantas hospedantes,
animales y humanos al ser aplicado masivamente. Gros Michel fue un exportador de
cultivares de banana. Y esos cultivares llevaron también la enfermedad en los 1950s;
apareciendo primero en Surinam, luego al Caribe, y a Honduras, que era el productor
mundial mayor de bananas en ese tiempo. Luego se descubrió que el cultivar vietnamita
Cavendish es resistente al patógeno. Pero requiere más cuidados en su manipuleo, y es de
menor calidad. (Garcés et al, 2001).
En distintos países y en diversas épocas se han presentado epidemias muy importantes
causadas por distintas formas especiales de Fusarium oxysporum en cultivos como banano,
plátano, tomate, algodón, clavel, crisantemo, lenteja y garbanzo, entre otros, ocasionando
pérdidas económicas muy significativas. En Colombia, en la Zona bananera del Magdalena
se registraron epidemias muy severas en la variedad «Gros Michel», de alta susceptibilidad
a la enfermedad en los años cincuenta (Buriticá, 1999). Esta enfermedad se conoce como
«Mal de Panamá» y ha sido una de las enfermedades más limitantes de la producción de
banano en el mundo.
En diversas zonas productoras de tomate y de pepino cohombro en los departamentos de
Cundinamarca y del Valle del Cauca se han presentado epidemias muy importantes en
variedades susceptibles. Estas enfermedades se han manejado especialmente con el cultivo
de variedades resistentes a la enfermedad. En los cultivos del clavel para exportación en la
Sabana de Bogotá, desde el año 1975, se han presentado epidemias bastante severas con
pérdidas económicas muy significativas, lo que ha impulsado a los productores a utilizar
suelos nuevos no infestados por el patógeno y a aplicar diversas medidas de control
químico, algunas de ellas bastante costosas y no muy eficientes (Rebell, 1992).
En los departamentos de Cundinamarca y Boyacá, se presentaron hace algunos años
ataques progresivos del patógeno en cultivos de lenteja y garbanzo, los cuales causaron la
eliminación casi completa de esos cultivos, por lo que el país debió realizar importaciones
de esas clases de granos (Buriticá, 1999). A partir de 1980, en el Valle de Huallaga en el
Perú se registraron epidemias importantes en los cultivos de coca ocasionadas por F.
oxysporum f.sp. erythroxyli, lo cual aumentó las siembras de ese cultivo en algunos
departamentos del Sur de Colombia (Rabodonirina et al., 1994). Igualmente, a partir de
1988 se registraron epidemias en algunos pequeños cultivos de coca para uso en bebidas
gaseosas en Hawai (Sands et al., 1997).
Las formas especiales patogénicas de Fusarium oxysporum parecen haberse originado a
partir de formas especiales no patogénicas o saprófitas en procesos evolutivos muy largos,
principalmente en los centros de origen de las plantas hospedantes (Nelson, 1990).

Cultivos que son afectados por Fusarium oxysporum

La especie Fusarium oxysporum ataca diversos tipos de plantas económicamente


importantes en distintos países y en diferentes regiones, causando marchitamientos
vasculares y muerte de las plantas.

En hortalizas se registra atacando entre otras plantas


Tomate (f.sp. lycopercisi)
Apio (f.sp. apii)
Pepino cohombro (f.sp. cucumerinum)
Cebolla (f.sp. cepae)
Repollo (f.sp. conglutinans)
Espárrago (f.sp. asparagi)
Remolacha (f.sp. betae)

En frutales se ha registrado en
Banano (f.sp. cubense)
Cítricos (f.sp. citri)
Melón (f.sp. melonis)
Guayaba (f.sp. psidii)
Vid (f.sp. herbemontis)
En leguminosas de grano
Fríjol (f.sp. phaseoli)
Soya (f.sp. glycines)
Alverja (f.sp. pisi)
Lenteja (f.sp. lentis)
Garbanzo (f.sp. ciceris).

En plantas productoras de aceite


Ajonjolí (f.sp. sesami)
Palma africana (f.sp. elaedis)

En ornamentales
Clavel (f.sp. dianthi)
Crisantemo (f.sp. chrysanthemi)
Delfinio (f.sp. delphiniii)
Gladiolo (f.sp. gladiolorum)

En plantas aromáticas
Albahaca (f.sp. basilici)

En plantas productoras de fibra


Lino (f.sp. lini)
Cáñamo (f.sp. cannabis)

En plantas forrajeras
Trébol (f.sp. trifolii)
Alfalfa (f.sp. medicaginis¡)
Lupino (f.sp.lupini)
Arboles en eucalipto (Esp. eucalipti)
Algunas coníferas (Esp. pini)

Fuente: (Armstrong y Armstrong, 1981; Farr et al., 1989)

Entre los cultivos considerados «ilícitos»


Coca (f.sp. erythroxyli)
Amapola (f.sp. papaver)
Marihuana (Esp. cannabis)

Fuente: (Armstrong y Armstrong, 1981; Connick et al., 1998, Farr et al., 1989).

Síntomas y signos producidos en plantas afectadas por Fusarium oxysporum

Fusarium oxysporium invade la planta bien sea de forma activa a través de las raíces o
pasivamente a través de orificios en la zona callosa de esquejes jóvenes. Después de la
penetración el patógeno se desarrolla dentro del sistema vascular de la planta y produce
marchitamientos vasculares, manchas y añublos de las hojas, pudrición de raíces y de tallos,
pudrición de frutos, granos y semillas la sintomatología más común incluye marchitez
inicial y amarillamiento de las hojas, que ocurre típicamente después de la floración. A
medida que la planta madura, presenta marchitez en algunos sectores de la planta. Es
común ver síntomas cloróticos en una mitad de la hoja, donde todos los foliolos de un lado
se tornan amarillos. A medida que la enfermedad progresa se observa marchitez y amarillez
en una parte o en toda la planta (Nelson, 1990).

La enfermedad se caracteriza por la aparición unilateral de los síntomas de marchitamiento,


acompañada del amarillamiento parcial de las hojas y el doblamiento de los brotes hacia el
lado de la planta enferma, a causa de la interferencia en el crecimiento; en estados iniciales
en las hojas puede observarse la mitad clorótica y la mitad de un color verdeq. Se observa
además un enanismo de los brotes y disminución del crecimiento de la planta, los síntomas
de la enfermedad avanzan afectando la planta hacia arriba hasta causar un marchitamiento
generalizado y la muerte. Un aspecto muy importante para el diagnóstico de la enfermedad
que la diferencia fácilmente de otras enfermedades vasculares es una coloración
blanquecina, amarillenta o marrón en los haces vasculares y deshilachamiento de los tejidos
sin afectar la médula (Garcés et al 2001).
Internamente puede observarse una decoloración café en los tejidos vasculares cuando la
planta es atacada por Fusarium oxysporium las raíces permanecen inicialmente intactas, en
contraposición a los ataques por otras especies de Fusarium que destruyen la base del tallo
o las raíces.

Fuente:http://elhocino-adra.blogspot.com/2011/01/fusarium-oxysporum-f-sp-
cucumerinum.html
fuente: http://www.pv.fagro.edu.uy/fitopato/enfermedades/Fusarium_tom.html

fuente:https://www.researchgate.net/figure/Figura-44-Sintomas-de-marchitamiento-
vascular-en-plantas-de-uchuva-y-aislamiento-de_fig4_257139624
fuente: http://www.enfermedades-fungosas-del-suelo-tomate/enfermedades-fungosas-del-
suelo-tomate.shtml
Taxonomia de Fusarium oxysporium

Dominio: Fungi

División: Deuteromycota

Clase: Sordariomycetes

Orden: Hypocreales

Familia: Nectriaceae

Género: Fusarium

Especie: F. oxysporum
SCHLTDL.

Tabla 1. Clasificación taxonómica del hongo Fusarium oxyporum


Morfología y estructura reproductivas

El hongo Fusarium oxyporum se caracteriza por producir colonias de crecimiento rápido y


tres tipos de esporas: microconidias, macroconidias y clamidosporas. Las microconidias
son esporas unicelulares, sin septas, hialinas, de elipsoidales a cilíndricas, rectas o
curvadas. Las macroconidias, son esporas de pared delgada, fusiformes, largas,
moderadamente curvadas, con varias células y de tres a cinco septas transversales, con la
célula basal elongada y la célula basal atenuada. Las clamidosporas son esporas formadas a
partir de la condensación de células de las hifas o de las macroconidias y se caracterizan
por poseer paredes bastante gruesas, lo que las hace muy resistentes a condiciones
ambientales desfavorables o a la ausencia de plantas hospedantes. Las clamidosporas se
forman simples o en pares, son terminales o intercalares y son las principales responsables
de la sobrevivencia del hongo en tejidos muertos de plantas hospedantes o en el suelo
(Nelson, 1981).

Patogenicidad del hongo Fusarium oxyporum

 Medios de penetración del fitopatógeno en la planta

Las esporas después del transporte se depositan sobre los substratos de cultivo, Fusarium
oxysporium invade la planta bien sea de forma activa a través de las raíces o pasivamente a
través de orificios en la zona callosa de esquejes jóvenes o por heridas o aperturas
naturales. El patógeno se desarrolla dentro del sistema vascular de la planta. La penetración
por la raíz tiene lugar directamente a través de la epidermis de la planta por la zona de la
raíz próxima al ápice que está en proceso de diferenciación, esto se ve favorecido por
heridas o por actuación de nematodos como es el caso de Meloidogyne (Navas et al.,
1990).

 Estructuras especializadas para infectar

El hongo se caracteriza por producir colonias de crecimiento rápido y tres tipos de esporas:
microconidias, macroconidias y clamidosporas. Las macroconidias son esporas,
unicelulares, rectas o curvadas. Las macroconidias, son esporas de pared
delgada,fusiformes,largas,moderadamente curvadas, con varias células y de tres a cinco
septas transversales, con la célula basal elongada y célula basal atenuada. Las
clamidiosporas son esporas formadas a partir de condensación de células de las hifas o de
las macroconidias y se caracterizan por poseer paredes bastante gruesas, lo que las hace
muy resistentes acondiciones ambientales desfavorables o a la ausencia de plantas
hospedantes o en el suelo (Nelson, 1981)
Figura 1. Esporas reproductivas (clamidiosporas) del hongo fitopatógeno fusarium oxyporum vistas
al microscopio. Con previa tinción con azul de metileno (Salmerón, 2015)

 Mecanismos bioquímicos que emplea Fusarium oxyporum para la colonización de


tejidos vegetales.

Este hongo es capaz de secretar enzimas y pequeñas proteínas durante la colonización


de los vasos xilemáticos de la planta de tomate (17).Estas proteínas promueven la
colonización del hospedante, por ejemplo por la supresión de los mecanismos de resis-
tencia basales (18, 19). El repertorio de proteínas efectoras, determina la virulencia de un
patógeno hacia un hospedante particular (20).Se han identificado 11 proteínas de F. o x y s
p or u m f ., las cuales se han denominado proteínas secretadas en el xilema (SIX) (17, 21).
Tres de estas proteínas son contrarrestadas por los genes Id del tomate :Avr1(SIX4) es
reconocida por los genes Ie I-1 no alélico(22), Avr2 (SIX3) es reconocido por I-2(2
3);y Avr3( SIX1) es reconocido por I-3(2 ). Avr2, Avr3 (2,23) así como SIX6, son
efectores genuinos, y se ha encontrado que contribuyen con la virulencia general. Esto se
ha evidenciado por la reducida virulencia del respectivo gen en cepas que no
lo contienen, un efecto que usualmente es mejor observado en la infección de plantas
adultas que en los retoños. Avr1 no es requerido para virulencia en general. Este gen tiene
la función de suprimir específicamente la habilidad de I-2e I-3para conferir resistencia
contra las cepas de la raza 1 (22). La expresión del gen efector SIX1es fuertemente
regulada de forma positiva durante la colonización de la planta hospedante. (Van der Do es et
al., ) usando el gen de la proteína fluorescente verde (de sus siglas en inglés GFP) como
reportero, mostraron que la inducción dela expresión deSIX1comienza
inmediatamente hasta la penetración dela corteza de la raíz. La inducción requiere células
vivas, no es específica de un hospedante y no depende de la forma morfológica de la raíz. A
partir de un cultivo de células vegetales también puede inducirse la expresión de SIX1. F.
oxysporum parece ser capaz de distinguir entre material vegetal vivo y muerto,
previniendo el paso innecesario del modo de vida saprofítico al infeccioso. No queda
claro como los efectores del patógeno son reconocidos por las proteínas I. Se plantean dos
posibles modelos: el primero más simple, describe un mecanismo receptor-ligando
en el cual la proteína R es activada por una interacción directa del efector (9).En el
segundo modelo, más complejo, una proteína R se asocia con una proteína
hospedante cuya actividad o estructura es manipulada por el efector. Esta modificación es
percibida por la proteína R, la cual detecta al efector indirectamente (4). Existen evidencias
de que los hongos pueden producir moléculas que suprimen las respuestas de defensa
en las plantas, incluyendo la biosíntesis de fitoalexinas. La quitina, un -1,4-
polisacárido de N-acetilglucosamina, es un componente estructural de la pared celular de
muchos hongos. Los hongos tienen múltiples clases de quitina-sintasas que catalizan la
polimerización de N-acetil glucosamina. (Madr id et al., ) demostraron que la quitina-
sintasa V, la cual es codificada por el gen chsV, es requerida por F. oxysporum
durante la infección del hospedante. Los mutantes del hongo que contenían el gen chsV
insertado y a los que este gen les fue reemplazado mostraron anomalías morfológicas como
hinchazón de las hifas, indicativo de alteraciones en la estructura dela pared celular.

 Genes involucrados en la patogénesis del hongo Fusarium oxyporum

 Gen Anotación Virulencia en planta Referencia

abc3 Trasportador de varias drogas Reducida (López-Berges et al., 2013)

arg1 Arginosuccinato liasa (Namiki et al., 2001a)


Reducida
Reducida
atg8 Proteína quinasa
(Corral-Ramos et al., 2014) aceptado
chs2 Quitin sintasa 2 Reducida (Martín-Urdíroz et al., 2008)

chs7 Chaperona de quitin sintasas (Martín-Urdíroz et al., 2008)


Reducida
chsV / Quitin sintasa clase V/ Quitin sintasa clase
Avirulento (Martín-Urdíroz et al., 2008)
chsVb VII
Martín-Urdíroz et al., 2008)
chsVb Quitin sintasa clase VII Avirulento

clc1 Canal de cloro dependiente de voltaje Reducida (Cañero & Roncero, 2008)

cmle Carboxi-cis, cis-muconato ciclasa Avirulento (Michielse et al., 2012)

ctf1 / ctf2 Regulador de lipasa/ regulador de lipasas Reducida (Bravo-Ruiz et al., 2013)
Avirulento
Con7-1 Factor de transcripción
(Ruiz-Roldan et al., 2014)
Reducida
cti6 Factor de transcripción (Michielse & Rep, 2009)

Proteína de la pared celular Reducida (Michielse & Rep, 2009)

fbp1 Proteína F-box (Miguel-Rojas & Hera, 2013)


Reducida
Reducida
fga1 Subunidad α de proteína G
(Jain et al., 2002)
fga2 Subunidad α de proteína G Avirulento (Jain et al., 2005)

fgb1 Subunidad β de proteína G Reducida (Delgado-Jarana et al., 2005)

(Rispail & Di Pietro, 2010)


fhk1 Histidina quinasa Reducido

(Di Pietro et al., 2001)


fmk1 MAP quinasa Avirulento

fmk1 /
MAP quinasa/ Subunidad β de proteína G Avirulento (Di Pietro et al., 2001)
fgb1
fmk1 /
MAP quinasa/ histidina quinasa Avirulento (Rispail & Di Pietro, 2010)
fhk1

fmk1 /
MAP quinasa/ proteína WW Avirulento
fso1
(Rosales & Di Pietro, 2008)
fmk1 /
MAP quinasa/MAP quinasa Avirulento Este estudio
hog1
fmk1 /
MAP quinasa/MAP quinasa Avirulento Turrá et al sin publicar
mpk1
fmk1 / MAP quinasa/mucina Avirulento (Perez-Nadales & Di Pietro, 2011)

Tabla 2. Principales genes que participan en la patogénesis del hongo Fusarium oxyporum.

Factores ambientales que favorecen en las colonización, esporulación y diseminación

Las especies de Fusarium pueden sobrevivir varios años en el suelo, desde donde pueden
infectar la planta y los tubérculos. La mayor parte de la infección de los tubérculos se
presenta durante la cosecha, penetrando a través de heridas. Sin embargo, las lesiones que
se inician en las heridas se hacen evidentes aproximadamente un mes después en
almacenamiento. Durante este período se desarrolla la enfermedad produciendo pudrición
y esporulación del hongo. Al usar tubérculos semilla enfermo, los propágulos en estos
tubérculos contaminan sacos y equipamiento usados para la selección y plantación e
infectan otros tubérculos, a través de las heridas producidas en la manipulación. Así, la
semilla entera o fraccionada que se ha infectado, se pudre e infesta el suelo que queda
adherido a la superficie de los tubérculos cosechados.

La pudrición seca se desarrolla bajo condiciones de alta humedad relativa y entre 15 y 20º
C. Humedad sobre el 70% no altera la incidencia y severidad de la pudrición, pero a menor
humedad, la infección y severidad de la enfermedad se retardan. La enfermedad continúa
desarrollándose lentamente a temperaturas más frías, las que a su vez son convenientes para
la papa (Acuña & Tejada)

Ciclo de vida de Fusarium oxysporum

Ciclo de la enfermedad: las especies de Fusarium pueden sobrevivir durante varios años en
el suelo, pero el inóculo primario se mantiene generalmente en la superficie de los
tubérculos, a partir de lo cual se contaminan: envases, el equipo usado para la recolección y
almacenamiento, y las papas que presentan heridas provocadas durante la cosecha y
transporte. La papa-semilla entera o fraccionada que se ha infectado, se pudre e infecta el
suelo que queda adherido a la superficie de las papas cosechadas. Los tubérculos son
resistentes a la infección, al momento de la cosecha; la susceptibilidad aumenta durante el
almacenaje. Las condiciones de alta humedad relativa y temperaturas entre 15 y 20 ºC en
almacenaje, favorecen el desarrollo de la enfermedad. La pudrición de la papa-semilla
después de la plantación no se promueve cuando la temperatura y la humedad relativa del
suelo favorecen la emergencia rápida de los brotes(Castro, I.; Contreras, 2011).
Figura 2. Ciclo biológico Fusarium sp. El hongo sobrevive en el suelo y en tubérculos.
Las papas que presentan heridas provocadas durante la cosecha y transporte son
contaminadas por el hongo, luego estas al ser almacenadas con condiciones de alta
humedad relativa y temperaturas entre 15 y 20 ºC en almacenaje, desarrollan la pudrición.
(Dibujo realizado por Ingrid Castro U.).
Técnicas para el diagnóstico del patógeno estudiado

MONTAJE EN CAMARA HUMEDA

En cámara húmeda aparece sobre los vasos a las 24 horas un micelio blanco algodonoso.
En PDA el aspecto de la colonia es variable, en general micelio algodonoso de crecimiento
rápido con pigmentación de cultivos desde el blanco al violeta, pasando por distintos tonos
de rosa, salmón y avinado. En ClK+hojas de clavel se observan las características
morfológicas descritas para Fusarium oxysporum: •Microconidios siempre presentes
ovoelípticos, cilíndricos, unicelulares y/o bicelulares, hialinos que se forman en falsas
cabezas sobre monofiálidas laterales, simples y cortas. •Macroconidios de los
esporodoquios son fusoides, con célula basal pedicelada, de tamaño medio, con 3-5
tabiques, siempre menos de 7 y una anchura menor o igual a 4 µm. •Presencia de
clamidosporas (aunque a veces tarda en formarlas), solitarias o en cortas cadenas,
intercalares o terminales (Merino & Fernández, 2010).
OBSERVACIÓN MICROSCOPIO (ESTRUCTURAS REPRODUCTIVAS)

Las especies del género pueden producir tres tipos de esporas asexuales llamadas
macroconidios, microconidios y clamidosporas. El macroconidio es la espora principal en
la caracterización. Su forma y tamaño varían según la especie (figura 2). Los
macroconidios pueden originarse a partir de estructuras especializadas, los esporodoquios,
como así también en monofiálides, polifiálides o directamente a partir del micelio aéreo. La
presencia de una célula basal en forma de pié se considera característica de Fusarium spp.
El microconidio es un carácter taxonómico primario y se considera su presencia o ausencia.
Si está presente las características consideradas son forma, modo de formación, si están
solos, en falsas cabezas, cabezas o cadenas. Pueden formarse en el micelio aéreo a partir de
mono o polifiálides pero no en esporodoquios. Otros caracteres taxonómicos primarios son
clamidosporas, conidióforos y mesoconidios. Para observar este tipo de características
suelen usarse medios naturales como el agar hojas de clavel (CLA) y agar nutriente
sintético (SNA). Este tipo de identificación requiere de una cuidadosa observación y un
grado de conocimiento de taxonomía para distinguir los patógenos a nivel de especie. Esto
ha llevado a un creciente interés en la obtención de métodos más sensibles para la
identificación de especies de Fusarium en el material vegetal infectado, incluyendo las
técnicas que implican el diagnóstico molecular (Departamento de microbiología UNLP,
2010).

Figura 3: Características morfológicas utilizadas en la identificación de especies de


Fusarium. A-D: formas típicas de macroconidios. E-H: formas de la célula apical del
macroconidio. I-L: formas de la célula basal del macroconidio.
Figura 4. Colonia de F. oxysporum (a), macroconidios (b) (x 100) y microconidios (c) (x
100) de F. oxysporum en APD.

(Lezcano & Alonso, 2012)

AISLAMIENTO DE HONGOS

Porciones
Examinar el Lavado Con agua
•Sintomas Corte de con tegido
material
tegido.
de de la llave
vegetal. •Signos enfermo y tegidos. y jabón.
sano.

•Hipoclorito
•Empleando de sodio al •Alcohol
un trozo de Sumergi 0,5%. Sumergi antiseptico
Escurrir gasa. r los •Durante un r los al 70%.
•Sobre un trozos minuto. trozos •Durante 1
recipiente. Escurrir minuto.
nuevamente
Retirar toda
Tres veces Flamead Constanteme
Lavado Secado humedad con
muy bien, con nte en la
papel o de
de los agua de los absorvente
llama del
destilada material mechero
trozos trozos (servilletas
esteril. metalico. (esterilizado)
esterilizadas).

Asepticament Marcar la caja


e formando con fecha y el
Trasferir patógeno •Durante 8
una cruz en el Sellar la
los trozos aislado. Incubacio dias
medio de caja con
a una caja n
cultivo, para calor . Posteriormen •A 25 °C
de Petri
el aislamiento te con papel
del patógeno. vinipel.

Todos los aislamientos obtenidos de Fusarium spp. Son finalmente transferidos a cajas de
Petri con medio APG y CLA para observar características macroscópicas y microscópicas,
respectivamente (Departamento de microbiología UNLP, 2010).

IDENTIFICACION MOLECULAR DE HONGOS

Cada aislamiento purificado se coloca en matraces conteniendo 20 mL de medio líquido


extracto de malta al 2 % (ME), incubándose a temperatura ambiente en oscuridad por 16-20
días. El ADN del micelio obtenido se extrae por el método del CTAB 3X, siguiendo el
protocolo descrito por Doyle y Doyle (1990) modificado por Santa et al. (2012). La
integridad del ADN se determina por electroforesis en gel de agarosa al 0,8 %,
suplementado con bromuro de etidio (10 mg mL-1 ). Los geles se fotodocumentan con el
sistema digital Bio Doc Analyze (Biometra, Alemania). La concentración y pureza del
ADN se evalua por lecturas a 260 nm y 280 nm en un equipo Nanodrop 2000C (Thermo,
E.E. U.U.) (Vanegas Berrouet, Gutiérrez Sánchez, & Marín Montoya, 2014).

PRUEBAS DE PATOGENICIDAD.

La patogenicidad ha sido definida como la capacidad relativa que tiene un microorganismo


fitopatógeno para producir una enfermedad (Agrios, 2005).

Cuando se piensa que un microorganismo puede ser la causa de una enfermedad


cualesquiera y no existen estudios previos que los comprueben, por lo tanto hay que seguir
la metodología de los postulados de Koch para verificar o no la hipótesis que el o los
microorganismos son la causa para que se produzca la enfermedad (Wilt & In, 2014)

1) Hay una relación muy estrechamente entre la enfermedad con el microorganismo


fitopatógeno, es decir el fitopatógeno debe estar asociado con la enfermedad en todas las
plantas enfermas que se examinen.

2) Se debe aislarse y obtener un cultivo axénico del microorganismo en estudio y anotar sus
características (morfológicas, culturales, bioquímicas entre otras).

3) El microorganismo en estudio y desarrollado en cultivo axénico debe ser inoculado en


plantas sanas de la misma especie de donde se aisló. Las plantas inoculadas deber
reproducir los mismos síntomas de la enfermedad.

4) El microorganismo fitopatógeno debe ser reaislado otra vez en cultivos axénicos y sus
características deberán ser exactamente igual a las del paso dos (Hernández, 2010).

MATERIALES Y METODOS

Las prácticas para aislamiento y purificación del hongo se realizaron en los laboratorios de
la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia (UPTC) ubicada a 5°32′25″ norte y
73°21′41″ oeste, a una altura de 2.690 msnm, bajo condiciones de laboratorio. El material
biológico utilizado del cual se tomaron las muestras del hongo Fusarium oxysporium,
fueron dos tubérculos de papa Solanum tuberosum obtenidos de una plaza de mercado a las
afueras de la universidad.

Procedimiento para aislamiento del hongo Fusarium oxysporium

Materiales:
 Muestras de tejidos enfermos recién traídas del campo.
 Hipoclorito de sodio al 0.5%
 Alcohol antiséptico al 70%
 Agua destilada estéril
 Gasas y papel de filtro esterilizado.
 Cajas petri con medio de cultivo PDA-A
 Pinzas
 Mecheros
 Vinipel
 Marcador permanente (vidrio)
 Recipiente de vidrio estéril

Procedimiento.
Procedimiento
Porciones
Examinar el Lavado Con agua
•Sintomas Corte de con tegido
material
tegido.
de de la llave
vegetal. •Signos enfermo y tegidos. y jabón.
sano.

•Hipoclorito
•Empleando de sodio al •Alcohol
un trozo de Sumergi 0,5%. Sumergi antiseptico
Escurrir gasa. r los •Durante un r los al 70%.
•Sobre un trozos minuto. trozos •Durante 1
recipiente. Escurrir minuto.
nuevamente

Retirar toda
Tres veces Flamead Constanteme
Lavado Secado humedad con
muy bien, con nte en la
papel o de
de los agua de los absorvente
llama del
destilada material mechero
trozos trozos (servilletas
esteril. metalico. (esterilizado)
esterilizadas).

Asepticament Marcar la caja


e formando con fecha y el
Trasferir patógeno •Durante 8
una cruz en el Sellar la
los trozos aislado. Incubacio dias
medio de caja con
a una caja n
cultivo, para calor . Posteriormen •A 25 °C
de Petri
el aislamiento te con papel
del patógeno. vinipel.

Procedimiento para purificación del hongo Fusarium oxysporium

Materiales:
 Alcohol antiséptico al 70%
 Agua destilada estéril
 Gasas y papel de filtro esterilizado.
 Cajas petri con medio de cultivo PDA-A
 Pinzas
 Mecheros
 Vinipel
 Marcador permanente (vidrio)

La purificación del hongo, se realizó de inóculos provenientes del aislado de la etapa


anterior mediante la técnica de resiembra sucesivas en el medio de cultivo AEA. Las cajas
Petri fueron colocadas en incubación a 20ºC., durante 5 días.

Procedimiento para micro cultivo del hongo Fusarium oxysporium

La práctica para el segundo aislamiento se realizó en los laboratorios de la Universidad


Pedagógica y Tecnológica de Colombia (UPTC) ubicada a 5°32′25″ norte y 73°21′41″
oeste, a una altura de 2.690 msnm, bajo condiciones de laboratorio.
Materiales.
 Cajas petri
 Laminas portaobjetos y
cubreobjetos
 Toallas de papel
 Agujas
 Bisturí
 Pinzas
 Agua destilada estéril
 Cultivo de hongo puro
 Cajas petri con medio papa
dextrosa agar (PDA)
 Etanol al 70%
 Azul de metileno o lactofenol con
azul de algodón
Figura 1: Algunos elementos utilizados en el laboratorio

Procedimiento Pre incubacion

recorte toalla
de papel, dos como 2 Colocarlos al
ASÉPTICAMEN colóquelo en 3PORTA base y un lado de los
TE ultimo
CUBREO cubre
el fondo de OBJETOS
atravezado. BJETOS. objetos.
una caja de
Petri.

Se corto en Con aguja


SELLAR Esterilizacion cuadrados un flameada, se
INOCUL
LA CAJA de PDA bloque de inocula el
materiales. medio PDA ACION medio PDA
PETRI
de 1 x 1 cm con el hongo.

Procedimiento Pos incubación


Tinción de láminas
Después de incubación se prepararon dos láminas de la siguiente manera:
 Se colocó una gota de lactófenol más azul de algodón sobre una lámina portaobjetos
limpia
 Se removio el cubreobjetos de la lámina del micro cultivo, descartándose el bloque
de agar.
 Agregamos una gota de alcohol al 95% a la hifa sobre el cubreobjetos.
 Tan pronto como el alcohol se evaporó colocamos el cubreobjetos con hifas en
posición hacía abajo, sobre la gota de lactofenol con azul de algodón. Esta lámina
queda lista para observación.
 Luego se removió la lámina de la caja de Petri, agregamos una gota de etanol al
95% a las hifas y luego una gota de lactófenol más azul de algodón.
 Se cubrió la preparación con un cubreobjetos limpio.
 Observación en el microscopio.

Procedimiento para tinción de Gram

Materiales:

 Cristal violeta
 Alcohol acetona
 Safranina
 Porta y cubreobjetos

Proceso: Se selecciona una muestra de la colonia bacterial, se diluye en la cantidad de agua


que toma un asa bacterial de laboratorio y se esparce en una lámina portaobjetos. Se deja
secar y se pasa ligeramente por el fuego de un mechero para fijar las bacterias. Una vez
hecho esto, se depositan varías gotas de violeta de genciana sobre las bacterias y se espera
un minuto. Se lava con agua de la llave corriente y se sacude. El remanente de agua se
elimina depositando varias gotas de la solución de yodo, la cual se deja por un minuto. Se
enjuaga con agua de la llave y se sacude. Se coloca la lámina en forma inclinada, se le echa
el decolorante gota a gota hasta que se vea que no sale color y se enjuaga con agua
(normalmente tarda de 10 a 20 segundos). Finalmente se echa la safranina, se deja reposar
por un minuto y posteriormente se enjuaga con agua de la llave.

Procedimiento para identificación de bacterias en distintos medios de cultivo

Materiales:

 Cajas de Petri con 3 medios de cultivó, KB (Pseudomonas), Agar pectina (Erwinia) Y


YDC (Xanthomonas)
 Pinzas esterilizadas
 caja de Petri con bacteria desarrollada
 Papel vinipel

Proceso: Con asa redonda realizar un raspado de la bacteria y sembrar en cada medio luego
se debe flamear muy bien cada medio y finalmente marcar y sellar con vinipel

Procedimiento para realizar pruebas de patogenesidad

La práctica se realizó en los laboratorios de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de


Colombia (UPTC) ubicada a 5°32′25″ norte y 73°21′41″ oeste, a una altura de 2.690 msnm,
bajo condiciones de laboratorio.
El material vegetal consto de cuatro papas variedad pardo pastusa, las cuales fueron
obtenidas y escogidas en un mercado de frutas cercano a la universidad; verificando que
estuvieran sanas.
Materiales
 Medios con cultivos puros de bacterias u hongos.
 Hipoclorito de Sodio al 10%
 Agujas estériles para insulina (2)
 Agua destilada estéril
 Tubos de ensayo
 Cajas Petri con medios de cultivo correspondiente
 Plántulas o frutos sanos de donde se realizó el aislamiento.
 Bisturís
 Toallas de papel estéril
 Cajas plásticas herméticas grandes
 Pinzas

Preparación de la suspensión.
La suspensión de bacterias y de hongos debe ser preparada con agua destilada estéril, es
recomendado agitar los tubos vigorosamente durante 5 minutos. La inoculación debe
realizarse muy rápido menos de dos horas la suspensión debe ajustarse en una
concentración entre 106 y 106 bacterias/ml. Para hongos 104 y 105 hongos/ml. Una
concentración impide el estableciemito de bacerial y hongos.

Aislamiento del Hongo Puro

recorte toalla
de papel, dos como 2 Colocarlos al
ASÉPTICAMEN colóquelo en 3PORTA base y un lado de los
TE ultimo
CUBREO cubre
el fondo de OBJETOS
atravezado. BJETOS. objetos.
una caja de
Petri.

Se corto en Con aguja


SELLAR Esterilizacion cuadrados un flameada, se
INOCUL
LA CAJA de PDA bloque de inocula el
materiales. medio PDA ACION medio PDA
PETRI
de 1 x 1 cm con el hongo.
Procedimiento Inoculación de hospederos sanos.

Disponga de un cultivo Realice una


Disponga CULTIVO puro con suficiente DESINFECCI
desinfección
MATERIAL tuberculos, DEL cantidad para realizar ON DEL
una suspensión
superficial
VEGETAL sin heridas PATOGENO MATERIAL
consistente para causar con jabón
superficiales. PURO VEGETAL
una enfermedad.. antibacterial

con la jeringa
Realice un INOCUL con una
INMERCI en hipoclorito triple lavado concentració
ACION
ON Y de sodio por LAVADO con agua n de la
un 1 minuto destilada DEL suspensión
LAVADO
estéril. HONGO sobre
tuberculos.

Coloque los
INOCULA tuberculos en
MONTEGE EN En el fondo de la caja colocar servilletas
CION las cajas
CAJAS estériles y humedecer con agua destilada
DEL plásticas
PLASTICAS estéril para favorecer la infección.
HONGO previamente
desinfectadas

Procedimiento para extracción de Nematodos

Materiales:

 Suelo de campo
 Tamiz
 pañuelos desechables
 frasco con tapa
 Recipiente de agua
 Agua
 plato de decantación
 portaobjetos
 cubreobjetos

Proceso: Agite la muestra de suelo en un cubo de agua los nematodos quedan suspendidos
en el agua Trasvasar el agua a través de un tamiz de 1000 micras de abertura (A) a un
segundo cubo (2). Los nematodos pasan a través del tamiz. Las partículas minerales quedan
en el primer cubo. Los materiales gruesos son retenidos por el tamiz. Filtre el agua del
segundo cubo por el tamiz de 53 micras de abertura (6). Muchas partículas de tierra pasarán
a través del tamiz. En este tamiz quedan retenidos los nematodos Junto con partículas finas.
Al residuo que queda en el segundo cubo se le agrega agua, se agita y se pasa nuevamente a
través del tamiz de 53 micras de abertura. Este proceso de lavado se repite 3-4 veces. Lave
el tamiz de 53 micras de abertura con una corriente de agua a baja presión con et objeto de
eliminar las partículas más finas. Recoja en un vaso, por lavado, los nematodos retenidos en
el tamiz de 53 mieras de abertura. Deposite la suspensión de nematodos en un tamiz con
pañuelos faciales humedecidos se coloca en un plato colector durante 48 horas y finalmente
se examinan en un microscopio o estereoscópico. Su observación puede obstaculizarse por
la abundante cantidad de partículas finas que acompañan a los nematodos.

Procedimiento para identificación de virus

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN

Se obtuvo un esclerocio que permitió la propagación del hongo de manera purificada


gracias a la utilización de un medio acidulado con ácido láctico lo que propició la no
reproducción de otros hongos que no eran de interés fitopatológico.
El proceso arrojó resultados positivos puesto que se logró aislar un patógeno que aunque
no era el propósito inicial de la actividad, también es de interés agronómico (Fusarium
oxyporum ) pero la información a cerca de ello es reducida puesto que se encuentra en
actual y constante investigación. Estudios realizados por Diana et al.,2002) permitieron el
aislamiento de Fusarium oxyporum en un medio de cultivo para microorganismos
solubilizadores de fosfatos, modificado: ((NH,),50" 0.5 g; KCI, 0.2 g; Mg50,.7H,O, 0.3 g;
Mn50,.H,O, 0.004g; FeSO,.7H,O, 0.002 g; NaCI, 0.2 g; D- Glucosa, 10 g; extracto de
levadura, 0.5 g; cloranfenicol, 0.1 g; agar,18 g; agua, 900 ml + soluci6n de fosfato (goma
arabiga, 0.5 g; fosfato de calcio de hierro, 0.5 g; agua, 100 ml). EI pH se corrigió hasta 7.2
con una solución de NaOH 1 N. encontrando que este hongo es solubilizador de fosfatos de
calcio.
Organolépticamente se identificó el hongo propagado en cultivo, gracias a las tonalidades
rosas debajo de una cama blanca de tejido algonodoso que se posesionó sobre uno de los
esclerocios ubicados en el medio de cultivo preparado.
En la superficie de los tubérculos utilizados se observó la presencia de costras negras,
llamadas esclerocios que son las estructuras de conservación del hongo, eran de forma
irregular parecidos a terrones pequeños de tierra, que incluso al ser lavados no se podían
retirar con facilidad; lo que concuerda según (Torres 2002) en la descripción realizada en el
Manual de las enfermedades más importantes de la papa en el Perú, dando positivo según
las características ya mencionadas para Rhizoctonia solani.
Se obtuvieron diez cortes del tejido vegetal los cuales contenían una parte enferma y otra
sana, para realizar el segundo aislamiento y esta vez purificación del hongo utilizando el
medio de cultivo acidulado con ácido láctico con el fin de asegurar el desarrollo del hongo
de interés. En nuestro caso, no se obtuvo los resultados favorables, ya que el hongo
Rhizoctonia solani no creció en ninguna de las dos cajas de Petri con este medio de cultivo.
Lo anterior obedece según indicaciones a varios factores durante el desarrollo de la
metodología; como un posible mal lavado, el mal secado de los trozos e incluso un
rompimiento del medio de cultivo al momento de trasladar las muestras a la caja Petri como
se alcanza a observar en las ilustraciones.
Todo lo anterior contrasta con otro ensayo realizado por (Gutiérrez et al 2006) con el
mismo fin de aislar el hongo Rhizoctonia solani a partir de raíces, hojas e hipocotíleos de
Phaseolus Vulgaris L. en condiciones de laboratorio con todo lo requerido en cuanto a
condiciones de asepsia; en donde reportaron que los aislamientos del hongo a partir de
raíces, hojas e hipocótilos de plantas de caraota infectadas presentaban las características
típicas del micelio de R. solani, que incluyen ramificación cercana al septo distal de células
vegetativamente jóvenes, constricción de la hifa y formación del septo a corta distancia
cercano al punto de origen de la ramificación hifal y color del micelio con variaciones
desde pardo-claro hasta pardo-oscuro, dependiendo de la edad del cultivo.
Sin embargo, como se evidencia en la imagen 2, existe en esa masa de color purpura o
morada la posibilidad de que corresponda al hongo Fusarium oxiporum, que si bien existen
muy pocas posibilidades de que este patógeno afecte los tubérculos en plantas de papa;
podría ser utilizada como objeto de estudio para nuestro trabajo.

Imagen 1: Medio de cultivo sin presencia de R. solani y medio de cultivo roto (Fuente
propia)
Imagen 2: (posible) Hongo Fusarium
oxiporum. (Fuente propia)

MICROCULTIVO DEL HONGO FUSARIUM OXYSPORIUM

Después del tiempo de incubación, se realizó una caracterización morfológica sencilla del
hongo dentro de la caja Petri; donde en la figura 2 se evidencia el crecimiento de una masa
algodonosa de color blancusca algo azul o violeta muy pálido correspondiente al hongo
fusarium oxysporum. Se veía micelio aéreo que sobresalía del medio de cultivo y
desbordaba del cubre objeto. Lo anterior concuerda con una serie de características para
identificación de hongos propuesta por (Cañedo & Ames, 2004) en su manual.

Figura 2: Micro cultivo Fusarium oxysporum. Características macroscópicas. Fuente


propia.

Después de abrir la caja de Petri frente a los mecheros y remover los cubre objetos y
descartar el medio de cultivo para montarlos en las nuevas láminas; observamos las
características microscópicas del hongo, Figura 3; donde se observa un tipo de micelio
septado y esparcidas algunas clamidiosporas que tienen una forma elipsoidal; lo cual
corresponde en similitud a lo encontrado por (Quilambaqui, 2005) en un trabajo realizado
en realizado en cinco municipios de Guanajuato México que consistió en Aislamiento e
identificación de especies de Fusarium spp asociadas al declinamiento del espárrago
(Asparagus officinalis L.); en donde las colonias identificadas como F. oxysporum
desarrollaron micelio de color violeta a púrpura con macroconidios, clamidosporas
esféricas y microconidios producidos en fiálides cortas y ramificadas Figura 4.

Figura 3: Características microscópicas Fusarium oxysporum. Fuente propia

Figura 4: Características microscópicas Fusarium oxysporum.


Fuente (Quilambaqui, 2005)
AISLAMIENTO DE BACTERIA EN TEGIDO VEGETAL DE TECOMA STANS

figura a. crecimiento de bacteria en medio de cultivo

Se observó que el medio de cultivo fue infectado con penicillium en pequeñas cantidades,
sin embargo, la bacteria si se desarrolló obteniendo las siguientes características:

Arriba: Amarrillo oscuro


Color Abajo: Amarillo claro
Tamaño 1.5 mm
Brillo Medio
Olor No fue posible debido a la
contaminación
Textura Lisa
Forma Elevada

La mayoría de las bacterias se multiplican rápidamente y son visibles como colonias


cuando se las siembra en medios de cultivo sólidos adecuados. Requieren una incubación
de aproximadamente 24 horas en una atmósfera que favorezca su desarrollo, a temperatura
óptima. Existen excepciones como M. tuberculosis, que requiere para su desarrollo de dos a
ocho semanas de incubación. La siembra de un material que contiene bacterias en un medio
sólido adecuado con la técnica de aislamiento permite, luego de un período adecuado de
incubación, la recuperación de millones de bacterias agrupadas en colonias aisladas. Éstas
pueden ser aisladas nuevamente en un nuevo medio para obtener un cultivo puro. El
crecimiento se define como el aumento del número de bacterias en una población
determinada. Es importante diferenciar entre el crecimiento de una célula individual y el de
una población. Dicho crecimiento celular es el resultado del aumento del tamaño de la
célula, seguido de su división. El crecimiento de una población, en cambio, es el resultado
del aumento del número total de células, que puede ser cuantificado directamente (contando
el número de células) o indirectamente (por ejemplo, midiendo la masa celular) (Varela &
Grotiuz, 2002)
La morfología de las colonias es fundamental en la identificación preliminar y para la
diferenciación de los microorganismos. Para la observación morfológica es preferible
examinar colonias de cultivos frescos crecidas en medios no selectivos. En este paso de la
identificación es muy importante el aislamiento de las bacterias en cultivo puro ya que esta
debería estar compuesta por un solo tipo de microorganismos y procedería de una unica
célula. Las colonias de una única especie, cuando crecen en medios específicos y bajo
condiciones idóneas se describen por sus características de tamaño, forma, consistencia, y a
veces por su color. El tamaño de las colonias bacterianas es generalmente uniforme entre
una misma especie. Por ejemplo, las colonias de estreptococos tienen un tamaño más
pequeño que las de los estafilococos y las enterobacterias. La forma está determinada por
los bordes y el grosor de la colonia. El borde puede ser liso o rugoso e irregular; la colonia,
abultada o plana. La textura de la colonia es también importante. Puede variar desde seca a
viscosa, con superficie lisa o granular. Algunos microorganismos producen una colonia
pigmentada, lo que puede ser de ayuda en el proceso de identificación (ejemplo:
Pseudomonas aeruginosa (pigmento verde), Serratia marcescens (pigmento rojo) aunque
en una misma especie puede haber cepas no pigmentadas. (Fernández et al 2010).

TINCIÓN DE GRAM

Figura b. Bacterias vistas en microscopio

Se puede determinar cómo bacterias gram negativas debido a su coloración rosa, por otra
parte, probablemente haya presencia de dos tipos de bacterias, una las que toman forma
alargada y la otra son visibles como puntos que se encuentran muy agrupados.
Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las
diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula
bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo, así como para prevenir la lisis
osmótica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el
peptidoglicano. La pared de la célula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas
interconectadas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente, 80% -
90% de la pared de la célula gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la célula gram-
negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de
peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos,
lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula gram-negativa
es peptidoglicano (Santambrosio, Ortega, & Garibaldi, 2009)

IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS EN DISTINTOS MEDIOS DE CULTIVO

KB

Negativo
Pseudomonas

AGAR PECTINA

Negativo
Xanthomonas

YDC

Positivo
Erwinia

Figura c. diferentes medios de cultivos.


Erwinia causa enfermedades tales como cáncer, agallas, manchas en las hojas, tizones,
marchitamiento y pudriciones que pueden ser blandas o no. Este género consta de once
especies con un pathovar, que causan tizones y marchitamiento, y de cuatro especies y tres
pathovars que producen pudriciones blandas, todas ellas con diversas propiedades
patogénicas y fenotípicas. Estas bacterias son bacilos rectos, con un tamaño entre 0.5 a 1.0
por 1.0 a 3.0 micras. Se presentan simples o en pares y algunas veces en cadenas cortas. Su
motilidad se debe a flagelos peritricos (excepto E. stewartii). Son aeróbicas facultativos y
quimiorganotróficas con dos tipos de metabolismo respiratorio, aeróbico y fermentativo. Su
temperatura óptima de desarrollo es de 27 a 30°C. La D-glucosa y otros carbohidratos son
catabolizados con la producción de ácidos; muchas especies no producen gas (GRANADA,
1996)
En los medios de cultivo las bacterias se multiplican y es necesario esperar al menos 18-24
horas para visualizarlas. En términos generales todas las bacterias tienen unos
requerimientos nutricionales imprescindibles para su crecimiento. Necesitan una fuente de
energía, una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, algunas sales, oligoelementos y
agua. Todos los medios de cultivo han de cumplir como mínimo con estos requisitos, pero
en muchas ocasiones se necesitan además otras sustancias adicionales como vitaminas,
factores o aminoácidos esenciales (Fernández Olmos et al., 2010).
Se pudo establecer que la muestra de hojas de Tecoma stans que se estudió contenía
Erwinia la cual dio positiva al medio YDC

PRUEBAS DE PATOGENESIDAD

Teniendo el cultivo puro del hongo re realizo la prueba de patogenicidad donde se cumplió
con los cuatro postulados de Robert Koch en 1882, los cuales fueron usados para
verificar la hipótesis de que el patógeno aislado (Fusarium oxysporum) efectivamente
es el causante de la enfermedad de la pudrición húmeda en tubérculos de papa
pardo pastusa

Imagen 1: Cultivo puro Fusarium oxysporum Imagen 2: Pudrición húmeda de la papa

Luego de varios días (4) de haber realizado el inoculo del patógeno (Fusarium oxysporum)
en el hospedero que fueron los tubérculos de papa (Solanum tuberosum L.) variedad pardo
pastusa de la cual también se realizó el aislamiento del hongo; se logró observar los
siguientes síntomas:
Síntomas Macroscópicos del Tejido Infectado
 Color del tejido: Marrón oscuro
 Forma y tamaño de la lesión: Prácticamente todo el tubérculo fue infectado y puesto
en descomposición a causa del fitipatogeno.
 Olor: Era fuerte, desagradable y podía sentirse a una distancia considerable.
 Consistencia del tejido: El tejido presentó un aspecto húmedo y suave
correspondiente a la pudrición característica que produce el hongo en su hospedero.

Estos síntomas concuerdan con lo manifestado según C. Moscardi y S. Garcia (1975) en su


artículo; que efectuando cortes transversales en el tubérculo, a partir del punto de inserción
del estolón, se observa una coloración amarronada en los vasos. Al principio la coloración
es de un marrón claro, haciéndose más oscura a medida que la infección progresa.
A igual (Narro, Agronomía, & Parasitología, 2007) mencionan que, Fusarium oxysporum
Causa una variedad de problemas a la papa tales como marchitamientos vasculares,
pudrición de tubérculos, raíz y parte inferior de los tallos.

Signos del Patógeno

Presentó micelio aéreo de color blanco sobre el tejido de los tubérculos, así como también
la presencia de microconidios; lo que concuerda con lo hallado por (Garcés de Granada,
Martha, Bautista, & Valencia, 2001) en donde manifiestan que morfología de las colonias
es muy variable y puede presentar dos tipos: una de tipo micelial caracterizada por la
producción de abundante micelio aéreo, algodonoso, con una coloración variable, de blanco
a rosado durazno, pero usualmente con un tinte púrpura o violeta más intenso en la
superficie del agar y pocas microconidias (Booth, 1970) y una de tipo pionotal con la
formación de poco o ningún micelio aéreo y abundantes microconidias.

Imagen 3: Papas sanas. Fuente propia Imagen 4: Papas inoculadas con Fusarium
Oxysporum. Fuente propia
EXTRACCIÓN DE NEMATODOS

NEMATODO: Pratylenchus

Fuente: tomada de internet. www.agric.wa.gov.au

Características:

Los nematodos tienen aproximadamente de 0.4 a 0.7 mm de longitud por un diámetro de 20


a 25 mm. Son organismos cilindroideos fuertes con una cabeza roma, un fuerte estilete y
cola notablemente redondeada. Son nematodos migratorios y endoparásitos que afectan a
las raíces de muchos tipos de plantas. El desarrollo y reproducción de los nematodos del
género Pratylenchus es un poco lento, ya que el ciclo de vida de varias de sus especies
concluye al cabo de 45 ó 65 días.

Pueden causar síntomas no específicos (retraso del crecimiento, amarillamiento y


marchitamiento) en una gama de especies de cultivo. Los síntomas se producen porque los
nematodos reducen la capacidad de las plantas para absorber agua y nutrientes a través de
las raíces. daño causado por nematodos se puede identificar mediante el examen de las
raíces de las plantas de cerca (véase la sección nematodo). niveles de nematodos en el suelo
se pueden determinar usando técnicas que se basan en el movimiento de nematodos para la
separación de los nematodos del suelo (por ejemplo, bandejas de Whitehead o Baermann
embudos), o técnicas pasivas (por ejemplo, tamizado) (Burgess L.W. Tesoriero L., and
Phan H.T., 2008)

Nombre común: Nematodo lesionador

El nematodo lesionador o de los prados se encuentra en todas partes del mundo, donde
ataca a las raíces de todas las clases de plantas, como es el caso de los cultivos del campo,
los cultivos de cereales, cultivos de hortalizas, árboles frutales y muchas plantas de ornato.
La gravedad de los daños que ocasiona el nematodo lesionador varía con el cultivo atacado
y consisten en una reducción o inhibición de su raíz causada por la formación de lesiones
locales en las raíces jóvenes, que se producen antes de que los hongos y bacterias
secundarios ocasionen su pudrición. Debido a los daños que sufre la raíz, las plantas
afectadas muestran un crecimiento deficiente, dan poco rendimiento y finalmente mueren.
(Agrios, 1995)

Sintomas: Las plantas herbáceas hospedantes susceptibles que son afectadas por el
nematodo lesionador se quedan achaparradas y muestran clorosis, como si estuvieran
sufriendo deficiencias minerales o falta de agua. Con frecuencia, en una sola área son
afectadas varias plantas, lo que hace que se vean manchas de plantas con crecimiento
deficiente y un color verde amarillento que puede observarse a gran distancia. Conforme
transcurre la estación, el achaparramiento de las plantas avanza, el follaje se marchita
durante los días cálidos del verano y las hojas adquieren un color café amarillento. Con
frecuencia, los síntomas consisten en árboles aislados o manchas de árboles que
gradualmente dejan de prosperar y dan poca cosecha. Las hojas son de menor tamaño y de
color verde opaco o amarillo. Las ramas terminales pueden perder sus hojas
prematuramente y sufrir muerte descendente. El aspecto total de los árboles afectados
indica que están debilitados y se encuentran en decadencia. Las manchas de árboles
afectados pueden aumentar lentamente de tamaño, aunque eso sucede más bien durante un
período prolongado. (Agrios, 1995)

Desarrollo de la enfermedad. Las larvas y los adultos del género Pratylenchus penetran en
las raíces comúnmente en sentido radial por cualquier punto (figura 15-11 B). El nematodo
penetra intracelularmente cuando introduce con fuerza y en forma sostenida su estilete y su
cabeza en las células de la raíz, que al parecer sufren ablandamiento y ruptura de su pared
celular. Lasparedes celulares y el citoplasma adherente comúnmente adquieren un color
café claro y toman el aspecto de pequeñas manchas decoloradas unas cuantas horas después
de producidala inoculación. Los nematodos se desplazan por la corteza, donde se alunen tan
y reproducen. La endodennis no sufre daños, aun cuando los nematodos llenen totalmente
el área comprendida entre la endodennis y la epidermis. La necrosis de las células corticales
sigue a la trayectoria de los nematodos, pero el manchado de las células vecinas varía con
la planta hospedante. En ocasiones, sólo son afectadas 162 células a cadalado de los túneles
que abre el nematodo, pero en otras ocasiones la lesión se extiende hasta más de la mitad de
la circunferencia de la raíz. La zona de la capa endodérmica adyacente al
nematodo adquiere también un color café oscuro que se extiende hasta abarcar grandes
grupos de células. Conforme el nematodo continúa alimentándose de las células corticales,
las paredes celulares se degradan y aparecen cavidades en la corteza, cuyas paredes en
ocasiones se encuentran revestidas por depósitos de color café. (Agrios, 1995)

Control: La forma más eficiente de controlar a los nematodos lesionadores de la raíz


consiste en tratar a los surcos o a toda el área de cultivo con nematicidas antes de cultivar
las plantas. Los nematicidas DD y Brozone proporcionan un buen control de dichos
nematodos, pero a menudo no los erradican por completo. En algunos casos, el oxamyl
aplicado en forma de baño del suelo o aspersiones foliares ha permitido controlar
eficientemente a los nematodos lesionadores. Cuando el clima es seco y cálido, puede
lograrse un control bastante efectivo del nematodo lesionador mediante el barbecho de
verano, el cual disminuye las poblaciones de dicho patógeno al exponerlo al calor y a la
desecación y eliminando a las plantas hospedantes. En la actualidad, el control mediante la
rotación de los cultivos es ineficiente debido a que el patógeno dispone de una amplia gama
de hospedantes y también a la actual falta de información concerniente a sus preferencias
por ciertos hospedantes. (Agrios, 1995)

IDENTIFICACIÓN DE VIRUS

CONCLUSIONES

 Se determinó gracias a la tinción de gram que la bacteria aislada se clasifica como gram
negativa, también se logró evidenciar que se desarrolló el medio de cultivo YDC donde
se encontró la bacteria Erwinia lo cual se constató con la literatura respecto a los
síntomas que esta bacteria produce y que efectivamente fueron los mismos presentes en
el material vegetal trabajado.

 Se logró determinar que el método aplicado para la extracción de nematodos es muy


eficiente siempre y cuando su desarrollo y pasos a seguir sean adecuados y hechos
correctamente. por otra parte, se resaltó que existen diferentes especies de nematodos y
que cada una de ellas presenta características morfológicas diferentes, síntomas y daños
a las plantas específicos de acuerdo a su familia. es importante tener un control de
nematodos a tiempo debido a las múltiples afectaciones y perdidas que pueden generar
en los cultivos a nivel mundial y que debido a esto la agricultura abarcaría problemas
económicos y de producción.

 Se logró describir y realizar la técnica de micro cultivo de hongos en láminas porta


objetos y una caracterización del hongo Fusarium oxysporum aislado, purificado y
cultivado en el laboratorio.
 Existen distintas técnicas para el micro cultivo de hongos, unas más eficientes
dependiendo del patógeno que se esté analizando; así como también diversos aspectos
para su identificación con fines académicos.

 Se logró describir y realizar la técnica de micro cultivo de hongos en láminas porta


objetos y una caracterización del hongo Fusarium oxysporum aislado, purificado y
cultivado en el laboratorio.
 Existen distintas técnicas para el micro cultivo de hongos, unas más eficientes
dependiendo del patógeno que se esté analizando; así como también diversos aspectos
para su identificación con fines académicos.

 Se logró la visualización de los síntomas y signos que prentaban los tubérculos de papa,
diagnosticando según las características observadas que se trataba del patógeno
Rhizoctonia solani.
 No se logró en un segundo intento el aislamiento y purificación del hongo Rhizoctonia
solani obtenido del tubérculo de papa Solanum tuberosum, en un medio de cultivo
acidulado con ácido láctico.
 A la hora de realizar estos procedimientos es indeispensable contar con la asepsia
necesaria y realizar los procedimientos adecuadamente, con el fin de evitar otros
resultados futuros negativos.
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