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DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA II - UCM

PRÁCTICA 6.
IDENTIFICACIÓN BACTERIANA Y DETERMINACIÓN DE
LA CMI MEDIANTE PANELES COMERCIALES

7.1. INTRODUCCIÓN.
Los paneles de micropocillos que contienen sustratos o distintas
concentraciones de antibióticos, en forma liofilizada o congelada, permiten
identificar bacterias y determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) de
varios antibióticos de forma rápida y sencilla.
Es suficiente añadir el inóculo bacteriano al panel (con lo que se hidrata a la
vez el sustrato o el antibiótico), incubar unas 18 horas, y detectar el crecimiento o
las reacciones bioquímicas. La detección puede hacerse en la mayoría de los casos
mediante equipos informatizados, que interpretan los resultados.
El sistema escogido en este caso es el panel Wider MIC/ID para bacterias
Gram-negativas, que permite determinar la CMI de 16 antibióticos por
microdilución en caldo e identificar la bacteria a nivel de especie mediante 26
pruebas bioquímicas.

7.2. Material:
• Colonias aisladas de la bacteria problema.
• Tubo con 3 ml de agua destilada.
• Tubo con 10 ml de agua destilada/0,5% Tween 80.
• Paneles Wider GRAM-NEGATIVOS REV2.
• Aplicador.

7.3. Preparación del inóculo:


• Tomar 4 ó 5 colonias (más si son muy pequeñas) con el asa de siembra y
resuspenderlas homogéneamente en 3 ml de agua destilada frotando en la pared
del tubo (Figura 6.1).
• Ajustar a la turbidez del patrón 0,5 de McFarland, añadiendo más cultivo o más
agua, según sea preciso.
• Pasar 0,1 ml a un tubo con 25 ml de agua destilada/0,5% Tween 80.

7.4. Inoculación del panel:


• Verter los 10 ml de inóculo en la placa de inoculación.
• Cargar el inoculador y descargarlo sobre los pocillos del panel.
• Cubrir con aceite mineral los pocillos que aparecen subrayados (GLU, URE, H2S,
LYS, ARG, ORN y DCB).
• Apilar unos 5 paneles y cubrir con una tapa o un panel vacío.
• Incubar 18-20 horas a 36ºC.

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Tabla 7.1. Antibióticos utilizados en el panel Wider GRAM-NEGATIVOS REV2


y puntos de corte para su interpretación.

Abre- Concentra- MENSURA CLSI


Antimicrobiano
viat. ciones S R S R
Penicilina* P 4
Amoxicilina AMX 16−8−4 ≤8 ≥32 ≤8 ≥32
Amoxicilina/Clavulánico A/C 16/8−8/4−4/2 ≤8/4 ≥32/16 ≤8/4 ≥32/16
64/4−32/4−16/
Piperacilina/Tazobactam P/T ≤16/4 ≥128/4 ≤16/4 ≥128/4
4
Cefalotina CF 8 ≤4 ≥32 ≤8 ≥32
Cefuroxima CFX 16−8−4 ≤4 ≥32 ≤8 ≥32
Cefoxitina CX 16−8 ≤4 ≥32 ≤8 ≥32
Ceftazidima TAZ 16−8−4−2−1 ≤1 ≥8 ≤8 ≥32
Ceftazidima/Clavulánico** TZ/C 8/4−1/4 ≤1 ≥8 ≤8 ≥32
Cefotaxima CTX 8−4−2−1 ≤1 ≥8 ≤8 ≥64
Cefotaxima/Clavulánico** CT/C 8/4−1/4 ≤1 ≥8 ≤8 ≥64
Cefepima CFP 8−4−2−1 ≤1 ≥8 ≤8 ≥32
Imipenem IMI 8−4−2−1 ≤2 ≥16 ≤4 ≥16
Ertapenem ETP 4−2 -*** - ≤2 ≥8
Meropenem MER 8−4−2 ≤1 ≥16 ≤4 ≥16
Kanamicina** K 4
Gentamicina GM 8−4−2 ≤4 ≥16 ≤4 ≥16
Tobramicina TO 8−4 ≤4 ≥16 ≤4 ≥16
Amikacina AK 16−8−4 ≤8 ≥32 ≤16 ≥64
Nitrofurantoína FD 64 ≤64 ≥128 ≤32 ≥128
Acido nalidíxico NA 16 ≤4 ≥32 ≤16 ≥32
Ciprofloxacino CIP 2−1−0,12 ≤0,12 ≥4 ≤1 ≥4
Minociciina MIN 8−4−2 - - ≤4 ≥16
Aztreonam AZT 8−1 - - ≤8 ≥32
Trimetoprim/Sulfametoxazol T/S 4/76−2/38 ≤2138 ≥8/152 ≤2/38 ≥4/76
α
Fosfomicina FOS 64−16 ≤16 ≥64 ≤64 ≥256α
Colistina CL 4 ≤2 ≥8 ≤2 ≥8

* Estos antibiótico se emplean en el panel sólo con fines de identificación.


** Estas combinaciones no se usan en terapéutica, sino para detectar β-
lactamasas de espectro ampliado (ESBL). La sensibilidad a la combinación,
unida a resistencia al antibiótico solo, indica producción de ESBL.
***En estos casos el panel está validado sólo para los criterios CLSI.

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Tabla 7.2. Interpretación de las pruebas bioquímicas del panel Wider REV2

7.5. Lectura del panel:


• Quitar el agua de condensación del fondo del panel
• El pocillo control (-) debe estar transparente, y el control (+) mostrar crecimiento.
En caso contrario, deséchese el panel.

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7.5.1. Pruebas bioquímicas.


• Para la lectura de pruebas bioquímica consulte la Tabla 7.2. En algunos pocillos
es necesario añadir los correspondientes reactivos.
• Rellene con los resultados la plantilla que aparece en el Informe de la Práctica.
• Utilice la siguiente clave dicotómica para una primera identificación:

 + Enterobacter (INDOL−,VP−,LACTOSA+)
 Serratia (INDOL−, LACTOSA TARDÍA)
 Citrobacter diversus (INDOL+ VP+)
 + Klebsiella ODC 
 Enterobacter 
 Serratia  Klebsiella (INMÓVIL, UREASA RÁPIDA)
Citrobacter − Citrobacter freundii (MÓVIL, UREASA −/+)
 
 + Escherichia CITRATO 
 Klebsiella 
 Enterobacter   + E. coli (MÓVIL, LACTOSA+)
 Citrobacter  Escherichia LDC 
 Serratia
 − coli  − Yersinia (INMÓVIL, LACTOSA−)
Yersinia Yersinia

ONPG  + Proteus  + Proteus mirabilis (INDOL−,SH2+)
  Providencia ODC  Morganella morganii (INDOL+, SH 2− )
  Morganella  − Proteus vulgaris (SH2+)
  Providencia (SH2− )
 Salmonella APP 
 Shigella 
 Proteus   + Salmonella (MÓVIL, SH2+)
− Providencia
  Salmonella CIT 
Morganella
 − Shigella  − Shigella (INMÓVIL, SH2−)

• Confirme los resultados de la identificación con los datos de la Tabla 7.3.


Algunas pruebas del panel WIDER no aparecen en la citada tabla; es necesaria la
información de la casa comercial para su interpretación.

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Tabla 7.3. Identificación bioquímica de algunos bacilos Gram-negativos.

Pseudomonas aeruginosa
Enterobacter aerogenes

Aeromonas hydrophila
Klebsiella pneumoniae

Yersinia enterocolitica
Serratia marcescens
Citrobacter freundii

Providencia stuartii
Proteus mirabilis
Proteus vulgaris
Escherichia coli

Salmonella sp.

Shigella sp.
Prueba bioquímica: Siglas:

Oxidasa1 - - - - - - - - - - - + +
Oxidación/Fermentación O/F F F F F F F F F F F F O O
β-galactosidasa ONPG + + + + + + - - - - - - +
2
Producción de Indol IND + - - - - v - v + - + - +
Rojo de metilo RM + - (-) + (-) + + + + + + +
Voges-Proskauer VP - + + - + - - - - v - - -
Producción de SH2 H2S - - - (+) - - + - + + - - +
Ureasa URE - - + v (-) (+) - - + + v v -
APP (TDA) TDA - - - - - - - - + + + - -
Lisina descarboxilasa LYS + + + - + - + - - - - - v
Arginina dihidrolasa ARG (-) - - v - - v - - - - + +
Ornitina descarboxilasa ORN (+) + - (-) + + (+) v - + - - -
Utilización de citrato CIT - + + + + - (+) - (-) v + + -
Utilización de malonato MAL - + + (-) - - - - - - - + -
Utilización de tartrato TAR v + + + (+) (+) + v (+) (+) + v -
Hidrólisis de esculina ESC (-) + + - + (-) - - V - - - +
Producción de ácido a partir de:
Glucosa GLU + + + + + + + + + + + - +
Adonitol ADO - + + - v - - - - - - - -
Arabinosa ARA v + + + - + (+) v - - - - +
Inositol INO - + + - (+) v v - - - + - -
Lactosa + + + v - - - - - - - - v
Melobiosa MEL v + + v - - + v - - - - -
Rafinosa RAF (-) + + v - - - v - - - - -
Ramnosa RHA (+) + + + - - (+) v - - - - -
Sorbitol SOR (+) + + + + + + v - - - - -
Sacarosa SUC (-) + + v + + - - + (-) v - +
(+): habitualmente positivo; (-): habitualmente negativo; v: variable según cepas.
1
Si es necesaria la prueba de la oxidasa debe realizarse por separado (ver apartado 4.4)
2
El pigmento de Serratia marcescens puede simular un falso positivo en la prueba del Indol.

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7.5.2. Antibiograma.
• Aplique la definición de CMI a cada antibiótico, teniendo en cuenta que los
pocillos que aparecen transparentes el crecimiento ha sido inhibido, y en los que
aparecen turbios hay crecimiento. Algunas situaciones dudosas se comentan en
la Figura 7.1.

Figura 7.1. Interpretación del crecimiento para la determinación de la CMI en los paneles Wider.

• Para determinar en cada caso si la bacteria es sensible o resistente utilice la


Tabla 7.1.

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PRÁCTICA 7.
TÉCNICAS DE AGLUTINACIÓN

5.1. INTRODUCCIÓN
Se describen dos técnicas de aglutinación aplicadas al diagnóstico
microbiológico.
Una de ellas es una aglutinación pasiva, y se utiliza para la identificación de
Staphylococcus aureus.
La otra técnica es una aglutinación directa para el serotipado de Salmonella.

5.2. IDENTIFICACIÓN DE Staphylococcus aureus POR AGLUTINACIÓN EN


LÁMINA.
Los sistemas disponibles se basan en la actividad coagulasa de Staphylococcus
aureus y en la presencia de proteína A en la superfice de sus células. El reactivo
consta de partículas de látex (o de hematíes de cordero, según la marca comercial
empleada) recubiertos de fibrinógeno (sensibilizados) y de anticuerpos IgG.
La aglutinación se produce tanto a través de los anticuerpos (unión de la
proteína A a la región Fc) como de la reacción de coagulación con el fibrinógeno, por
lo que es suficiente que la cepa posea uno de los dos factores (coagulasa o proteína
A) para obtener un resultado positivo.

5.2.1. Técnica.
• En una lámina o portaobjetos limpio se deposita una gota de reactivo.
• En ella se emulsiona con el asa una o dos colonias a analizar tomadas de una
placa de medio Chapman-manitol. Se hace rotar suavemente el porta durante
unos segundos.

5.2.2. Lectura e interpretación.


La aglutinación debe aparecer en unos 15 segundos.

5.3. SEROLOGÍA DE Salmonella.


Las pruebas bioquímicas por sí solas son insuficientes para diferenciar las
cepas de una misma especie, y en el caso de Salmonella para asegurar que se trate
de esa bacteria. Por tanto, las cepas que dan reacciones bioquímicas típicas se
someten a reacciones de aglutinación para determinar los antígenos O y H (Tabla
5.1)

5.3.1. Material:
• Antisuero
• 1 tubo de solución salina.
• Portaobjetos.
• Pipetas Pasteur.
• Cepa problema.
• Asa de cultivo.

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5.3.2. Técnica:
• Depositar una gota de solución salina en un portaobjetos limpio, con el asa
de cultivo o con una pipeta Pasteur y emulsionar una colonia. Si el
microorganismo está en fase lisa, no deben formarse agrupaciones ni
grumos.
• Depositar una gota de antisuero polivalente en otro portaobjetos, tomar una
colonia con asa de cultivo y emulsionarla hasta obtener una suspensión
uniforme. La lectura se realiza de 1 a 3 minutos, observándose la presencia o
ausencia de aglutinación.

5.3.3. Interpretación:
• Aglutinación con suero polivalente.
Si se ha utilizado un suero polivalente anti-Salmonella, un resultado positivo
confirma la identificación bioquímica. Los sueros polivalentes suelen contener
anticuerpos contra los antígenos representativos de los grupos A, B, C, D y E, y
contra el antígeno capsular Vi. De este modo se detectan los serovares más
comunes, así como Salmonella typhi, que puede dar reacción negativa al
enmascarar su antígeno Vi los antígenos somáticos O.
Un resultado negativo indica que no se trata de Salmonella o que pertenece a
otros serogrupos diferentes, y requeriría su comprobación por un laboratorio de
referencia.
• Aglutinación con sueros específicos.
Para identificar el serovar (por ejemplo, S. typhimurium o S. enteritidis ) es
necesarios utilizar antisueros monovalentes contra antígenos O y H (Tabla 5.1).

Tabla 5.1. Composición antigénica de algunos serotipos de Salmonella.

Serotipo Serogrupo Antígenos O (y K) Antígenos H*


Paratyphi A A 1,2,12 a/1,5
Paratyphi B B 1,4,5,12 b/1,2
Typhimurium B 1,4,5,12 i/1,2
Paratyphi C C 6,7,(Vi) c/1,5
Enteritidis D 1,9,12 g,m/1,7
Typhi D 9,12,(Vi) d
* Antígenos correspondientes a la expresión de flagelos fase 1/fase 2

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PRÁCTICA 8.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Candida albicans

8.1. INTRODUCCIÓN.
En esta práctica se plantea la detección de levaduras patógenas y la
identificación presuntiva de Candida albicans.
La muestra utilizada proviene de un supuesto exudado, por ejemplo vaginal o
faríngeo, tomado con el fin de diagnosticar una posible candidosis.

8.2. MATERIAL:
• Torunda con muestra de exudado.
• Tubo con agua destilada estéril.
• Tubo con 0,5 ml de suero de caballo.
• Una placa de agar-sangre (ver Práctica 1).
• Una placa de agar glucosado de Sabouraud. Es un medio selectivo para hongos,
debido a su pH ácido (5,6). El efecto inhibitorio puede completarse por adición de
antibióticos antibacterianos, como tetraciclina o cloranfenicol.

8.3. TÉCNICA:
8.3.1. Siembra.
Se realiza con el hisopo según el método ya descrito (Práctica 1). Cuando se
pretende aislar únicamente hongos se empleará el medio de Sabouraud; en caso
contrario se utilizará agar-sangre. Lo mismo ocurre con la temperatura de
incubación: 25°C para hongos, y 37°C para levaduras y bacterias indistintamente.
8.3.2. Identificación.
Las colonias de Candida albicans son blancas y cremosas, con olor a levadura.
Pueden observarse en fresco (a 40x) o teñidas por el método de Gram (los hongos
salen Gram-positivos, aunque no lo sea su pared) y a 100x.
8.3.2.1. Prueba de la filamentación:
Resuspender una colonia aislada en 1 ml de agua destilada; tomar 2 ó 3 gotas
de esa suspensión y añadirlas al tubo con suero de caballo. Incubar a 37°C durante
3 horas.
Examinar una gota entre porta y cubre (a 40x) en busca de filamentos.

8.4. INTERPRETACIÓN.
La morfología celular permite asegurar que se trata de una levadura. La
producción de filamentos permite identificar presuntamente a Candida albicans
(también los produce Candida stellatoidea). La identificación puede confirmarse
mediante pruebas bioquímicas y de necesidades nutricionales (auxonograma).

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BIBLIOGRAFIA

• Microbiología Clínica. Prats G. Editorial Médica Panamericana, Madrid, 2006.


• Bailey-Scott Diagnostic Microbiology, 11th Ed. Forbes, B.A., Sahm, D.F. y
Weisfsfeld, A.S. Editorial Médica Panamericana, Madrid, 2004.
• Diagnóstico Microbiológico. Texto y atlas color, 5ª Ed. Koneman, E.W., S.D.
Allen, W.M. Janda, P.C. Schreckenberger y W.C. Winn. Editorial Médica
Panamericana, 1999.
• Bacteriología Clínica. Struther, J.K. y Westran, R.P. Masson, 2005.
• Microbiología Sanitaria y Clínica. Rotger, R. Síntesis, 1997.
• Microbiología Médica, 2ª Ed. Mims, C., J.H. Playfair, I.M. Roitt, D. Wakelin y R.
Williams. Harcourt-Brace, 1999.
• Manual of Clinical Microbiology, 8th Ed. Murray, P.R. ASM Press, 2003.

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CALENDARIO DE PRÁCTICAS (normal)


1ª SEMANA Teoría: Práctica:
LUNES Organización del PRÁCTICA 1: UROCULTIVO PRÁCTICA 2: EXUDADO FARÍNGEO: (POR
laboratorio PAREJAS)TOMAR MUESTRA, TINCION DE GRAM
SIEMBRA (INDIVIDUAL)
SIEMBRA EN AGAR SANGRE
Infecciones del Tracto
Urinario
MARTES Infecciones faríngeas PRÁCTICA 1: RECUENTO, TINCIÓN DE GRAM Y PRÁCTICA 2: OBSERVAR COLONIAS, TINCIONES
SIEMBRA DE PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN DE GRAM, RESIEMBRA DE β-HEMOLÍTICOS Y
(PRÁCTICA 4) PRUEBA DE LA BACITRACINA (PRÁCTICA 4)
Recoger torunda para la toma de heces.

MIÉRCOLES Gastroenteritis PRÁCTICA 1: LEER PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN. PRÁCTICA 2: LEER PRUEBA DE LA BACITRACINA
infecciosas (1) SEMBRAR PRUEBAS COMPLEMENTARIAS
HACER INFORME
PRÁCTICA 3: COPROCULTIVO (INDIVIDUAL)

JUEVES Métodos de difusión para el PRÁCTICA 1 LEER PRUEBAS COMPLEMENTARIAS. PRÁCTICA 7: AGLUTINACIÓN DE Staphylococcus
ensayo de la sensibilidad a
PRÁCTICA 3: IDENTIFICACIÓN DE Campylobacter PRÁCTICA 6: ANTIBIOGRAMA DE DIFUSIÓN Y
antibióticos ε−TEST (sobre bacteria del urocultivo)

VIERNES Gastroenteritis PRÁCTICA 3: INTERPRETACIÓN DEL PRÁCTICA 6: LEER ANTIBIOGRAMA Y ε−TEST Y


infecciosas (2) COPROCULTIVO. AISLAMIENTO DE BACTERIAS HACER INFORMES 2 Y 6.
PARA IDENTIFICACIÓN.
PRÁCTICA 8 y 4: AISLAMIENTO DE Candida y
Streptococcus agalactiae (POR PAREJAS)

2ª SEMANA Vaginitis y vaginosis PRÁCTICA 6: INOCULACIÓN DE PANELES WIDER (Y PRÁCTICA 4: PRUEBA CAMP PARA Streptococcus
MOVILIDAD) CON EL AISLAMIENTO DEL PRÁCTICA 8: PRUEBA DE FILAMENTACIÓN DE
LUNES COPROCULTIVO. Candida.

MARTES Métodos de antibiograma PRÁCTICA 6: LECTURA DE LOS PANELES WIDER: PRÁCTICAS 4 y 8: LEER PRUEBAS CAMP Y
por dilución IDENTIFICACIÓN Y ANTIBIOGRAMA. FILAMENTACIÓN

EXAMEN PRÁCTICA 7: AGLUTINACIÓN DE Salmonella 1


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INFORME DE PRÁCTICAS DE
MICROBIOLOGÍA CLÍNICA
APELLIDOS, NOMBRE:

GRUPO: FECHA:

PRACTICA 1. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ORINA.

Muestra n°:
Urocultivo
Recuento: colonias/ml
Bacteriuria:  Significativa  No significativa
Identificación (Práctica 4)

Tinción de Gram:

Pruebas Bioquímicas: Resultados:

Aglutinación, si procede:

Resultado de la identificación:

1
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Antibiograma: (Práctica 6)

Antibiótico (carga del disco): Ø del halo: R/I/S

Antibiótico recomendado (teniendo en cuenta el lugar de la infección y sus


conocimientos de farmacocinética y toxicología puede intentar escoger el
antibiótico más apropiado entre los que son utilizables desde el punto de vista
microbiológico):

Resultado de Epsilon Test


Bacteria ensayada:

Antibiótico:

CMI:

Resultado (S ó R):

2
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PRACTICA 2. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE EXUDADO FARÍNGEO

Muestra propia:

Tinción de
Descripción y abundancia relativa de las distintas colonias: Hemólisis
Gram:

Pruebas de identificación realizadas y resultado (si ha lugar):

Muestra facilitada en el laboratorio:


Tinción de
Descripción y abundancia relativa de las distintas colonias: Hemólisis
Gram:

Pruebas de identificación realizadas y resultado:

3
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PRACTICA 3. COPROCULTIVO

Descripción y abundancia relativa de las distintas colonias:

Medio: Muestra propia: Muestra clínica:

Indique cuál(es) de las colonias aisladas seleccionaría para la identificación


mediante panel Wider, de qué muestra y medio proceden y por qué las
identifica.

4
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PRACTICA 6. IDENTIFICACIÓN Y ANTIBIOGRAMA CON PANELES


WIDER
Resultado de las pruebas bioquímicas:

+ –

*Estas pruebas de sensibilidad a distintos antimicrobianos sólo pueden interpretarse utilizando el


programa informático suministrado por el fabricante
5
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Procedencia de la bacteria aislada:

Resultado de la identificación según el panel WIDER:

Aglutinación, si procede:

Resultado del antibiograma según el panel WIDER:

Abre-
Antimicrobiano CMI S R
viat.
Amoxicilina AMX
Amoxicilina/Clavulánico A/C
Piperacilina/Tazobactam P/T
Cefalotina CF
Cefuroxima CFX
Cefoxitina CX
Ceftazidima TAZ
Cefotaxima CTX
Cefepima CFP
Imipenem IMI
Ertapenem ETP
Meropenem MER
Gentamicina GM
Tobramicina TO
Amikacina AK
Nitrofurantoína FD
Acido nalidíxico NA
Ciprofloxacino CIP
Minociciina MIN
Aztreonam AZT
Trimetoprim/Sulfametoxazol T/S
Fosfomicina FOS
Colistina CL

¿Es productora de ESBL?

6
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PRACTICA 8. ANÁLISIS MICROBIÓLOGICO DE EXUDADO VAGINAL

Resultado del cultivo Tinción de Gram y/o observación en


(descripción de las distintas colonias): fresco (esquema):

En agar-sangre:
1: 1:

2: 2:

En agar Sabouraud:

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS


Prueba de filamentación (dibujo):

Resultado de la identificación:

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS

Describa las pruebas de identificación utilizadas y el resultado obtenido:

Resultado de la identificación: