La calorimetría de titulación isotérmica (ITC) es una técnica que se utiliza en los estudios

cuantitativos de una amplia variedad de interacciones biomoleculares. Funciona

mediante la medición directa del calor que se libera o absorbe durante un evento de
enlace biomolecular.

ITC es la única técnica que puede determinar simultáneamente todos los parámetros de
enlace en un solo experimento. Sin necesidad de modificar los componentes del enlace,
ya sea con marcadores fluorescentes o por medio de inmovilización, ITC mide la afinidad
de los componentes del enlace en sus estados nativos.

La medición de la transferencia de calor durante el enlace permite la determinación

exacta de las constantes de enlace (KD), la estequiometría de la reacción (n), la entalpía
(∆H) y la entropía (∆S). Esto proporciona un perfil termodinámico completo de la
interacción molecular. ITC va más allá de las afinidades de enlace y puede dilucidar los
mecanismos subyacentes en las interacciones moleculares. Esta comprensión más
profunda de las relaciones entre estructura y función permite que se tomen decisiones
más confiables para la selección y optimización de componentes prometedores.
Principio de medición
La calorimetría de titulación isotérmica se utiliza para medir las reacciones entre
biomoléculas. La metodología permite la determinación de la afinidad de enlace, la
estequiometría y la entropía y entalpía de la reacción de enlace en solución, sin
necesidad del uso de marcadores.

Cuando se produce el enlace, el calor se absorbe o se libera, y esto se mide con un

calorímetro sensible durante la titulación gradual del ligando en la celda de la muestra
que contiene la biomolécula de interés.

Cómo funciona
El núcleo térmico
En el microcalorímetro hay dos celdas, una de las cuales contiene agua y actúa como
celda de referencia, y otra que contiene la muestra. El microcalorímetro necesita
mantener estas dos celdas exactamente a la misma temperatura. Los dispositivos de
detección de calor detectan la diferencia de temperatura entre las celdas cuando se
produce el enlace y retroalimentan a los calentadores, que compensan esta diferencia y
devuelven las celdas a la misma temperatura.

Realización de una medición

La celda de referencia y la celda de la muestra se ajustan a la temperatura experimental
deseada. El ligando se carga en una jeringa, que se encuentra en un dispositivo de
inyección muy preciso. El dispositivo de inyección se inserta en la celda de la muestra
que contiene la proteína de interés. Una serie de pequeñas alícuotas de ligando se
inyecta en la solución de proteínas. Si hay un enlace del ligando a la proteína, se detectan
y se miden los cambios de calor de unas pocas millonésimas de grado centígrado.

Cuando se hace la primera inyección, el microcalorímetro mide todo el calor liberado

hasta que la reacción de enlace alcanza el equilibrio. La cantidad de calor medida es
directamente proporcional a la cantidad de enlace.

Resultados y análisis de datos

En el ejemplo siguiente, la reacción es exotérmica, lo que significa que la celda de la
muestra se calienta más que la celda de referencia y provoca un pico hacia abajo en la
señal. A medida que la temperatura de las dos celdas se iguala de nuevo, la señal vuelve
a su posición inicial. La segunda alícuota pequeña del ligando se inyecta en la celda de
la muestra y una vez más el microcalorímetro compensa el pequeño cambio de calor
detectado. La relación molar entre el ligando y la proteína se incrementa gradualmente
mediante una serie de inyecciones de ligando. La proteína se satura cada vez más, se
produce menos enlace del ligando y el cambio de calor comienza a disminuir hasta que
en última instancia la celda de la muestra contiene un exceso de ligando en comparación
con la proteína, con lo que la reacción alcanza el punto de saturación.
El área de cada pico se integra entonces y se grafica con respecto a la relación molar de
ligando a proteína. La isoterma resultante puede ajustarse a un modelo de enlace del
que se deriva la afinidad (KD). La relación molar en el centro de la isoterma de enlace
nos da la estequiometría de la reacción. La gráfica que se muestra a continuación es un
ejemplo de una reacción de enlace 1:1.

La entalpía (ΔH) también se deriva directamente de la isoterma y es la cantidad de calor

liberado por mol del enlace de ligando. Esto significa que un solo experimento ITC ofrece
una gran cantidad de información acerca de la reacción de enlace, lo que ayuda a
comprender la naturaleza de la interacción y a explorar los factores termodinámicos.

ITC se utiliza ampliamente en las áreas de descubrimiento y desarrollo de medicamentos

para:

 Cuantificación de la afinidad de enlace

 Selección y optimización de candidatos

 Medición de la termodinámica y la concentración activa

 Caracterización del mecanismo de acción

 Confirmación de objetivos de enlace previstos en el descubrimiento de

medicamentos de pequeñas moléculas

 Determinación de la especificidad y estequiometría del enlace

  Validación de los valores IC50 y EC50 durante la determinación inicial de
componentes prometedores

 Medición de la cinética enzimática

Isothermal titration calorimetry (ITC) follows the heat change when a test compound binds
to a target protein. It allows precise measurement of affinity. The method is direct, making
interpretation facile, because there is no requirement for competing molecules. Titration
in the presence of other ligands rapidly provides information on the mechanism of action
of the test compound, identifying the intermolecular complexes that are relevant for
structure-based design. Calorimetry allows measurement of stoichiometry and so
evaluation of the proportion of the sample that is functional. ITC can characterize protein
fragments and catalytically inactive mutant enzymes. It is the only technique which
directly measures the enthalpy of binding (delta H degree). Interpretation of delta H
degree and its temperature dependence (delta Cp) is usually qualitative, not quantitative.
This is because of complicated contributions from linked equilibria and a single change in
structure giving modification of several physicochemical properties. Measured delta H
degree values allow characterization of proton movement linked to the association of
protein and ligand, giving information on the ionization of groups involved in binding.
Biochemical systems characteristically exhibit enthalpy-entropy compensation where
increased bonding is offset by an entropic penalty, reducing the magnitude of change in
affinity. This also causes a lack of correlation between the free energy of binding (delta G
degree) and delta H degree. When characterizing structure-activity relationships (SAR),
most groups involved in binding can be detected as contributing to delta H degree, but
not to affinity. Large enthalpy changes may reflect a modified binding mode, or protein
conformation changes. Thus, delta H degree values may highlight a potential discontinuity
in SAR, so that experimental structural data are likely to be particularly valuable in
molecular design.

La Figura 1 muestra los elementos básicos de un calorímetro. En este caso, se trata de

un calorímetro de titulación isotérmica (CTI). Éste tiene dos celdas idénticas, una de
referencia (R) que se llena de agua pura y otra que contiene la muestra (M). Ambas están
colocadas dentro de una “chaqueta térmica” que las aísla del exterior, evitando así
pérdida o ganancia de energía desde el entorno. El calorímetro establece una diferencia
de temperatura (ΔT) muy pequeña, aproximadamente de 0.0001 grados o menos, de tal
manera que la medición se realiza a temperatura constante, y de ahí el empleo de la
palabra isotérmico en el nombre del calorímetro. En la celda M se coloca la punta de una
jeringa que permite inyectar pequeñas cantidades de su contenido. Típicamente, en la
celda M se sitúa una solución de una proteína (P) y en la jeringa una solución de una
sustancia (L) cuya interacción con la proteína se desea estudiar. Al realizar una primera
inyección o titulación, L y P entran en contacto dentro de la celda M e interaccionan entre
sí, liberando o absorbiendo calor. Así, la celda M se calienta o se enfría y el ΔT original
cambia. El CTI entonces proporciona energía a la celda que esté a menor temperatura
para recuperar el ΔT original. Esto lo hace a través de unos dispositivos llamados
termopares. De hecho, lo que el CTI realmente mide no es el cambio de temperatura ΔT
sino la potencia (corriente y voltaje) proporcionada a través de estos dispositivos. La
cantidad de energía que hay que proporcionar para recobrar el ΔT original es igual a la
cantidad de energía que se liberó o absorbió debido a la interacción o unión entre P y L
en esa primera inyección. Esta energía es el área del primer pico de la Figura 2. En
subsecuentes titulaciones, la cantidad de energía debida a la unión de L a P disminuye,
ya que la cantidad de P libre en la celda (sin tener a L unido) es cada vez menor (Figura
2). Es decir, las áreas de los picos van decreciendo. En un experimento exitoso, en las
últimas titulaciones esta energía es muy cercana a cero, ya que todas las moléculas de
proteína tienen unido a L. Con un CTI, entonces, la medición se realiza a temperatura
constante, variando la concentración de la sustancia que esté colocada en la jeringa.
¿Qué se puede medir por ITC?
ITC permite una evaluación robusta, libre de marcaje del mecanismo de interacciones
intermoleculares entre un candidato a fármaco y una molécula blanco. Esas
interacciones son un indicador de bioactividad, un determinante crítico de eficacia en
fármacos. Por lo tanto, la cuantificación de afinidad de unión es un medio importante para
calificar la bioactividad. Además de proporcionar un perfil termodinámico completo de
una interacción molecular la ITC apoya más ampliamente la optimización de un candidato
a fármaco. Específicamente, puede ser usada para cuantificar los siguientes parámetros:

 Constante de equilibrio de disociación (KD): una medida de la fuerza de

interacciones biomoleculares, valores más pequeños indican una afinidad más
fuerte entre un ligando y una molécula blanco.
 Estequiometria de la reacción (n): la proporción de biomoléculas y ligando
involucrados en una interacción/reacción de unión; este parámetro cuantifica
cuantas moléculas de fármaco pueden unirse a el sitio blanco antes de que se
alcance la saturación.
 Entalpia (ΔH): la energía liberada o absorbida por mol de ligando cuando se
rompen o se crean enlaces; una medida del tipo y fuerza de los cambios en los
enlaces durante una unión, especialmente cambios en puentes de hidrogeno y
fuerzas de van der Waals.
 Entropía (ΔS): el cambio en grados de libertad de especies que están
interaccionando referentes al complejo; principalmente un indicador útil de
interacciones hidrofóbicas y cambios conformacionales.

Calorimetría isotérmica de valoración "Isothermal titration calorimetry"

IT
En este tipo de calorimetría se trabaja a tempertatura constante para estudiar
laenergética de las reacciones. Sin embargo, físicamente no es posible diseñar
uninstruento que funcione de manera completamente isotérmica, por lo que resultamás
correcto utilizar el término cuasi-isotérmico.Con la calorimetría isotérmica de valoración
puede medirse de forma directica laenergética de las reacciones que tienen lugar en
disolución y a presión atmosférica.La calorimetría de titulación isotérmica es una potente
herramienta analítica quemide la afinidad de unión y la termodinámica entre dos
biomoléculas. En unexperimento único puede determinar:1.
Afinidad de unión (en el rango milimolar a nanomolar).2.

Número de sitios de unión.3.

Puede detectar sitios de unión múltiples y diferentes.4.

Entalpía y entropía de la unión.La reacción transcurre en una célula de material que

presente una altaconductividad térmica e inercia química. El calor generado por la
mezclareaccionante se transfiere a través de un sensor de temperatura hacia un
sumiderotérmico, que consiste en un gran bloque de aluminio o cobre cuya temperatua
debeestar controlada con bastante precisión.
Aplicaciones:
1.

Caracterización de las interacciones moleculares de las moléculas pequeñas, proteínas,

anticuerpos, ácidos nucleicos, lípidos y otras biomoléculas.

Proteína - Proteína.

Target - Droga.

Enzima - Inhibidor.

Anticuerpo - Antígeno.

Proteína – ADN

Proteína - Lípido.

Molécula pequeña - Molécula pequeña.

2.

Cinética enzimática.
3.

Evaluación del efecto de cambios en la estructura molecular de losmecanismos

vinculantes.

4.

Evaluación de la actividad biológica

http://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/biotec_FQbiomol/DSC0607.pdf

http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac00217a002