TEORI ANALISIS KROMATOGRAFI

KROMATOGRAFI
checked by Osya

I. DEFINISI
Kromatografi didefinisikan sebagai prosedur pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi diferensial dinamis
dalam system yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satunya bergerak secara berkesinambungan dalam arah
tertentu dan di dalamnya zat-zat itu menunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan adanya perbedaan dalam
adsorpsi, partisi, kelarutan tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan muatan ion. (FI IV, 1002)

II. JENIS KROMATOGRAFI

A. KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
1. PRINSIP
Pemisahan zat terlarut dalam sistem yang terdiri dari dua fase yaitu fase diam (berupa serbuk halus yang
dilapiskan pada lempeng kaca, plastik, atau logam secara merata) dan fase gerak (pelarut/campuran pelarut).
Pemisahan yang dicapai dapat didasarkan pada adsorpsi, partisi, atau kombinasi kedua efek, yang tergantung dari
jenis zat penyangga, cara pembuatan, dan jenis pelarut yang digunakan.

Perkiraan identifikasi diperoleh dengan pengamatan bercak dengan harga Rf yang identik dan memiliki ukuran
yang hampir sama dengan cara menotolkan zat uji dan baku pembanding pada lempeng yang sama. Harga Rf
diperoleh dengan cara membagi jarak rambat bercak senyawa tertentu dengan jarak rambat fase gerak yang
diukur dari titik penotolan.

Pembandingan visual ukuran bercak dapat digunakan untuk memperkirakan kadar secara semikuantitatif.
Pengukuran kuantitatif dimungkinkan bila digunakan densitometri : fluororesensi atau pemadaman
fluororesensi, atau bercak dapat dikerok dari lempeng, kemudian diekstraksi dengan pelarut yang sesuai dan
diukur secara spektrofotometri. Pada KLT dua dimensi, lempeng yang telah dielusi, diputar 90º dan dielusi lagi,
umumnya menggunakan bejana lain yang dijenuhkan dengan sistem pelarut yang berbeda. (Fl ed. IV, hlm. 1002,
1004; Bobbit, Pengantar Kromatografi, hlm. 8)

2. Cara pengembangan KLT adalah menaik, selain itu terdapat cara pengembangan lainnya, antara lain :
a. Teknik ganda: setelah pengembangan dan pengeringan plat kromatografi, dilakukan pengembangan kedua
dan untuk pengembangan kedua, dapat digunakan pelarut pengembang yang sama atau berbeda. Melalui
pengembangan ganda dengan fase gerak sama atau berbeda ini dalam hal ekstrim akan dicapai hasil
pemisahan yang lebih baik.
b. Kromatografi fungsional : larutan uji yang hendak ditotolkan diperlakukan dulu dengan pereaksi
golongan atau pada titik awal dilakukan reaksi seperti brominasi, esterifikasi, hidrolisis, oksidasi, dll.
c. Teknik gradien : ditandai dengan perubahan kontinyu fase dan komposisi pelarut pengembang yang
diubah ketika analisis berlangsung atau digunakan plat gradien yang dapat diperoleh melalui perbedaan
aktivitas, ketebalan lapisan, ukuran partikel adsorben atau impregnasi yang berbeda. (Roth, Analisis
Farmasi, hlm.422)

KLT ini dapat digunakan untuk pemeriksaan identitas dan kemurnian senyawa obat, pemeriksaan simplisia
tanaman dan hewani, pemeriksaan komposisi dan komponen aktif sediaan obat serta untuk penentuan kuantitatif
masing-masing senyawa aktif campuran senyawa obat. (Roth, Analisis Farmasi, hlm. 423)
Data gugus fungsi yang dapat dipisahkan dengan KLT dapat dilihat pada lampiran (Tabel kepolaran : Bobbit,
Pengantar Kromatografi, hlm. 87; dan Tabel Sistem untuk Kromatografi Penjerapan : Bobbit, Pengantar
Kromatografi, hlm. 99 - 105)
 TEORI ANALISIS KROMATOGRAFI

3. ALAT
a. lempeng kaca : umumnya 20 cm x 20 cm
b. bukti lempeng : permukaan datar untuk meletakkan dan mengatur lempeng kaca pada waktu membuat
lapisan zat penjerap
c. rak penyimpanan : tempat lempeng yang dilapisi selama pengeringan
d. zat penjerap : bahan penjerap yang halus umumnya berdiameter 5 mm - 40 mm yang sesuai kromatografi.
Dapat mengandung bahan berfluororesensi
e. alat pembuat lapisan
f. bejana kromatografi : dapat ditutup kedap
g. alat sablon : alat bantu untuk menempatkan bercak uji pada jarak yang dibutuhkan dan untuk membantu
penandaan lempeng
h. pipet mikro berskala : yang dapat mengeluarkan cairan sejumlah 10 Ml
i. alat penyemprot pereaksi : alat yang dapat menyemprotkan butir-butir halus serta tahan terhadap pereaksi.
j. lampu ultraviolet : yang sesuai untuk pengamatan dengan panjang gelombang pendek (254 nm) dan
dengan panjang gelombang panjang (366 nm).

4. PROSEDUR
a. Bersihkan lempeng kaca misalnya dengan mencelupkan dalam campuran asam kromat, bilas dengan air
dan keringkan
b. Atur lempeng kaca di atas baki lempeng
c. Kecuali dinyatakan lain, campur 1 bagian zat penjerap dengan 2 bagian volume air. Kocok kuatdalam
labu erlenmeyer selama 30 detik, kemudian tuang bubur ke alat pembuat lapisan
d. Geser hati-hati alat pembuat lapisan di atas lempeng kaca ke arah sisi pendek baki yang berbingkai,
angkat alat pembuat lapisan dan segera dicuci hingga bebas dari sisa-sisa penjerap
e. Biarkan lempeng selama 5 menit
f. Pindahkan lempeng pada rak penyimpan dengan lapisan menghadap ke atas, keringkan pada suhu 105 °C
selama 30 menit. (Sebaiknya rak ditempatkan dalam lemari pengering dengan posisi miring untuk
menghindari kondensasi pada bagian belakang lempeng)
g. Setelah lempeng kering, biarkan dingin hingga suhu kamar
h. Amati keseragaman distribusi dan susunan lapisan penyerap, simpan lempeng yang baik di atas silika gel
dalam bejana yang sesuai
i. Tempatkan kertas saring 2 lembar pada 2 sisi di sebelah dalam bejana kromatografi, masukkan pelarut ±
100 mL, tutup kedap dan biarkan sistem keseimbangan
j. Totolkan larutan uji dan larutan baku menurut cara yang tertera pada masing-masing monografi dengan
jarak antara ± 1,5 cm dan ± 2 cm dari tepi bawah lempeng, biarkan kering
k. Beri tanda pada jarak 10 - 15 cm di atas titik penotolan
l. Masukkan lempeng ke dalam bejana, tutup bejana, biarkan pelarut merambat hingga 10 - 15 cm di atas
titik penotolan
m. Keluarkan lempeng dari bejana, buat tanda batas rambat pelarut, keringkan lempeng di udara
n. Amati bercak dengan cahaya UV gelombang pendek (254 nm) dan kemudian dengan cahaya UV
gelombang panjang (366 nm)
o. Ukur dan catat jarak tiap bercak dari titik penotolan dan panjang gelombang
p. Tentukan harga Rf untuk bercak utama
q. Jika perlu semprot bercak dengan pereaksi yang ditentukan, amati dan bandingkan kromatografi zat uji
dengan kromatografi baku pembanding

5. KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PENGEMBANGAN SINAMBUNG (FI ed. IV, Lampiran <931>, hlm.
1005)
a. Pengembangan sinambung atau teknik aliran sinambung berbeda dengan KLT- konvensional, dimana
bagian atas lempeng menjulur keluar melalui sebuah celah pada tutup bejana kromatografi. Bila fase
gerak mencapai celah itu, terjadi penguapan secara sinambung, mengakibatkan aliran pelarut yang tetap
 TEORI ANALISIS KROMATOGRAFI

pada lempeng. Migrasi bercak berlanjut selama lempeng berada dalam bejana dan fase gerak belum habis.
Hal ini berbeda dengan KLT konvensional dimana migrasi bercak berakhir bila pelarut mencapai tepi atas
lempeng dan bercak akan membesar yang disebabkan oleh difusi. Kromatografi dapat dilanjutkan
beberapa jam setelah pelarut mencapai tepi atas lempeng agar terjadi migrasi bercak yang memadai.
b. Keuntungan utama KLT pengembangan sinambung adalah selektivitas pelarut yang lebih besar untuk
pelarut yang daya melarutkannya rendah.
c. Harga Rf tidak dapat diukur. Zat-zat dapat dibandingkan jarak tempuh migrasinya selama periode waktu
tertentu atau dibandingkan dengan migrasi zat batas yang ditotolkan pada lempeng yang sama.
Pembandingan dinyatakan sebagai retensi relatif Rr.
d. Teknik:
 pengembangan sinambung
 pengembangan sinambung dengan bejana rendah : keunggulan utama teknik ini berasal pada
kenyataan bahwa laju pelarut berbanding terbalik dengan panjang bejana. Bejana rendah
memungkinkan terjadinya migrasi yang bermanfaat dalam waktu yang sesuai , memakai pelarut
dengan kekuatan yang sangat rendah. Difusi yang lebih lambat dalam pelarut yang berkekuatan
rendah menghasilkan bercak yang lebih kecil dan pekat, yang meningkatkan kemampuan deteksi dan
ketajaman melihat perbedaan kecil dalam jarak migrasi.

B. KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI <KCKT>

1. DEFINISI
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan salah satu jenis kromatografi kolom cair yang memiliki
sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi tinggi yang menerapkan kemampuan kemajuan teknologi
kolom, sistem pompa bertekanan tinggi dan detektor yang sensitif (FI IV, 1009).
Kromatografi ini terdiri dari fase diam yang terikat secara kimia pada penyangga, fase gerak yang dialirkan cepat
dengan bantuan tekanan tinggi dan hasil analisis yang dapat dideteksi dengan instrumen. (Bobbit, Pengantar
Kromatografi, hlm. 186).
Pelarut pada fase gerak dapat menggunakan dua sistem yaitu sistem isokratik dan sistem elusi gradien.

2. KEUNTUNGAN METODE KCKT antara lain :

Waktu analisis cepat, penentuan dapat dalam jumlah mikro, daya pemisahan tinggi, repetitif dan reproducible
serta tidak ada eksipien yang mengganggu. Pada prinsipnya senyawa dapat dipisahkan dengan metode KCKT
jika senyawa tersebut dapat larut dalam pelarut yang digunakan sebagai fase gerak. KCKT merupakan metode
yang lebih baik untuk cuplikan atau sampel yang jumlahnya sedikit.

3. JENIS SENYAWA YANG DAPAT DIPISAHKAN SECARA KCKT

Jenis senyawa yang dapat dipisahkan secara KCKT adalah senyawa padat yang larut dalam pelarutnya, cairan
yang kurang atsiri, senyawa polimer dan berbobot molekul tinggi, senyawa anorganik yang sebagian besar
tidak atsiri, senyawa berbobot molekul tinggi, senyawa ionik dan produk alam yang labil (Bobbit, Pengantar
Kromatografi, him. 186)

4. PEMISAHAN KROMATOGRAFI YANG BAIK

Pemisahan kromatografi yang baik adalah jika fase diam mempunyai luas permukaan yang besar dengan adanya
penyangga berupa serbuk halus dan fase gerak yang digerakkan cepat dengan adanya tekanan tinggi sehingga
difusi yang terjadi sekecil-kecilnya. Oleh karena itu, faktor-faktor yang mempengaruhi pemisahan secara KCKT
adalah daya pisah, waktu retensi, jumlah cuplikan yang disuntikkan, ukuran kolom, diameter partikel fase diam,
tekanan, tinggi puncak dan jumlah pelarut yang digunakan (Practical HPLC Method).

5. PERBEDAAN KCKT DENGAN KROMATOGRAFI KOLOM KLASIK

Metode ini dapat dibedakan dari kromatografi kolom klasik oleh 4 sifat khas, yaitu :
a. Menggunakan kolom pendek untuk mempersingkat waktu
 TEORI ANALISIS KROMATOGRAFI

b. Menggunakan kolom sempit dengan diameter yang kecil (1-3 mm) untuk memungkinkan pemisahan
dalam jumlah mikro.
c. Ukuran partikel bahan sorpsi dibawah 50 µm , hingga akan tercapai suatu bilangan dasar teoritik yang
tinggi.
d. Pelarut elusi dialirkan ke dalam kolom dengan tekanan untuk mengkompensasikan tekanan arus di dalam
kolom. (Roth, Analisis Farmasi, hlm 431-432)

6. FASE DIAM
Dapat berupa cairan atau polimer, yang disalut atau terikat secara kimia pada permukaan penyangga sebagai
lapisan tipis yang mengurangi hambatan terhadap pemisahan massa, sehingga keseimbangan antara fase gerak
dan fase diam dapat tercapai dengan cepat.

Tiga bentuk KCKT yang paling banyak digunakan adalah :

a. penukar ion : terutama digunakan untuk pemisahan zat-zat larut dalam air yang ionik atau yang dapat
terionisasi dengan BM < 1500. Fase diam umumnya resin organik sintetik dengan gugus aktif yang berbeda-
beda.
b. partisi : digunakan fase gerak dan fase diam dengan polaritas yang berbeda. Jika fase gerak bersifat polar
dan fase diam non-polar (kromatografi fase balik), maka dapat digunakan untuk memisahkan senyawa yang
larut dalam hidrokarbon dengan BM <1000 seperti vitamin larut lemak dan antrakinon yang berdasarkan
atas afinitasnya terhadap fase diam. Jika fase gerak bersifat non-polar dan fase diam polar, maka zat yang
dapat dikromatografi adalah zat yang bersifat polar seperti golongan alkohol dan amina.
c. adsorpsi : zat yang dapat dianalisis dengan metode kromatografi adsorpsi adalah beraneka ragam senyawa
non-ionik.
(FI IV, HAL. 1010)

7. ALAT
Terdiri dari kromatografi cair, sistem pompa, tempat penyuntikan analit, kolom kromatografi, detektor, penguat
sinyal dan perekam.
Ada dua cara yang digunakan untuk memasukkan analit ke dalam kolom, yaitu :
a. injeksi ke dalam arus yang mengalir
b. injeksi waktu aliran berhenti
Keduanya dapat dilakukan menggunakan alat suntik dan katup penyuntik.
 Kolom yang digunakan umumnya mempunyai diameter dalam yang kecil (2- 4 mm)
 Detektor yang biasa dipakai mencakup fotometer ultraviolet, refraktometer diferensial, dan fluorometer.
 Komposisi fase gerak berpengaruh nyata terhadap kinerja kromatografi dan harus dikendalikan dengan
cermat.
 Pada kromatografi partisi dan adsorpsi, fase gerak dapat dimodifikasi dengan pelarut yang lain, sedangkan
pada kromatografi penukar ion, pH, kekuatan ion dan modifikasi pelarut dapat mengubah faktor kapasitas
(k adalah perbandingan waktu yang diperlukan selama berada dalam fase diam terhadap waktu yang
diperlukan selama berada dalam fase gerak)
 Elusi gradien adalah teknik yang mengubah komposisi pelarut sinambung selama berlangsungnya
kromatografi (untuk kromatografi contoh kompleks yang terdiri dari komponen-komponen dengan faktor
kapasitas yang perbedaannya besar).
(FI IV, HAL. 1010-1011).

C. KROMATOGRAFI KERTAS
Ada 3 cara pengembangan pada kromatografi kertas :
1. KROMATOGRAFI MENURUN (FI IV, 1003-1004)
Pada kromatografi menurun, fase gerak dibiarkan merambat turun pada kertas.
Prosedur:
a. Untuk analisis kualitatif
 TEORI ANALISIS KROMATOGRAFI

 Larutkan zat uji dalam pelarut yang sesuai hingga mengandung 1- 20 ug jika ditotolkan dengan pipet
mikro.
 Jarak antar bercak tidak kurang dari 3 cm dan diameter bercak 6-10 mm.
 Kertas digantung dalam bejana dengan pelarut yang telah ditetapkan. Penjenuhan bejana dapat
dipercepat dengan melapisi dinding bejana dengan kertas saring yang dibasahi oleh pelarut (untuk
bejana besar penjenuhan selama 1 malam). Bejana ditutup rapat.
 Sejumlah fase gerak lebih dari yang diperlukan dijenuhkan dengan fase diam (dengan pengocokan).
Setelah jenuh dimasukkan ke dalam bak pelarut melalui lubang.
 Lubang ditutupi dan fase gerak dibiarkan merambat turun pada kertas sejauh yangdikehendaki.
 Pada waktu kertas diangkat, batas rambat pelarut segera ditandai dan dikeringkan.
 Amati dan ukur kromatogram secara langsung atau setelah disemprot dengan pereaksi
untukmenampakkan bercak obat yang telah terpisah. Hitung harga R (perbandingan jarak rambat
senyawa tertentu dengan jarak rambat baku pembandingnya).

b. Untuk analisis kuantitatif

Bagian kertas yang mengandung bercak digunting dan dielusi dengan pelarut yang sesuai. Dilakukan juga
terhadap berbagai kadar baku pembanding yang ditotolkan pada kertas yang sama untuk membuat kurva
kalibrasi.

2. KROMATOGRAFI MENAIK (FI IV, 1004)

Pada kromatografi menaik, ujung bawah kertas dicelupkan ke dalam fase gerak, sehingga memungkinkan
fase gerak merambat naik pada kertas oleh gaya kapiler.
Prosedur:
 Larutan uji ditotolkan pada kertas, di atas batas kertas yang tercelup dalam fase gerak
 Genangi dasar bejana dengan pelarut yang telah ditetapkan
 Dinding bejana dilapisi kertas saring sebagai indikator kejenuhan bejana
 Kertas saring digantung sedemikian hingga ujung kertas yang ditotolkan bergantung bebas dalam bejana
 Bejana ditutup dan dijenuhkan seperti pada kromatografi menurun

3. KROMATOGRAFI HORIZONTAL
Merupakan pengembangan kromatografi melingkar.
Pelarut pengembang dialirkan dari bawah dengan bantuan kapiler kertas atau sumbu kapas pada titik pusat
kromatogram atau dari atas dengan melubangi, diteteskan dengan bantuan pipet yang sesuai (Roth, Analisis
Farmasi, 416).

Kromatografi kertas, yang pada pelaksanaannya rumit dan lebih lama dibandingkan KLT, terutama digunakan
untuk pemisahan golongan senyawa sangat polar. Golongan zat itu adalah gula, alkohol bervalensi banyak,
asam amino, fenol dan asam fenilkarboksilat, asam organik alifatik, glikosida dan zat anorganik (kation) (Roth,
Analisis Farmasi, 418).

Penentuan kuantitatif dapat dilakukan secara langsung dan tidak langsung. Jika senyawa yang hendak
ditentukan untuk pengukuran kuantitatif diekstraksi dari fase stasioner, maka dinamakan penentuan tidak
langsung. Untuk penentuan jumlah dapat dipilih metode seperti mikrotitrimetri, pengukuran dalam daerah sinar
tampak dan UV, pengukuran refraksi, penentuan polarografi dan pengukuran fluorimetri. Penentuan kuantitatif
langsung dapat dilakukan melalui pembandingan luas secara visual masing-masing bercak dengan planimetri,
dengan densitometri, spektrofotometri, fluoresensi atau penentuan radioaktivitas pada penggunaan senyawa yang
dicacah. (Roth, Analisis Farmasi , hlm. 418)

D. KROMATOGRAFI KOLOM (KK)

1. ALAT KROMATOGRAFI KOLOM terdiri atas :
 TEORI ANALISIS KROMATOGRAFI

a. Tabung kromatografi: tabung silinder dari kaca, kecuali jika pada monografi disebutkan terbuat dari
bahan lain. Ukuran kolom bervariasi, yang umum digunakan dalam analisis farmasi mempunyai diameter
dalam 10-30 mm, panjang kolom 150-400 mm, tidak termasuk tabung pengalir.
Sebuah tabung pengalir dengan diameter lebih kecil untuk mengeluarkan cairan, yang menyatu dengan
tabung kromatografi atau disambung melalui suatu sambungan anti bocor pada ujung bawah tabung
utama. Tabung pengalir umumnya berdiameter dalam 3-6 mm, dapat dilengkapi dengan sebuah kran
untuk mengatur laju aliran pelarut yang melalui kolom dengan teliti.

b. Batang pemampat yang diperlukan untuk memadatkan wol kaca/kapas pada dasar tabung jika diperlukan,
serta untuk memadatkan zat penjerap atau campuran zat penjerap dan air secara merata di dalam tabung.
Kadang-kadang digunakan cakram kaca berpori yang melekat pada dasar tabung untuk menyangga isinya.
Batang pemampat merupakan suatu batang silinder melekat kuat pada sebuah tangkai dari plastik, kaca,
baja tahan karat, atau aluminium, kecuali dinyatakan lain dalam monografi. Tangkai batang pemampat
biasanya mempunyai diameter yang lebih kecil dari kolom dan panjangnya minimal 5 cm melebihi
panjang efektif kolom. Diameter batang ± 1 mm lebih kecil dari diameter dalam kolom.
(FI IV, hlm. 1006-1007)

2. JENIS KROMATOGRAFI KOLOM

a. KK Adsorpsi
Pada KK adsorpsi, campuran yang akan dipisahkan berupa zat uji, diletakkan berupa pita pada bagian atas
kolom penjerap yang berada pada tabung kaca, logam, atau plastik. Fase gerak atau pelarut dibiarkan
mengalir melalui kolom karena aliran yang disebabkan oleh gaya gravitasi atau didorong oleh tekanan.
Pita senyawa linarut bergerak melalui kolom dengan laju yang berbeda sehingga terjadi pemisahan dan
diperoleh kromatogram. Senyawa yang memisah ini berupa fraksi yang dapat ditetapkan dengan cara
titrasi, spektrofotometri, atau kolorimetri, atau pelarutnya dapat diuapkan sehingga diperoleh zat aktif
yang diinginkan dalam keadaan hampir murni. (Bobbit, Pengantar Kromatografi, hlm. 160)

Zat penjerap (misalnya aluminium oksida yang telah diaktifkan, silika gel, tanah diatomae terkalsinasi,
atau tanah silika yang dimurnikan untuk kromatografi) dalam keadaan kering atau dalam campuran
dengan air, dimampatkan ke dalam tabung kromatografi kaca atau kuarsa. Zat uji yang dilarutkan dalam
sejumlah kecil pelarut, dituangkan ke dalam kolom dan dibiarkan mengalir ke dalam zat penjerap. Zat
berkhasiat diadsorpsi dari larutan secara kuantitatif oleh bahan penjerap berupa pita sempit pada
permukaan atas kolom. Dengan penambahan pelarut lebih lanjut melalui kolom, oleh gaya gravitasi atau
dengan memberikan tekanan, masing-masing zat bergerak turun dalam kolom dengan kecepatan tertentu,
sehingga terjadi pemisahan dan diperoleh kromatogram. Laju gerakan zat dipengaruhi oleh sejumlah
variabel, misalnya daya adsorpsi zat penjerap, ukuran partikel dan luas permukaan, sifat dan polaritas
pelarut, tekanan yang digunakan dan suhu sistem kromatografi. (FI IV Hlm 1007)

Jika senyawa yang terpisah itu berwama atau berfluoresensi di bawah cahaya UV, kolom penjerap dapat
dikeluarkan dengan cara memotong melintang, lapisan yang diperlukan dapat dipisahkan. Senyawa yang
dikehendaki diekstraksi dari tiap lapisan dengan pelarut yang sesuai. Jika senyawa tidak berwama,
letaknya dapat diketahui dengan cara memberi warna atau menyemprot kolom yang telah dikeluarkan
dengan pereaksi yang dapat membentuk wama. Zat radioaktif yang dikromatografi dapat diketahui
letaknya dengan menggunakan pencacah Geiger-Muller atau alat yang sejenis. Tabung plastik yang jernih
terbuat dari bahan seperti nilon, yang bersifat inert terhadap kebanyakan pelarut dan transparan terhadap
cahaya UV gelombang pendek, dapat diisi zat penjerap dan digunakan sebagai kolom kromatografi.
Kolom semacam itu dapat disayat dengan pisau yang tajam, tanpa mengeluarkan isi kolom dari
tabungnya. Jika digunakan zat penjerap yang berfluoresensi, kolom dapat ditandai di bawah cahaya
UVsebelum disayat.(FI IV hlm 1007)

Kromatografi "mengalir", yang digunakan secara luas diperoleh dengan prosedur mengalirkan pelarut
melalui kolom sehingga obat yang dipisahkan keluar bersama pelarut, ini disebut “eluat”. Kadar obat di
 TEORI ANALISIS KROMATOGRAFI

dalam eluat dapat ditetapkan dengan cara titrasi, spektrofotometri atau kolorimetri, atau pelarutnya dapat
diuapkan, sehingga diperoleh obatnya dalam keadaan hampir murni. Jika terdapat zat berkhasiat yang
kedua, elusi dapat dilanjutkan dengan pelarut yang sama atau pelarut lain yang mempunyai daya elusi
yang lebih kuat. Efisiensi pemisahan dapat diuji dengan membuat kromatogram lapis tipis dari masing-
masing fraksi. (FI IV hlm 1007)

Kadang-kadang digunakan cara yang dimodifikasi untuk menambahkan campuran pada kolom. Obat
dalam bentuk padat, misalnya serbuk tablet tanpa pemisahan dari eksipien dicampur dengan sebagian zat
penjerap dan dimasukkan ke dalam kolom. Selanjutnya aliran pelarut membawa obat turun dari kolom
dengan cara seperti yang telah diuraikan di atas. (FI IV, hlm. 1007).

b. KK Partisi
Pada kromatografi partisi, zat yang harus dipisahkan terbagi antara dua cairan yang tidak saling
bercampur. Salah satu cairan yaitu fase diam, umumnya diadsorpsikan pada penyangga padat, karena itu
mempunyai area permukaan yang sangat luas terhadap pelarut yang mengalir (fase gerak). Kontak cairan
dengan cairan secara berturutan yang berulang-ulang terjadi, menghasilkan efisiensi pemisahan yang
tidak dapat dicapai dengan cara ekstraksi cair-cair biasa. (FI IV hlm 1007)

Penyangga padat umumnya bersifat polar dan fase diam yang teradsorpsi bersitat lebih polar daripada
fase gerak. Penyangga padat yang banyak digunakan adalah tanah silika untuk kromatografi, seperti
Celite 545 yang dicuci dengan asam, dengan ukuran partikel yang sesuai sehingga fase gerak dapat
mengalir dengan baik. Pada kromatografi partisi fase balik, fase diam yang teradsorpsi bersifat kurang
polar daripada fase gerak dan zat penjerap padat dibuat nonpolar dengan perlakuan yang sesuai
menggunakan pereaksi silanisasi, seperti diklorodimetilsilana sehingga dihasilkan tanah silika yang
tersilanisasi untuk kromatografi. (FI IV hlm. 1007)

1) Sampel yang akan dianalisis dengan kromatografi umumnya dimasukkan ke dalam sistem
kromatografi menggunakan salah satu dari dua cara berikut:
a) Larutan uji dalam sejumlah kecil fase gerak dimasukkan ke dalam kolom
b) Larutan uji dalam sejumlah kecil fase diam dicampur dengan penyangga padat dan dimasukkan ke
dalam kolom sebagai lapisan di atas campuran fase diam dan zat penjerap.

Elusi dilakukan dengan pelarut yang mengalir. Umumnya sebelum digunakan, fase gerak dijenuhkan
dahulu dengan fase diam.

Pada kromatografi partisi cair-cair yang konvensional, derajat partisi suatu senyawa tertentu di antara
dua fase cair dinyatakan sebagai koefisien partisi atau koefisien distribusi. Dalam hal senyawa yang
terdisosiasi, distribusi dapat diatur dengan jalan modifikasi pH, tetapan dielektrik, kekuatan ion, serta
sifat-sifat lain dari kedua fase tersebut. Elusi selektif komponen-komponen suatu campuran dapat
dicapai dengan mengubah fase gerak sampai diperoleh koefisien partisi yang lebih baik atau dengan
jalan mengubah pH fase diam secara in situ dengan suatu fase gerak, yang terdiri dari larutan asam
atau basa yang sesuai dengan pelarut organik.

2) Jika tidak dinyatakan lain dalam monografi, maka penetapan kadar dan pengujian, yang menggunakan
kromatografi kolom partisi, dilakukan menurut metode umum berikut:
a) Penyangga padat Gunakan tanah silika yang telah dimurnikan. Pada kromatografi kolom partisi
fase balik, gunakan tanah silika yang tersilanisasi untuk kromatografi.
b) Fase diam Gunakan pelarut atau larutan yang tertera pada monografi. Jika akan digunakan
campuran cairan sebagai fase diam, campurkan cairan tersebut sebelum diadsorpsikan pada
penyangga padat.
 TEORI ANALISIS KROMATOGRAFI

c) Fase gerak Gunakan pelarut atau larutan yang tertera pada monografi. Jenuhkan dengan air jika
fase diam merupakan larutan dalam air, jika fase diam berupa cairan organik polar, jenuhkan
dengan cairan tersebut.
d) Pembuatan kolom kromatografi Jika tidak dinyatakan lain dalam monografi, tabung
kromatografi mempunyai diameter dalam ± 22 mm dan panjang 200-300 mm, tanpa cakram
berpori. Pada tabung ini dilekatkan tabung pengalir tanpa kran dengan diameter dalam ± 4 mm dan
panjang ± 50 mm
 Mampatkan segumpal wol kaca halus pada dasar tabung.
 Masukkan fase diam yang volumenya telah ditentukan dalam gelas piala berukuran 100-250
mL, tambahkan sejumlah tertentu penyangga padat dan campur hingga homogen.
 Masukkan campuran ini ke dalam tabung kromatografi, mampatkan dengan tekanan sedang
agar diperoleh massa yang serba sama. Jika jumlah penyangga padat ditentukan lebih dari 3 g,
pindahkan campuran ke dalam kolom dalam bagian-bagian yang banyaknya ± 2 g, dan
mampatkan setiap bagian. Jika untuk penetapan kadar atau pengujian diperlukan kolom
bersegmen banyak dengan fase diam yang berlainan untuk masing-masing segmen, lakukan
pemampatan setelah penambahan tiap segmen, kemudian langsung ditambahkan segmen
berikutnya. Jika larutan uji dicampurkan dengan fase diam, masukkan secara kuantitatif ke
dalam tabung dengan membilas gelas piala yang dipakai untuk membuat campuran yang akan
diuji dengan suatu campuran yang terdiri dari ± 1 g penyangga padat dan beberapa tetes pelarut
yang dipakai untuk membuat larutan uji.
 Mampatkan segumpal wol kaca halus di atas kolom. Fase gerak mengalir melalui kolom
dengan laju aliran sedang atau menetes perlahan-lahan jika digunakan kromatografi fase balik.

3) Prosedur
a) Masukkan fase gerak ke dalam kolom dan biarkan mengalir melalui kolom oleh gaya gravitasi.
b) Bilas ujung kolom kromatografi dengan ± 1 mL fase gerak sebelum mengubah komposisi fase
gerak dan sesudah selesai elusi.
c) Jika zat uji ditambahkan pada kolom sebagai larutan dalam fase gerak, biarkan agar seluruhnya
melalui isi kolom, kemudian tambahkan sejumkah kecil fase gerak beberapa kali, tiap kali biarkan
jumlah pelarut mengalir seluruhnya melewati kolom, sebelum menambahkan sisa fase gerak.
d) Bila pada penetapan kadar atau pegujian dikehendaki pemakaian kolom kromatografi ganda yang
dihubungkan secara seri serta penambahan fase gerak dalam jumlah terbagi, biarkan tiap bagian
tersebut seluruhnya melewati kolom, dan bilas ujungnya tiap kali dengan fase gerak sebelum
penambahan sisa pelarut berikutnya. (FI IV, hlm. 1007-1008).

E. KROMATOGRAFI GAS
1. PRINSIP
Kromatografi gas adalah prosedur pemisahan zat yang dapat menguap dan mengalami proses migrasi diferensial
dinamis dalam sistem yang terdiri dari fase gerak gas dan fase diam cairan yang dilapiskan pada penyangga
padat inert atau fase diam padatan. Zat yang diinjeksikan akan menguap dalam kolom, selanjutnya fase gerak gas
akan membawa zat tersebut melalui fase diam sehingga zat akan terdistribusi di antara dua fase dan
menunjukkan perbedaan mobilitas berdasarkan perbedaan tekanan uap pada suhu kolom.

Mekanisme pemisahan pada kromatografi gas adalah partisi. Dalam proses partisi ini perilaku zat terlarut
ditentukan oleh suatu nilai perbandingan partisi K' yang disebut faktor kapasitas. Tetapan K' adalah
perbandingan jumlah atau waktu tinggal relatif zat dalam kedua fase tersebut. Besamya faktor kapasitas dan
waktu tertahannya zat dalam suatu kolom kromatografi gas-cair tergantung dari hal-hal zat terlarut spesifik, fase
cair spesifik, jumlah fase cair, suhu, dan laju aliran gas. Hasil pemisahan dalam kolom akan diukur oleh detektor
yang selanjutya direkam menjadi kromatogram. Penentuan kuantitatif zat didasarkan pada pengukuran luas
atau tinggi puncak yang terekam dalam kromatogram. (FI IV, hlm. 1012; Bobbit, Pengantar Kromatografi, hlm.
13; Vogel’s Textbook of Quantitative Chemical Analysis 5th Ed p. 240)
 TEORI ANALISIS KROMATOGRAFI

2. PENYELESAIAN KUALITATIF DAN KUANTITATIF (Roth, Analisis Farmasi, 430)

Identifikasi cuplikan yang sudah terpisah dapat dilakukan dengan bantuan senyawa pembanding dan waktu
retensi yang diperoleh, yang merupakan tetapan zat yang spesifik. Yang juga dapat digunakan adalah detektor
spesifik zat. Pada pemeriksaan campuran senyawa yang tidak diketahui atau senyawa alam seringkali perlu
untuk melakukan reaksi kimia terlebih dahulu. Dengan demikian misalnya dari campuran hidrat arang, olefina
dapat dihilangkan dengan cara mencuci dengan asam sulfat pekat dan kembali dilakukan kromatografi.
Jika kromatografi gas dilengkapi dengan pengumpul fraksi, maka terhadap senyawa yang terisolasi dapat
dilakukan reaksi kimia atau prosedur spektroskopi. Penyelesaian kuantitatif kromatogram gas didasarkan atas
pengukuran luas puncak yang umumnya adalah proporsional dengan konsentrasi senyawa dalam gas pembawa.

3. BIDANG PENGGUNAAN (Roth, Analisis Farmasi, hlm. 431)

Secara prinsip kromatografi gas dapat digunakan untuk semua zat yang berbentuk gas atau dapat menguap
tanpa penguraian. Zat padat seringkali dapat menguap melalui derivatisasi. Sekarang mungkin dilakukan
pemisahan hampir semua senyawa obat seperti alkaloid, senyawa aktif sintetik, gula, lemak, steroid, asam amino
secara kromatografi gas. Bahkan senyawa polimer dapat dikarakterisasi secara kromatografi gas, jika dipirolisis
terlebih dahulu dan fragmen yang terjadi diperiksa. Data analitik yang diperoleh dari kromatografi gas
dibandingkan dengan bilangan pengenal fisika lain seperti titik lebur, titik didih, indeks bias, dan sebagainya.
Dalam hal ketelitian data kuantitatif sesuai dengan ketelitian prosedur laboratorium lainnya. Dengan
perlengkapan peralatan yang sesuai, dengan bantuan kromatografi gas dapat diperoleh sejumlah mikropreparatif
senyawa murni.

F. KROMATOGRAFI EKSKLUSI (FI IV, 1008-1009)

1. PRINSIP
Pemisahan yang tergantung pada pertukaran molekul terlarut di antara pelarut fase gerak dan pelarut yang sama
dalam pori-pori bahan pengisi kolom. Rentang ukuran pori bahan pengisi kolom menentukan rentang ukuran
molekul pada pemisahan yang terjadi. Disebut kromatografi permeasi gel jika digunakan fase gerak organik
atau kromatografi filtrasi gel jika digunakan fase gerak yang mengandung air.

2. ALAT
Kolom kromatografi yang berisi bahan yang mampu melakukan fraksinasi pada rentang ukuran molekul yang
sesuai dan dapat dikendalikan suhunya. Fase gerak melalui kolom dengan laju aliran tetap, baik oleh gravitasi
atau menggunakan pompa yang sesuai.Saluran luar dihubungkan dengan detektor yang dilengkapi dengan
perekam otomatis.

3. PROSEDUR
Pembuatan fase diam:
a.Agarosa FC Butiran mengembang berdiameter 60 μm – 140 μm, dibuat dalam bentuk suspensi 4% dalam
air. Digunakan untuk pemisahan protein dengan BM 6 x 10 4 s/d 2 x 107 dan polisakarida dengan BM 3 x
103 s/d 5 x 106
b. Agarosa FC, ikatan silang, untuk pemisahan protein dengan BM 6 x 10 4 s/d 20 x 106 dan polisakarida
dengan BM 3 x 103 s/d 5 x 106
c.Silika gel FC (ukuran partikel ± 10 µm, hidrofil) dapat bercampur dengan larutan yang mengandung air pH
2 s/d 8 dan pelarut organik. Digunakan untuk pemisahan protein dengan BM 1 x 103 s/d 3 x 105

4. CONTOH CARA MELEWATKAN SAMPEL MELALUI KOLOM

Contoh dilewatkan melalui kolom dengan salah satu cara sebagai berikut:
a. Alirkan langsung ke permukaan kolom tanpa kolomnya dibiarkan kering
b. Lapisan di bawah fase gerak, untuk contoh yang lebih berat dari fase gerak
c. Memakai adaptor pengalir
d. Memakai alat penyuntik melalui septum
e. Memakai katup penyuntik
 TEORI ANALISIS KROMATOGRAFI

5. CONTOH PENETAPAN BM
a. Lakukan pengujian dan bahan baku kalibrasi seperti pada monografi
b. Buat grafik volume retensi dari baku kalibrasi sebagai fungsi logaritma BM
c. BM dapat diperkirakan dari kurva kalibrasi

6. CONTOH PENETAPAN KOMPOSISI RELATIF

a. Lakukan pengujian dengan kondisi seperti pada monografi
b. Jika seluruh komponen menunjukkan respon yang sama terhadap detektor jumlah relatif tiap komponen
diperoleh dengan membagi masing-masing luas puncak dengan jumlah luas puncak komponen yang
diinginkan.
c. Jika respon tidak sama, komposisi dapat dilihat dari kurva kalibrasi dengan baku kalibrasi seperti tertera
pada monografi.