Cinética

Enzimática
 Enzimas são proteínas que agem como
catalisadores biológicos:

Composto B (produto)
enzima
Reação
catalisada
pela enzima

Composto A (substrato)

Centro ativo
ou
sítio catalítico Observe que não há consumo
de uma enzima é a porção ou modificação permanente da
da molécula onde ocorre a enzima
atividade catalítica
 Teoria da catálise
v1
Considere as reações: A + B C
v-1

No equilíbrio da reação, as velocidades das reações se igualam: v1 = v-1

- concentrações de todos os reagentes não se alteram mais
- pode se dizer que a reação terminou

Catalisador acelera as velocidades de ambos os lados da reação

- o ponto do equilíbrio é atingido mais rápido

- o ponto do equilíbrio não se altera, ou seja [reagentes]

e de [produtos] no “final” da reação” são as mesmas da
reação não catalisada
- termodinâmica da reação não se altera

Catalisador não é consumido na reação pode atuar em [ ] baixas

 Teoria da catálise
O gráfico mostra a variação de energia ao longo de uma reação.

Energia de ativação ou barreira

Estado de transição energética:
Reação não quantidade de energia
catalisada que é preciso fornecer aos
Energia
de reagentes para a reação ocorrer
ativação
Estado de transição ou
Energia

complexo ativado:

Reação forma molecular inter-

Substrato (S)
catalisada mediária entre o reagente e
o produto, existe somente
Produto (P)
no alto da barreira
Progresso da reação energética.
É altamente instável.

Um Catalisador diminui a barreira energética criando percursos alternativos

da reação para formação do estado de transição.
Algumas proteínas, enzimas em especial, contêm em sua molécula
uma porção não proteica, que é essencial para atividade biológica.

metal Distinção entre cofator e

Grupo coenzima depende da força
cofator
prostético de ligação com a
coenzima apoproteína. Ex: o NAD+
pode ser cofator de uma
Enzima enzima (ligação fraca) e ser
holozima
coenzima de outra (ligação
forte). O mesmo ocorre com
Apoenzima os metais.
parte proteica

ativa
Coenzima Reação com Vitamina

Grupo
Prostético
inativa Biocitina CO2 Biotina
Coenzima A Grupos acil Ác. Pantotênico
Coenzima B12 H e grupos alquil Vitamina B12
FAD, FMN óxido-redução Riboflavina
Coenzimas participam do ciclo NAD, NADP óxido-redução Niacina
catalítico das enzimas
recebendo ou fornecendo Fosfato de piridoxal Grupos aminos Piridoxina
grupos químicos para a reação Pirofosfato Tiamina Grupos aldeídos Tiamina
Tetrahidrofolato unidades C Ácido fólico
Algumas enzimas formam intermediários covalentes
com seus substratos
Grupo reativo Intermediário
Enzimas
no sítio ativo covalente
Quimotripsina
Elastase
Esterases
Trombina
Tripsina

Papaína Enzimas com o mesmo

Gliceraldeído-3-PO4 tipo de mecanismo
desidrogenase catalítico, ou seja,
possuem o mesmo grupo
Fosfatase alcalina
de aminoácidos no sítio
Fosfoglicomutase
ativo, formam
intermediários covalentes
Fosfoglicerato mutase similares
Succinil-CoA sintase

Aldolase
Descarboxilases
Enzimas dependentes
de piridoxal fosfato
Enzimas são específicas para o reconhecimento de seus substratos.

Modelo Chave-Fechadura

Emil Fisher (1950)

Formas rígidas Modelo chave-fechadura
• o reconhecimento (especificidade) do
substrato pela enzima.
• o sítio ativo da enzima é pre-formado e
tem a forma complementar à molécula
do Substrato, de modo que outras
moléculas não teriam acesso a ela.
Modelo Chave-Fechadura
No entanto, o modelo chave-fechadura
não explica a interação das enzimas com
E e S se deformam, para inibidores e análogos dos substratos.
otimizar o encaixe

Daniel Kosland (1970)

Modelo de encaixe induzido
• o contacto com a molécula do substrato
induz mudanças conformacioais na
enzima, que otimizam as interações com
os resíduos do sítio ativo.
Carboxipeptidase A é uma enzima digestiva da classe das
metaloproteinases.
Em A: o sítio catalítico dessa enzima é formado pelos resíduos (em vermelho)
de Tyr248 (acima, à direita) e de Glu270 (centro), e um átomo de Zn2+, que está
acima do Glu270.

A B

Em B: A ligação do substrato dipeptídico glicil-L-tirosina (em verde) causa uma profunda

mudança conformacional nas vizinhanças do sítio ativo da carboxipeptidase A.
Mecanismo de ação da quimotripsina,
quimotripsina
um exemplo típico de uma serino protease
Enzima interage
com substratos
aromátcos Ligação a ser hidrolisada A H2O entra no sítio
ativo e forma uma
ponte de H+ com a
His-57

Tríade catalítica
Ser – His - Asp

A H2O transfere H+
para a His-57 e –OH
A Ser-195 transfere H+ para o substrato,
para His-57 formando um formando um segundo
estado de transição estado de transição
tetraédrico com o tetraédrico
substrato. O Asp-102
estabiliza o próton na His-
57 fazendo uma ligação
iônica

O H+ é transferido da His-
57 para o substrato. A
ligação susceptível é
clivada, e parte do
substrato fica ligado
covalentemente à enzima
CINÉTICA ENZIMÁTICA

Victor Henri (1903): E + S ⇔ ES

Afirmou que um complexo enzima-substrato é um passo essencial na
catálise enzímática

1913
Leonor Michaelis -Enzimologista
Maud Menten - Pediatra

K1 Kp
E+S ES E+P
K-1

Etapa rápida Etapa lenta

A velocidade da reação apresenta três regiões de comportamento
diferente, a medida que se aumenta a concentração do substrato:

-parte a: v aumenta proporcionalmente

com aumentos de S.
-parte b: v aumenta não proporcional-
mente com aumentos de S.
-parte c: v não aumenta mais, tendendo
a um valor máximo (Vmax),
sendo independente da [S]

O gráfico mostra um conjunto de reações

que estão acontecendo simultâneamente,
conforme as equações abaixo:
Enzimas – Componentes da Reação

K1 K3

E+S K2
ES v
P+E
e-x s-x x

K1 = Cte de velocidade de formação do complexo

K2 = Cte de velocidade de dissociação do complexo
K3 = Cte de velocidade de cecomposição do complexo formando o produto
v = Velocidade de formação do produto
s = Molaridade inicial do substrato
e = Molaridade inicial da enzima
x = Molaridade do complexo no instante t
ENZIMAS
CINÉTICA ENZIMÁTICA

Cinética Enzimática

Determinar as constantes de afinidade do S e

dos inibidores;
Conhecer as condições ótimas da catálise;
Ajuda a elucidar os mecanismos de reação;
Determinar a função de uma determinada
enzima em uma rota metabólica.
Enzimas
Cinética enzimática
K1 K3
E+S ES E +P
K2 K4

Estabilidade do complexo ES pode ser

expressa pela relação entre as velocidades
de dissociação e de formação do complexo

K2+ K3 Específico
Km = para cada
K1
enzima
 Cinética Enzimática

Atividade Enzimática
Estudante A
 
Nota

☺ Estudante B

☺ Estudante C

0 1 2 3 4 0 1 2 3 4
Capítulos Prova Concentração Substrato

Com o aumento na concentração do substrato,

observa-se uma mudança na Atividade Enzimática
Juang RH (2004) BCbasics
↓
S

P
+

(em u m período fixo de tempo)

8
8

Substrato (µmole)
7

6
6
5

4
4
3
2

2
1
0

0
80

60

40

20

0
Produto
Aumento na Concentração do Substrato
 Cinética Enzimática
Teoria do Regime Estacionário

E + S E S E +P
No estado estacionário, a produção e o consumo do
estado de transição dá-se na mesma taxa. Desta
forma, a [ ] no estado de transição mantêm-se cte.
Juang RH (2004) BCbasics
Concentração do complexo ES em regime
estacionário

S
P
Concentração

ES
E

Tempo de Reação
 Cinética enzimática
K1 K3
E+S ES E +P
K2

Michaelis e Menten expressaram matematicamente a velocidade da

reação pela fórmula:

Onde Vm é
Vm . [S]
V= velocidade máxima da
Km +[S] reação
 Cinética enzimática
V

V máx

Vmax
2

[S]
Km= [S]

Numericamente, Km pode ser expresso como o

[substrato] necessária para que a velocidade da
reação seja metade da velocidade máxima
 A constante de Michaelis-Menten (KM) é um parâmetro cinético que traz
informações sobre a afinidade que a enzima tem pelo substrato.

O KM é numéricamente igual à [substrato] que

produz metade da Vmax .
Substituindo na equação v por Vmax/2, vemos:

Vo=Vmax Vmax = Vmax.[S]

2 2 Km + [S]
Vmax.Km + Vmax.[S] = 2Vmax.[S]
KM = k-1+ k2
Vmax.Km = Vmax.[S] Km = [S]
k1
Considerando a afinidade da E pelo seu S, temos 2 casos:
1. E tem baixa afinidade por S 2. E tem alta afinidade por S

Quando Vd é mais alta do que Vf Quando Vf é mais alta do que Vd

k-1+ k2 = grande Km alto k-1+ k2 = pequeno Km baixo
k1 = pequeno k1 = grande
Uma outra forma de se obter os valores de KM e de Vmax é através do gráfico dos
duplos recíprocos (1/V x 1/S), e da equação de Lineweaver-Burk. Aplicando-se o
inverso a ambos
os lados da
equação de
Michaelis-Mentem,
obtem-se a
equação de
Lineweaver-Burk,
que é uma função
linear (uma reta):

Tang α =KM/Vmax

A interseção da reta com o eixo x é igual a -1/KM equação

y = a . x + b de reta
substituindo y = 0 na equação, temos: Onde:

0 = Km . 1 + 1 -1 = Km . 1 a = coef. angular = Km/Vmax

Vmax [S] Vmax Vmax Vmax [S] (tangente ângulo alfa)

-1 = Km -1 = 1 b = coef. linear = 1/Vmax

[S] Km [S] (interseção com o eixo y)
 A velocidade da reação
somente é proporcional à
[E]
quando a enzima está
saturada, ou seja, reação é
de ordem zero (independe)
em relação a [S]

Eficiência catalítica

Kcat/Km
- k2 ou kcat (constante catalítica) mede o “poder
catalítico” da enzima Parâmetro mais adequado
para comparações
v = k2 Etotal + [P] k2 = Vmax (s-1)
[ES] [Etotal] cinéticas

Para calcular kcat considera-se que toda a E existe como ES, e que v=Vmax
 Exemplo de Cinética Enzimática (Invertase)
1) Usar uma qtidade pré-defininada de Enzima→ E
2) Adicionar o Substrato em várias concentrações.→ S (x )
3) Medir o produto em um Tempo fixo (P/t)→ vo (y )
4) (x, y) Plote (curva hiperbólica), estimar → Vmax
5) Quando y = 1/2 Vmax obtêm x ([S]) → Km
Vmax
1
vo vo
1/2
-1
Km 1
Vmax
Dobro recíproco 1/S Km Plotagem S
 Exemplo real de cinética Enzimática
Substrato Produto Velocidade Dobro recíproco
Data

no [S] Absorbância v (µmole/min) 1/S 1/v

1 0.25 0.21 → 0.42 4 2.08
2 0.50 0.36 → 0.72 2 1.56
3 1.0 0.40 → 0.80 1 1.35
4 2.0 0.46 → 0.92 0.5 1.16
(1) O produto foi medido por espectroscopia a 600 nm
(2) (2) Tempo de reação 10 min
Lineweaver-Burk
1.0
2.0
Plotagem Direta

Dobro recíproco
v
1/v 1.0
0.5
1.0
-3.8
0
0 1 2 0
[S] -4 -2 0 2 4
1/[S]
 Cinética Enzimática
Plotagem Direta Significância
kcat /Km Vmax [S] zero order
vo=
Km + [S] 1st order
kcat Observe de vo sob
Vários [S], resultou E3
No na plotagem do E2
Turn over rendimento E1
Vmax and Km

k3 [Et] Vmax & Km

Competitivo
Unid. de Atividade Velocidade Afinidade com Duplo recíproco
1 µmole Máxima Substrato

Inibição
min
Não-competitivo
Ativ. Especifica NÚMERO DE RENOVAÇÃO
(TURNOVER NUMBER)
unit Atividade nº de mols de substrato
mg
convertido em produto por mol
de enzima em unidade de Imcompetição
tempo
Conclusões sobre Km
Pequena [substrato] é
Km necessária para a reação
atingir metade da Vmáxima

Afinidade da enzima pelo substrato

Grande [substrato] é
Km necessária para a reação
atingir metade da Vmáxima

Afinidade da enzima pelo substrato

Conclusões sobre Km
Km Afinidade da enzima pelo substrato

Km Afinidade da enzima pelo substrato

v
V

Vmáx
V

V/2
V/2
ENZIMAS
1/V

Km Km
Km Km s
[s] -1/Km -1/Km
1/s
Conclusões sobre Km

 Característico de cada enzima

 Reflete a afinidade da enzima pelo seu
substrato
 É numericamente IGUAL a [substrato] na
qual a velocidade da reação é metade da
Vmáxima
Ordem de
Reação
Influência da concentração de substrato
sobre a atividade enzimática
•Mantidas fixas as condições de
- temperatura ótima
- pH ótimo
- [enzima]

Velocidade
da reação
Cinética de
ordem zero

Cinética de
1a ordem

[S]
Influência da concentração de
substrato sobre a atividade
enzimática
Baixa concentração de substrato

E E S
S + E E E E
P
E E +
E E E E P

Formação do produto é PROPORCIONAL à

concentração de substrato
 Influência da concentração de substrato
sobre a atividade enzimática
3/4 de saturação do centro ativo da enzima
S S S P
E E E E E E P
S + + P
E E E E E E P
S S P
P

100 % de saturação do centro ativo da enzima

S S S P P
E E E E E E
S P
+ E E + P
S E E E E
S S P P
S
P
P
Formação do produto é PROPORCIONAL à
concentração de substrato
Influência da concentração de substrato
sobre a atividade enzimática

[Substrato] em excesso

S
S S
E E S S E E P P
S S + E E
S E E E E E E + P P
S S S S P P
P
S S P
S
S S S
S
Velocidade da reação independe da [S] S
Influência da concentração de substrato
sobre a atividade enzimática

Quando a
formação de P for Quando a velocidade
proporcional à [S] da reação independe
a reação é de da [S] a reação é de
1a ORDEM ORDEM ZERO
Velocidade
da reação

v = Vmax
v = K[S]

[S]
 Cinética Enzimática
Devido à ascensão
gradual da curva
hiperbólica é Não se pode
difícil determinar calcular com
quando foi atingida a exatidão os valores
Vmáx de Km e Vmáx
Velocidade
da reação

[S]
Considerações Finais

 Apresentam alto grau de especificidade;

 São produtos naturais biológicos;
 Reações baratas e seguras;
 São altamente eficientes, acelerando a velocidade das
reações (108 a 1011 + rápida);
 São econômicas, reduzindo a energia de ativação;
 Não são tóxicas;
 Apresenta um mercado em crescente expansão
Perguntas ?
 Para mais informações, visite as páginas abaixo:

http://www.brenda.uni-koeln.de/

http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/CSA/

http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/merops.cgi?id=index;action=clanid