Despliegue:

Los PMN obtenidos de sangre venosa periférica, contenidos en TBST se

colocan los fago-péptidos de la librería en un relación 1:2 con los PMN, durante 1
hr con agitación cada 10 minutos, se realizan 10 lavados con TBST , se rompe la
interacción PMN/fago-péptido con Glicina-HCl pH2.2 al 0.2M durante 10 minutos y
se neutraliza con Tris-HCl pH9.1 al 1M se recupera 1 a 10 µl de eluido, se coloca
en un cultivo de E. coli ER2738 con MOI de 0.5, medio LB tetraciclina 20 µg/ml, y
se deja incubar a 37ºC por 4.5Hr. en agitación, se centrifuga a 10,000xg por 10
minutos a 4ºC, el sobrenadante se coloca 1/6 de volumen de PEG/NaCl y se
precipita una noche a 4ºC, se centrifuga a 10,000xg a 4ºC por 10 minutos, recuperar
el sobrenadante, centrifugar 1 hr a 4000 rpm, este procedimiento se repite 3 veces,
el fago-péptido precipitado en PEG/NaCl del 3er biopanning se resuspende en TBS-
azida al 0.2%

2ª Selección

3ª Selección

Figura 3. Esquematización de la selección de fagopéptidos específicos para

moléculas de adhesión de polimorfonucleares.

5.3.8.2.- Titulación de fagopéptidos

 En un cultivo de E. coli ER2738 con MOI de 0.5, en medio LB con tetraciclina
5 µg/ml, y se deja incubar a 37ºC por en agitación, se colocan10 µl de fago-péptidos
(diluciones seriadas en LB) y se incuban 10 min a temperatura ambiente, se
colocan en TOP agar (LB 0.7%agar), la mezcla es vertida en placas con agar LB
tetraciclina 5 µg/ml, que contienen Xgal e IPTG y se leen las placas líticas en 24 Hr.