Procedure:

INORGANIC PHOSPHORUS
OSR6122 AND OSR6222
 This procedure is valid for the following chemistry analyzers:

 AU400/AU400e  AU640/AU640e
 AU480  AU680
 AU600  AU2700
 AU5400  AU5800

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 Procedure:
INORGANIC PHOSPHORUS
OSR6122 AND OSR6222

PRINCIPLE:
Measurements of inorganic phosphorus are used in the diagnosis and 
treatment of various disorders including parathyroid gland and kidney 
diseases, and vitamin D imbalance.

In 1925, Fiske and Subbarow1 described a method for the determination of 
phosphorus in protein­free blood filtrates using ammonium molybdate. 
Aminoaphtholsulfonic acid was employed as a reducing agent. Many reducing
agents have since been introduced, among them ferrous sulfate (first 
introduced by Summer2). This methodology offered the advantage of working 
in a slightly acid medium, thereby permitting greater specificity in dealing 
with mixtures of phosphates and phosphate esters. Taussky and Shorr 3 in 
1953 improved the methodology by using ferrous ammonium sulfate, which is
more stable than ferrous sulfate. In 1957, Dryer, Tammes, and Routh4 
increased the sensitivity of the reaction by measuring the absorbance at 340 
nm rather than the previously recommended 650 to 750 nm.

INTENDED USE:
System reagent for the quantitative determination of Inorganic Phosphorus 
in human serum or urine on Beckman Coulter AU Clinical Chemistry 
analyzers.

METHODOLOGY:
The Beckman Coulter AU System Phosphorus method is based on a 
modification of the method developed by Daly and Ertingshausen5 in which 
inorganic phosphate reacts with molybdate to form a heteropolyacid complex.
The use of a surfactant eliminates the need to prepare a protein free filtrate. 
The absorbance at 340/380 nm is directly proportional to the inorganic 
phosphorus level in the sample.

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                                                                         H+

Phosphate + Molybdate     Heteropolyacid complex

SPECIMEN:
PATIENT PREPARATION:
A fasting serum specimen is recommended, but not required. 

24­hour specimen required for urine, acidify with HCl after collection.

Additional instructions for patient preparation as designated by this laboratory:

TYPE:
Serum samples free from hemolysis, are the recommended specimens. 
Remove serum from clot as soon as possible to minimize hemolysis. 

EDTA, fluoride oxalate or citrate should not be used when measuring 
inorganic phosphorus.

Timed, 24­hour collection is recommended for urine specimens. Urine 
specimens should be manually pre­diluted 1:10 with water before analysis
on the AU600 Analyzer in Standard Measure Mode. 

Please note that there is a diurnal variation in urine phosphate excretion, 
with the highest output occurring in the afternoon. 6

Additional type conditions as designated by this laboratory:

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HANDLING CONDITIONS:
Serum samples are stable up to 8­hours when stored at room temperature 
(15 ­ 25°C) or up to one week when stored refrigerated at 2 ­ 8°C.7
Urine may contain larger quantities of organic phosphates, which can decompose on exposure to elevated temperatures. When 

acidified with HCl, urine phosphate is stable for more than 6 months.
8

Additional handling conditions as designated by this laboratory:

EQUIPMENT AND MATERIALS:

EQUIPMENT:

Beckman Coulter AU400/AU400e, AU480, AU600, AU640/AU640e, 
AU680, AU2700, AU5400 and AU5800 analyzers.

MATERIALS:
Beckman Coulter AU System Inorganic Phosphorus Reagent

Final concentration of reactive ingredients:
Ammoniumheptamolybdate 0.35 mmol/L
Sulphuric acid 200 mmol/L
Glycine 50 mmol/L
     Also contains preservatives.
Reagent storage location in this laboratory:

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      Test tubes 12 ­16 mm in diameter or sample cups  (Cat No. AU1063).
Storage location of test tubes or sample cups in this laboratory:

Beckman Coulter Chemistry Calibrator  (Cat. No. DR0070)

Beckman Coulter Urine Chemistry Calibrator  (Cat. No. DR0090)

Storage location of the calibrator in this laboratory:

Precautions:

1. For in vitro diagnostic use.

2. WARNING! Corrosive, strong acid. Avoid ingestion or contact with 
skin or eyes. In case of contact, immediately flush affected areas 
with water and seek medical attention. Obtain medical attention 
immediately for eye contact or ingestion.

3. WARNING: POTENTIAL BIOHAZARDOUS MATERIAL. The 
Chemistry calibrator (DR0070) and Urine Chemistry calibrator 
(DR0090) are manufactured from materials of human origin.  No 
test method can offer complete assurance that HIV­ 1/2, HCV, 
Hepatitis B, or other infectious agents are absent from biological 
materials, all calibrator material should be handled at the 
Biosafety Level 2 as recommended for any infectious human serum 

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or blood specimen in the CDC/National Institutes of Health 
manual, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 
1993.

PREPARATION:
The Beckman Coulter AU System Inorganic Phosphorus reagent is liquid, 
ready to use. No preparation is needed.

The Beckman Coulter Chemistry Calibrator reconstitution:  

 Remove the vials of calibrator and diluent from storage and let 
stand at room temperature (15­25C) for 5 minutes.

 Remove the cap and stopper from the vials of the lyophilized serum 
and reconstituting diluent.

 Using a volumetric pipette or a calibrated air­displacement 
pipettor, add exactly 5.0 mL of reconstituting diluent to DR0070 
lyophilized serum vial.  DO NOT pour directly from the 
reconstituting diluent vial.  

 Replace the cap and stopper to the vial of lyophilized serum 
immediately after adding the diluent

 Allow the calibrator to stand for 5­10 minutes.  Gently swirl the 
contents until completely dissolved.

The Beckman Coulter Urine Chemistry Calibrator is liquid, ready to use.  
No preparation is needed.

Storage Requirements:
1. The unopened reagents are stable until the expiration date printed 
on the label when stored at 2 ­8 °C.

2. Opened reagents are stable for 30 days when stored in the 
refrigerated compartment of the analyzer.

3. Contamination after opening must be avoided.

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4. Un­reconstituted calibrator and diluent are stable until the 
expiration date stated on the label when stored at 2 ­ 8°C.

5. For Phosphorus, reconstituted calibrator materials are stable for 7 
days from the date of reconstitution when stored at 2 ­ 8°C.  The 
materials should be capped and stored upright 2 ­ 8°C when not in 
use.

6. Urine Chemistry calibrator is stable until the expiration date 
printed on the label when stored at 2 ­ 8°C.

7. Once opened vials of Urine Chemistry Calibrator are stable for 30 
days.

Indications of Deterioration:
Discoloration of the reagent, visible signs of microbial growth, 
turbidity or precipitation in reagent may indicate degradation and 
warrant discontinuance of use.

Additional storage requirements as designated by this laboratory:

PERFORMANCE PARAMETERS:
The following data was obtained using this Inorganic Phosphorus Reagent on
Beckman Coulter AU analyzers according to established procedures. Results 
obtained at individual facilities may differ.

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PRECISION:14
Estimates of precision, based on CLSI recommendations6, are consistent 
with typical performance. The within run precision for serum samples is 
less than 3%CV and total precision is less than 5%CV. Assays of control 
sera were performed and this data reduced following CLSI guidelines.

SERUM
N=100 Within run Total
Mean, mg/dL SD CV% SD CV%
2.01 0.04 1.9 0.04 2.1
5.7 0.03 0.6 0.05 0.9

URINE
N=100 Within run Total
Mean, mg/dL SD CV% SD CV%

30.8 0.2 0.8 0.5 1.6

78.1 0.5 0.6 2.08 2.7

METHOD COMPARISON14:
Patient samples were used to compare the Beckman AU System 
Inorganic Phosphorous Reagent.  Representative performance data on 
AU analyzers is shown in the next table.

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SERUM
Y Method AU640/AU640e
X Method AU600
Slope 0.962
Intercept 0.11
Correlation Coeff. (r) 1.000
No. of Samples (n) 177
Range (mg/dL) 0.5 – 17.9

URINE
Y Method AU640/AU640e
X Method AU600
Slope 0.992
Intercept 0.09
Correlation Coeff. (r) 0.9996
No. of Samples (n) 171
Range (mg/dL) 2.6 – 199.8

Sensitivity:
Typical change in absorbance for 1 mg/dL Inorganic Phosphorus is 30 
Absorbance.

CALIBRATION:
STANDARD PREPARATION:
Perform a one­point calibration (AB) using a water blank (blue rack) and 
the appropriate calibrator in a yellow calibration rack.  The frequency of 
calibration is every 30 days. Calibration of this Inorganic Phosphorus 

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procedure is accomplished by use of the Beckman Coulter Chemistry 
Calibrator (Cat No. DR0070), which is traceable to the New England 
Reference Laboratory (NERL) standard.

For Urine calibration:  Perform a one­point calibration (AB), using a water
blank (blue rack) and the appropriate calibrators in a yellow calibration 
rack.  The frequency of calibration is once in 30 days. Calibration of this 
urine procedure is accomplished by use of the Beckman Coulter Urine 
Chemistry Calibrator (Cat No DR0090).  The assay values for the 
constituents of this calibrator are traceable to the National Institute of 
Standards and Technology (NIST)

CALIBRATION PROCEDURE:
Recalibration of this test is required when any of these conditions exist:

1. A reagent lot number has changed or there is an observed shift in 
control values.

2. Major preventative maintenance was performed on the analyzer.

3. A critical part was replaced.

QUALITY CONTROL:
During operation of the Beckman Coulter AU analyzer at least two levels of 
an appropriate quality control material should be tested a minimum of once a
day. In addition, controls should be performed after calibration, with each 
new lot of reagents, and after specific maintenance or troubleshooting steps 
described in the appropriate AU User’s Guide. Quality control testing should 
be performed in accordance with regulatory requirements and each 
laboratory’s standard procedure.

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Location of controls used at this laboratory.

ANALYZER PARAMETERS:
A complete list of test parameters and operating procedures can be found in 
the appropriate User’s Guide and at www.beckmancoulter.com.

CALCULATIONS:
For serum SI units (mmol/L), multiply the results by 0.323.

REPORTING RESULTS:
REFERENCE RANGES:
 Serum 12  Urine 8

Adults 2.5 ­ 5.0 mg/dL 0.3 ­ 1.3 g/24 hours

Children 4.0 ­ 7.0 mg/dL 0.5 ­ 0.8 g/24 hours

Beckman Determined Range:13       Serum    3.7 ­ 7.2 mg/dL
      

Expected values may vary with age, sex, diet and geographical location. 
Each laboratory should determine its own expected values as dictated by 
good laboratory practice.

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Expected reference ranges in this laboratory:

PROCEDURES FOR ABNORMAL RESULTS:

Abnormal results are flagged by the listed analyzers according to the 
normal values entered by the user into the instrument parameters.

REPORTING FORMAT:
Results are automatically printed for each sample in mg/dL at 37°C. 

Additional reporting information as designated by this laboratory:

LIMITATIONS:
The Beckman Coulter AU System Inorganic Phosphorus procedure is linear 
from 1.0 to 20.0 mg/dL for serum determinations and from 10 to 200 mg/dL 
for urine determinations. Samples exceeding the upper limit of linearity 
should be diluted and repeated. The sample may be diluted, repeated and 
multiplied by the dilution factor automatically utilizing the AUTO REPEAT 
RUN.

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INTERFERING SUBSTANCES:
Results of studies9 show that the following substances interfere with this 
phosphorus procedure.

The criteria for no significant interference is recovery within 10% of the 
initial value.
Bilirubin: No significant interference up to 40 mg/dL Bilirubin
*Hemolysis: No significant interference up to 350 mg/dL Hemolysate**
**Lipemia: No significant interference up to 900 mg/dL Intralipid*

**Hemolysis must be avoided as Phosphate may be split off from labile 
esters in the erythrocytes.10

* Intralipid, manufactured by KabiVitrium Inc., is a 20% IV fat emulsion 
used to emulate extremely turbid samples.

The information presented is based on results from Beckman Coulter 
studies and is current at the date of publication. Beckman Coulter Inc., 
makes no representation about the completeness or accuracy of results 
generated by future studies. For further information on interfering 
substances, refer to Young11 for a compilation of reported interferences 
with this test.

In very rare cases gammopathy, especially monoclonal IgM 
(Waldenstrom’s macroglobulinemia), may cause unreliable results. 
Laboratory specific procedure notes:

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REFERENCES:
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2. Summer, J.B., Science, 100: 413, 1944.

3. Taussky, H.H., Shorr, E., J Biol Chem, 202: 675, 1953.

4. Dryer,   R.L.,   Tammes,   A.R.   and   Routh,   J.I.,   J   Biol   Chem,   225:   177,
1957.

5. Daly, J.A. and Ertingshausen, G., Clin Chem, 18: 263, 1972.

6. CLSI/NCCLS, Evaluation Protocol EP5­A, 1999.

7. Henry, R.J., Cannon, D.C. and Winkleman, J.W., Clinical Chemistry
Principles and Technics, Second Edition, Harper and Row, 1974.

8. Pesce,   A.J.   and   Kaplan,   L.A.,   Methods   in   Clinical   Chemistry,   C.V.

Mosby Co., 1989.

9. CLSI/NCCLS,   Interference   Testing   in   Clinical   Chemistry,   EP7­A,

2002.

10. Tietz, N.W. (ed), Fundamentals of Clinical Chemistry, Third Edition,
W.B. Saunders, 1987.

11. Young,   D.S.,   Effects   of   Drugs   on   Clinical   Laboratory   Tests,   Fifth

Edition, AACC Press, 2000.

12. Tietz,   N.W.(editor),   Textbook   of   Clinical   Chemistry,   W.B.   Saunders,

1986.

13. Beckman Coulter Inc. data on samples collected from 200 blood donors
in North Texas.

14.  Data on file for specific AU analyzers.

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