Christian García Cortés BQD Grupo 1001

Análisis de Riesgos y Puntos de Control Críticos (HACCP)

Descripción del producto

El PEGFilgrastim se compone de la unión covalente de una molécula de Filgrastim (polipéptido de

175 aminoácidos) con una molécula de polietilenglicol (PEG) de 20 kDa al residuo N-terminal. Los
sitios de pegilación potenciales en rHuG-CSF son los grupos N-terminal y de aminoácidos de los
cuatro residuos de lisina. Este método se llama pegilación y aumenta el peso molecular a 39 kDa. La
adición de esta cadena PEG altera las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de la
molécula aunque conserva su actividad biológica. Le confiere a la proteína una mayor vida en el
suero sanguíneo, reduciendo la necesidad de la administración diaria, reducción de la eliminación
renal y reducción de la absorción celular y proteólisis. Este cambio aumenta de forma significativa
el tiempo que la proteína permanece en circulación de forma efectiva. Se produce por tecnología
del DNA recombinante en Escherichia coli, seguida de conjugación con polietilenglicol (PEG).

En el siguiente trabajo se realizará el ARPC del proceso de pegilación descrita en 1977 por
Abuchowsky y colaboradores, aplicada a la creación del producto biológico PEGFilgrastim, producto
recombinante humano del G-CSF.
La pegilación es la conjugación de una proteína y/o péptido con una o más moléculas de
polietilenglicol; esta técnica mejora la estabilidad física y térmica, protege contra la degradación
enzimática, mejora la solubilidad, prolongar la vida media en la circulación de la proteína. El
polietilglicol (PEG) es un poliéster lineal o ramificado con un grupo hidroxilo en cada extremo, no
inmunogénico y extremadamente soluble en agua y varios solventes orgánicos. Las moléculas de
PEG no son tóxicas (porque no interactúan con las estructuras biológicas, con los tejidos ni con los
órganos).

Materia Prima
 Cepa de Escherichia coli BL21 (DE3) comercializada por Novagen.
 Vector de expresión (plásmido pET23a)
 Medio M9 modificado (Khalilzadeh, et al. 2004)
 Clucosa, Na2HPO4*7H2O, KH2PO4, NaCl, (NH4) Cl, MgSO4*7H2O.

Intención de uso y destino

PEGFilgrastim está indicado para la reducción de la duración de la neutropenia y de la incidencia de

neutropenia febril en pacientes con tumores malignos tratados con quimioterapia citotóxica (con
excepción de leucemia mieloide crónica y síndromes mielodisplásicos).

La dosis recomendada de PEGFilgrastim es de 6 mg (una jeringa precargada) por cada ciclo de

quimioterapia, administrada en una inyección subcutánea aproximadamente 24 horas después de
la quimioterapia citotóxica.

Tras una única administración subcutánea de PEGFilgrastim, la concentración sérica máxima de

PEGFilgrastim ocurre de 16 a 120 horas después de la administración y las concentraciones séricas
se mantienen durante el periodo de neutropenia posterior a la quimioterapia mielosupresora. La
eliminación de PEGFilgrastim es no lineal con respecto a la dosis; la eliminación del suero de
PEGFilgrastim disminuye al aumentar la dosis. PEGFilgrastim parece eliminarse principalmente por
la eliminación mediada por los neutrófilos, que se saturan a altas dosis. Consistente con un
mecanismo de eliminación autorregulado; la concentración sérica de PEGFilgrastim disminuye
rápidamente al comenzar la recuperación de los neutrófilos. PEGFilgrastim presenta un mejor perfil
farmacocinético que Filgrastim, debido principalmente a reducir la aclaramiento renal.

Esquema General del Proceso de Producción

Proceso de Pegilación del rHuG-CSF

Una vez terminada la purificación de la rHuG-CSF por Cromatografía de Intercambio Iónico:

Catiónica así como una cromatografía en gel (exclusión por tamaño), se procede a realizar la adición
del grupo polietilenglicol a la proteína.

Los sitios preferidos para la modificación de las proteínas con Pegilación son los grupos alfa o épsilon
de la lisina o el grupo amino N-terminal de la cadena polipeptídica. La molécula PEG más utilizada
es la metoxi-PEG (mPEG).

El primer paso en el proceso es la activación de la molécula PEG, la cual activa por alquilación
reductora en presencia de cianoborohidruro de sodio (NaCNBH3). Después de la activación se une
covalentemente a la proteína. En pH ácidos de 4-5 la molécula PEG activa reacciona
preferentemente con el residuo N-terminal del grupo amino (Veronese et al. 2005).
 Reactor de Pegilación

Se disuelve el rHuG-CSF a razón de 5 g/l, en una solución que contiene 100 mM de acetato de sodio
(NaCH3COO), 20 mM de cianoborohidruro de sodio (NaCNBH3) a pH=5 y 4 ºC. Se añade20 KDa
mPEG-aldehído en exceso molar (ratio molar mPEG/rHuG-CSF=5). La reacción se deja por espacio
de 10 horas con agitación y se mantienen las mismas condiciones. El 92% del rHuG-CSF se convierte
en monoPeg-rHuG-CSF, el otro 8% de rHuG-CSF es convertido en multiPEG-rHu-GCS; este multiPEG
puede incorporar moléculas PEG en su sitio activo y por lo tanto no tiene actividad biológica.

Purificación PEGFilgrastim

La purificación de proteínas pegiladas envuelve la remoción de todas las especies moleculares que
no sean parte del producto de interés, que pueden incluir a la proteína no modificada y a la proteína
con diferentes grados de pegilación (mono-, di-, tri-, etc.). Actualmente los procesos de purificación
de proteínas pegiladas están dominados por la cromatografía de exclusión molecular e intercambio
iónico (Mayolo et al. 2010, Cisneros Ruiz et al. 2009).

Cromatografía de intercambio iónico (IEC III): Catiónica

Se realiza una cromatografía de intercambio catiónico para concentrar la solución de momoPeg-

rHuG-CSF. La pegilación no modifica el punto isoeléctrico de la proteína (PI rHuGCSF=5,5-6), por eso
se decide utilizar una columna catiónica que trabaja a un pH=4. La columna contiene la resina SP-
Sepharose que tiene un volumen de carga de proteína de 110 mg/ml como se ha presentado
anteriormente. La columna se equilibra con tres lavados de solución tampón que contiene20 mM
de acetato sódido a pH=4. Se carga la solución que contiene el producto de interés y se lava tres
veces con la solución tampón de equilibrio, contiene 20 mM de acetato de sodio, 0,01% de
Polysobate 80 a pH=4. La elución se lleva a cabo con solución tampón de equilibrado con un
gradiente lineal de 0,5 M de NaCl. La proteína se colecta de acuerdo al perfil espectrofotométrico
del detector a una absorbancia de 280nm. Después de su utilización la columna se regenera con el
lavado de una solución de 1 mM de NaCl y se higieniza con un lavado de HCl 0,1 M en 0,5 M NaCl
que se deja en contacto un mínimo de 4 horas, para eliminar las impurezas. Después se lava con
agua, y finalmente se equilibra con solución tampón. Las fracciones que contienen Peg-rHuG-CSF se
reunen y se purifica el monoPEGFilgrastim en GFC.