1. ¿Qué aplicaciones prácticas tienen los métodos de cuantificación de microorganismos?

La cuantificación de microorganismos es un elemento crítico en los estudios de ecología

microbiana y microbiología clínica. No solo es importante conocer al responsable de un efecto
benéfico o identificar al microorganismo potencial de causar alguna infección severa, sino
también es importante saber el número de microorganismos implicados, para establecer si
éstos serán capaces de desarrollar una función benéfica o perjudicial.

 Determinación del número de microorganismos en una muestra.

 Determinación de la actividad metabólica, biomasa y proteínas.

Es un método muy utilizado en diferentes áreas como por ejemplo:

 Industria alimenticia (leches, jugos, néctares)

 Hospitalaria (procesos patológicos infecciosos)

2. ¿Qué técnicas se emplean comúnmente para lograr el aislamiento de bacterias y obtener

cultivos puros?

Aislamiento Consiste en separar los microorganismos de interés de una comunidad microbiana ,el
aislamiento es importante porque se obtienen cultivos para estudios detallados y controlados de
laboratorio y para su aplicación en biotecnología y en microbiología ambiental e industrial.

El aislamiento se logra por medio de cultivo selectivo para el organismo que se desea aislar, e
inhibir el crecimiento de otros microorganismos no deseados pero sin afectar a la especie o grupo
que se desea aislar.

• Método de siembra para aislamiento por agotamiento o en estría

• Método de siembra para aislamiento por diluciones sucesivas

Consiste en diluir una muestra hasta conseguir muy pocas células que, tras inocularse en un medio
de cultivo, generen colonias aisladas.
• Metodología: ahora tomamos 0.1 ml de cada tubo y lo depositamos en una placa petri con
medio de cultivo. Con un asa de vidrio se extiende esa cantidad sobre la placa, e incubams a 37 ºC
durante 24 horas.
En la primera dilución habrá un amasijo de colonias. En la siguiente habrá diez veces menos
número de colonias, y así sucesivamente hasta conseguir colonias aisladas. Este método nos
permite calcular el número de microorganismos viables que existen en la muestra que estamos
analizando: N=C • 1/D • 1/i
donde:
N es el número de microorganismos presentes en la muestra
C es el número de colonias contadas UFC (unidades formadoras de colonias)
D es la dilución
I es el inóculo
Debe haber entre 30 y 300 colonias. Si hay menos, no es significativo (puede tratarse de una
contaminación) y, si hay más, no están aisladas.

3. Mencione 5 medios de cultivo selectivos y (y/o diferenciales) así como las bacterias
generalmente aisladas en cada uno de ellos.

4. ¿Qué ventajas y desventajas encuentra entre los siguientes métodos de aislamiento: a) por
estría cruzada y b) por diluciones seriadas?

Con éste procedimiento se puede conseguir una buena separación de las colonias y aislarlas
fácilmente.

El éxito del aislamiento, de la separación sobre el medio de cultivo, depende de la superficie sobre
la que se ha distribuido la muestra. Es muy importante realizar el mayor número de estrías
posible. En las primeras estrías aparecerán colonias confluentes o una masa continua de
microorganismos. En las estrías finales deberán aparecer colonias separadas unas de otras. El
aislamiento requiere un reducido inóculo de partida. La sucesiva disminución del tamaño de la
población sobre el asa (por descarga sobre el medio de cultivo) al recorrer el medio de cultivo,
debe asegurar que finalmente algunas células queden suficientemente separadas (aisladas unas
de otras) sobre la superficie.

Diluciones seriadas

Un poco más meticuloso

Las dos técnicas de siembra por dilución presentan la ventaja de que permiten obtener un mayor
número de colonias aisladas que el método de siembra por estría, por tanto se eligen cuando se
ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios tipos de microorganismos.
5. ¿Cuál es el procedimiento que se sigue para obtener un cultivo puro a partir de un cultivo mixto
o contaminado en caldo?

PREPARACIÓN DE LAS DILUCIONES Y CONTEO DE POBLACIÓN MICROBIANA

1. Colocar los seis tubos con solución salina isotónica estéril en una gradilla e identificarlos
respectivamente con las diluciones 10-1 a 10-6
2. Con una pipeta estéril tomar 1 mL de la muestra y adicionarla al tubo identificado como 10-1
3. Mezclar y tomar 1 mL de esta dilución y vertir en el siguiente tubo marcado como 10-2 y así
sucesivamente hasta llegar a la dilución de 10-6
4. Se toma 1 mL de las últimas cuatro diluciones con ayuda de una pipeta estéril y se traspasa a
una caja de Petri vacía estéril.

5. Se vierte sobre el mililitro de muestra, agar nutritivo a 50 °C y se mezcla moviendo lentamente

la caja sobre la superficie de la mesa, describiendo con el movimiento de la caja el número 8.
6. Dejar que solidifique el agar e Incubar a 37 °C por 24 horas y efectuar el conteo de colonias.
Seleccionar las placas que muestren entre 30 y 300 colonias.
7. Calcular la cantidad de microorganismos por mililitro o gramo de la muestra con la siguiente
fórmula: UFC/mL= Promedio de las colonias contadas x recíproco de la dilución. El resultado se
expresa como unidades formadoras de colonias (UFC), no como número de microorganismos.
8. En caso de que el aislamiento no haya sido satisfactorio se recomienda tomar una asada de la
colonia e identificar y sembrarla en estría por 3 ó 4 cuadrantes en caja de Petri (subcultivos).
6. Describa el método de cuantificación de la gota o de Miles y Misra.
El método de Miles y Misra o conteo variable en superficie es una técnica utilizada para calcular el número
de unidades formadoras de una colonia en una suspensión bacteriana. Fue descubierto por Miles y Misra
en 1938.
El procedimiento de la técnica es el siguiente:

 Se preparan una serie progresiva de diluciones en serie de la suspensión bacteriana original, tantas
como sean necesarias.
 Los materiales necesarios son una micropipeta correctamente calibrada que pueda surtir gotas de
0.02ml y 6 placas de agar nutritivo. Estas placas se dividen en sectores numerados.
 La suspensión o dilución se coloca en forma de gotas (0.02ml) desde una altura de 2,5 cm; ésta se
dispersará aproximadamente en un área de 1.5 a 2.0 cm de diámetro.
 Cada una de las 6 placas tendrá una gota de cada dilución en el sector correspondiente (numerado)
 Periodo de incubación: 18-24 horas. Posteriormente, se observa su crecimiento.
 Los sectores en los que hay más de 20 colonias no muestran confluencia y son utilizados para realizar los
conteos de viabilidad.
 El número de bacterias viable por 0.02ml de una dilución se obtiene calculando la media de los contajes
para cada dilución en las 6 placas.

7. Describa el fundamento básico de los siguientes instrumentos útiles para realizar una cuenta
total de células en suspensión:
a) Cámara de conteo.
Esta cámara de recuento está adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases.
Consiste en una placa gruesa de cristal con forma de porta, cuya porción central está dividida en 3
bandas perpendiculares al eje longitudinal de la cámara. De ellas, las dos laterales se hallan
sobreelevadas 0,1 mm con respecto a la central, y en esta última hay grabado un retículo
cuadrangular. La banda central puede estar, a su vez, subdividida en 2 semibandas idénticas y
separadas por un surco paralelo al eje longitudinal de la banda. En cada una de estas dos
semibandas hay grabado un retículo idéntico.

b) Nefelómetro.
Un nefelómetro es un instrumento para medir partículas suspendidas en un líquido(turbidez).
FUNDAMENTO:
Esto lo hace usando una fotocelda colocada en un ángulo de 90° con respecto a una fuente
luminosa, a través del cual se ilumina la muestra para analizar que se encuentren una cámara
(fotocelda de lectura), las partículas de la suspensión dispersan la luz y esta luz va a un dispositivo
detector y luego el ensombrecimiento central junto a la fuente luminosa absorbe la luz directa de
la muestra a analizar. Cuanta mayor dispersión de luz se detecte e igual a mayor concentración del
analito buscado y a menos dispersión menor concentración.

c) Contador Coulter (Coulter Counter).

Un contador Coulter1 es un aparato utilizado para contar y medir el tamaño de partículas en
solución. Se utiliza principalmente para contar células sanguíneas en su aplicación como
contador hematológico, pero también se puede utilizar para contar bacterias, células
procariotas y partículas virales.
El principio Coulter se apoya en el hecho de que partículas moviéndose en un campo eléctrico
causan disturbios mensurables en ese campo. La magnitud de estos disturbios son
proporcionales al tamaño de las partículas inmersas en el campo. Coulter identificó varios
requerimientos necesarios para la aplicación práctica de este fenómeno. Primero, consideró
que las partículas deberían encontrarse suspendidas en un líquido conductor. Segundo, que el
campo eléctrico debería encontrarse físicamente restringido, de modo que el movimiento de
las partículas sumergidas en el campo causaran cambios detectables en la corriente. Y
finalmente, que las partículas debían encontrarse lo suficientemente diluidas como para
atravesar una a la vez la región de restricción física, previniendo de esta manera un artefacto
conocido como coincidencia.

8. Describa el fundamento básico de las siguientes técnicas útiles para realizar la cuenta viable de
células bacterianas en suspensión:

a) Tinción vital.

Es una técnica intermedio entre el examen en fresco y la tinción con fijación previa. Consiste en
teñir la muestra problema con colorantes muy diluidos, permitiendo al microorganismo acumular
parcialmente el colorante, el cual debe de estar muy diluida para que no sea tóxico para las
bacterias, y provocar la muerte de los microorganismos.

b) Filtración.

La filtración es una operación unitaria cuya finalidad es la separación de un sólido insoluble que
está presente en una suspensión solido-liquido, haciendo pasar dicha suspensión a través de una
membrana porosa que retiene las partículas sólidas.

c) Método de diluciones seriadas.

9. Indique como se prepara de manera general un tubo para trabajar la escala de McFarland.

Los estándares de McFarland son patrones de turbidez basados en suspensiones de sulfato de

bario.

La escala consta de 11 patrones (desde 0’5 hasta 10), cada uno de los cuales tiene una turbidez
comparable a la de una suspensión bacteriana con una densidad determinada.

Cada patrón es preparado mezclando ácido sulfúrico al 1% con una disolución de cloruro de bario
al 1’175% en las proporciones adecuadas.

1.- Preparamos todos los materiales necesarios en la cabina de seguridad.

2.- Comenzamos realizando las disoluciones de ácido sulfúrico al 1% en 500 mL y la de cloruro de bario al
1’175% en 50 mL. Cálculos:
ÁCIDO SULFÚRICO:
100 ml ————- 1g H2SO4
500 ml ————- x X= 5 g H2SO4.
CLORURO DE BARIO:

100 ml ———— 1’175g BaCl

50 ml ————– x X= 0’587 g BaCl.

3.- Con estos cálculos, realizamos las disoluciones de ambos en su correspondiente matraz. Primero,
vertemos un poco de agua para que el reactivo se mezcle con ella en un vaso de precipitado. Esto, lo
vertemos en su correspondiente matraz y lo enrasamos hasta llegar a la marca.

4.- Una vez preparamos las disoluciones, preparamos la escala tomando 25 mL como capacidad del tubo. De
tal forma que la tabla de disoluciones quedaría de la siguiente manera:

ESTÁNDAR H2SO4 1% BaCl 1’175% Nº BACTERIAS/ML

0’5 24’875 0’125 1’5 x 108
1 24’75 0’25 3 x 108
2 24’5 0’5 6 x 108
3 24’25 0’75 9 x 108
4 24 1 1’2 x 109
5 23’75 1’25 1’5 x 109
6 23’5 1’5 1’8 x 109
7 23’25 1’75 2’1 x 109
8 23 2 2’4 x 109
9 22’75 2’25 2’7 x 109
10 22’5 2’5 3 x 109