You are on page 1of 8

Percobaan Kimia Analitik

P8
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)
M.Satria Yudha Bagaskara

10516042, Kelompok 4, Shift Selasa, Praktikum KI2221 Cara Pemisahan dan Elektrokimia

Abstrak

Percobaan ini, akan ditentukan konsentrasi kafein dalam sampel dengan menggunakan
metode kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) dengan teknik kromatografi fasa terbalik.
Prinsip kerja metode HPLC ini adalah digunakan tekanan tinggi untuk mendorong pelarut
(fasa gerak) menuju suatu kolom (fasa diam) yang berisi partikel-partikel pengemasnya.
Fasa gerak yang digunakan pada percobaan ini adalah campuran 175 mL aquabidest, 1,75
mL H3PO4 5%, dan 75 mL methanol. Sementara, fasa diam yang digunakan adalah C-18
yang bersifat non polar. Sinyal yang didapat oleh detector kan ditampilkan pada integrator
(computer), nilai luas dari grafik yang terbentuk akan sebanding dengan nilai konsentrasi
yang dapat diperoleh melalui grafik antara konsentrasi (ppm) dan luas (mAUs),
didapatkan nilai konsentrasi kaffein pada sampel adalah 40,436 ppm.

Kata kunci: HPLC, kromatografi, kafein, fasa diam, fasa gerak

I. Pendahuluan
Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan yang didasarkan atas terpartisinya
senyawa-senyawa antara fasa diam dengan fasa gerak. Kromatografi cari merupakan salah satu
teknik kromatografi yang digunakan untuk memisahkan ion atau molekul yang terlarut dalam
suatu larutan. Terdapat beberapa jenis kromatografi cair, diantaranya: reverse phase
chromatography, High Performance Liquid Chromatography (HPLC), size exclusion
chromatography, serta supercritical fluid chromatography.
Kromatografi cair kinerja tinggi atau High Performance Liquid Chromatography
(HPLC) adalah salah satu teknik kromatografi yang digunakan secara luas terutama untuk fasa
terbalik. Fasa terbalik adalah suatu teknik kromatografi dengan menggunakan fasa diam yang
berupa fasa terikat dimana pastikel silika ditutupi dengan melapisinya dengan senyawa silena,
maka dapat digunakan fasa gerak terbalik karena kepolaran antara fasa-fasa tersebut dibalik.
Dalam kromatografi fasa terbalik, waktu retensi akan meningkat dengan meningkatnya karakter
non polar dari suatu senyawa.
Pelarut yang bersifat polar seperti air dan metanol merupakan eluen yang banyak
digunakan karena memiliki harga yang lebih murah jika dibandingkan dengan pelarut organik
lainnya. Selain itu, air dan metanol tidak berbahaya jika dibuang ke lingkungan. Eluen yang
digunakan merupakan fasa gerak yang lemah, dimana memiliki retensi yang besar. Metanol
memiliki kekuatan elusi yang besar jika dibandingkan dengan air.
Kafein adalah senyawa yang termasuk ke dalam golongan alkaloid. Alkaloid adalah
senyawa yang mengandung atom nitrogen dan strukturnya banyak ditemukan dalam tanaman.
Senyawa alkaloid umumnya memiliki rasa pahit dan seringkali memiliki sifat fisilogis aktif bagi
manusia. Kafein bertindak sebagai stimulan, yang dapat menstimulasi kerja jantung, pernafasan,
sistem syaraf pusat dan sebagai diuretik. Kafein biasanya ditemukan pada biji kopi, daun teh,
buah kola dan guarana. Kafein dapat dikonsumsi oleh manusia dengan mengekstrasinya dari biji
kopi dan daun teh.

II. Metoda

a. Alat dan Bahan

No. Alat Jumlah No. Bahan

1. Peralatan HPLC 1 buah 1. Larutan Standar 500 ppm kafein

2. Alat penyuntik 1 buah 2. Larutan 5% H3PO4

3. Penangas ultrasonik 1 buah 3. Metanol

4. Gelas kimia 4 buah 4. Air bidestilasi

5. Gelas ukur 4 buah 5. Produk minuman berkafein

6. Pipet tetes 4 buah

7. Pipet Volum 2 buah

8. Batang pengaduk kaca 4 buah

9. Corong 1 buah

10. Labu takar 25 mL 8 buah

11. Buret 50 mL 1 buah


12. Statif 1 buah

a. Cara Kerja

 Pembuatan Fasa Gerak (eluen)

Fasa gerak dibuat dengan mencampurkan campuaran senyawa dengan komposisi


175 mL aquabidest, 1,75 mL H3PO4 5%, dan 75 mL methanol, kemudian gas terlarut dalam
larutan dihilangkan dengan menggunakan ultrasonic bath.

 Penyiapan Larutan Standar

Larutan standar 500 ppm kafein, dibuat lima larutan standar dengan konsentrasi
masing-masing 40 ppm, 60 ppm, 80 ppm, 100 ppm, sebanyak 10 mL. Larutan standar 500
ppm kafein dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL dan dilakukan pengenceran dengan
eluen yang telah dibuat sebelumnya.

 Penyiapan Larutan Sampel

Gas terlarut dalam sampel dihilangkan terlebih dahulu dengan menggunakan


ultrasonic bath. Dilakukan pengenceran 2 mL sampel kedalam labu takar 10 mL dengan
menggunakan eluen yang telah dibuat sebelumnya.

 Analisis

Analisis dilakukan menggunakan alat HPLC. Cuplikan larutan standar dan sampel
disuntikan ke dalam alat HPLC, lalu direkam kromatogram masing masing larutan standard
sampel yang telah disiapkan. Dicatat parameter peralatan kromatografi yang digunakan,
seperti tekanan, jenis kolom yang digunakan, laju alir eluen, panjang gelombang detektor,
dan kecepatan kertas perekam.

III. Hasil dan Diskusi

a. Hasil pengamatan

Konsentrasi (ppm) Area (mAU*s)

20 835,0214
40 1557,16138

60 2617,78564

80 2991,57813

100 4125,43115

Sampel 1641,34363

Gambar 1. Grafik antara Luas Area dan Konsentrasi Standar Kafein

Berdasarkan grafik diatas didapat bahwa persamaan kurva yang terbentuk adalah = 40,076𝑥 +
20,085 , dengan y (1641,34363) adalah luas area yang terbentuk oleh sampel dan x sebagai
konsentrasi dari sampel. Sehingga dapat ditentukan konsentrasi dari sampel sebagai berikut.

1641,34363 = 40,076𝑥 + 20,085

1641,34363 − 20,085
𝑥= = 40,436 𝑝𝑝𝑚
40,07

Didapatkan konsentrasi sampel 40,436 ppm


b. Diskusi dan Pembahasan

Pada percobaan ini, ditentukan kandungan kafein yang terdapat dalam minuman berenergi
komersial dengan menggunakan metode KCKT fasa terbalik. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
(KCKT) atau High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu teknik
kromatografi untuk zat cair yang mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran,
memiliki kecepatan analisis yang tinggi dan dapat menganalisis secara kualitatif maupun
kuantitatif dengan variabel kualitatifnya adalah waktu retensi dari sampel. Pada KCKT fasa
terbalik, fasa diam yang digunakan berupa fasa terikat dimana partikel silika ditutupi dengan
senyawa silena dan fasa geraknya merupakan pelarut organik yang memiliki kepolaran lebih
besar jika dibandingkan dengan fasa diamnya.
Prinsip kerja dari KCKT adalah menggunakan suatu pompa bertekanan tinggi untuk
mendorong fasa gerak yang berupa pelarut (eluen) agar dapat melewati fasa diam yang berupa
kolom berisikan pertikel pengemas menuju detektor. Setelah larutan analit diinjeksikan, di
dalam kolom akan terjadi pemisahan komponen-komponen yang ada pada larutan. Komponen
yang memiliki sifat lebih polar akan berinteraksi dengan fasa diam pada kolom sehingga akan
lebih cepat keluar dari kolom dibandingkan dengan komponen lain yang bersifat kurang polar.
Waktu yang dibutuhkan komponen tersebut untuk sampai ke detektor dinamakan waktu retensi.
Di mana waktu retensi akan meningkat seiring dengan meningkatnya karakter nonpolar dari
suatu senyawa. Komponen-komponen yang sudah keluar dari kolom akan dideteksi oleh
detektor, kemudian direkam dalam bentuk kromatogram. Puncak-puncak yang muncul
menunjukkan konsentrasi komponen-komponen yang terdapat pada larutan analit. Dari
kromatogram yang diperoleh, dapat diketahui besar luar area, tinggi puncak, dan waktu retensi.
Instrumen-instrumen yang terdapat pada alat KCKT terdiri atas wadah fasa gerak,
pompa bertekanan tinggi, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor,
wadah penampung fasa gerak yang sudah melewati detektor, dan komputer (integrator atau
perekam). Berikut adalah diagram skematik sistem kromatografi cair kinerja tinggi :
Gambar 2. Diagram Skematik Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

1. Wadah fasa gerak


Berfungsi untuk menampung fasa gerak antara 1-2 L. Fasa gerak yang digunakan biasanya
berupa campuran pelarut yang dapat mempengaruhi daya elusi dan resolusi. Sehingga
sebelum digunakan, fasa gerak harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari zat
pengotor. Selain itu gas yang terkandung dalam fasa gerak juga harus dihilangkan agar tidak
mengacaukan proses analisis.
2. Pompa
Berfungsi untuk menjamin proses penghantaran fasa gerak berlangsung secara tepat,
konstan, dan terbebas dari segala gangguan. Pompa yang digunakan harus bersifat inert
terhadap fasa gerak. Laju alir eluen adalah 1 mL/menit.
3. Tempat injeksi sampel
Berfungsi sebagai tempat untuk menyuntikkan sampel.
4. Fasa diam dan fasa gerak
Fasa diam yang digunakan adalah silica yang di lapisi oleh senyawa silena. Fasa gerak yang
digunakan merupakan pelarut organik yang memiliki kepolaran yang lebih besar
dibandingkan dengan fasa diamnya. Sehingga dapat digunakan fasa gerak terbalik karena
kepolaran antara fasa-fasa tersebut terbalik
5. Detector dan sistem injeksi
Detektor yang digunakan adalah DAD (Diode Array Detector) berfungsi untuk mendeteksi
komponen yang telah dipisahkan di dalam kolom. Sedangkan sistem injeksi adalah ketika
sampel dimasukkan ke dalam kolom menggunakan alat penyuntik melalui gerbang injeksi.
Volume suntikan yang digunakan untuk proses injeksi adalah 20 µL.
6. Kolom
Berfungsi untuk melakukan proses pemisahan komponen-komponen sampel yang akan
diukur kromatogramnya. Pemisahan terjadi akibat perbedaan distribusi partikel dari
masing-masing komponen. Kolom yang digunakan merupakan bentuk kolom untuk fasa
terbalik.
Selain menggunakan metoda KCKT, kadar kafein dapat ditentukan dengan menggunakan
metida ekstraksi organik, titrasi iodometri, titrasi bebas air, atau bisa juga menggunakan
spektofotometri. Pada metoda ekstraksi organik, kafein diisolasi dari senyawa lain hingga diperoleh
produk berupa kristal. Kemudian dari produk tersebut dapat ditentukan kadar kafein yang terdapat
pada sampel. Namun metoda ini tidak memberikan hasil yang teliti karena terdapat kemungkinan
kafein dalam sampel tidak terisolasi seluruhnya. Selain proses isolasi membutuhkan waktu yang
sangat lama. Sehingga digunakanlah metoda KCKT fasa terbalik guna memperoleh kadar kafein
pada sampel secara teliti dan lebih cepat.

Gambar 3. Sruktur Kafein

Penggunaan KCKT fasa terbalik diawali dengan larutan standar kafein maupun larutan
sampel yang diencerkan menggunakan eluen yang terdiri atas campuran air-metanol-H3PO4.
Sebelumnya komponen gas yang terdapat pada eluen dihilangkan terlebih dahulu dengan ultrasonic
bath. Fasa diam yang digunakan pada percobaan ini adalah silika yang berikatan dengan senyawa
alkil C-18 bersifat non polar. Fasa gerak yang digunakan merupakan campuran metanol-air (3:7)
ditambahkan dengan H3PO4. Fasa gerak tersebut bersifat polar karena air merupakan fasa gerak
yang lemah dan memiliki retensi yang besar. Untuk fasa gerak pada metoda KCKT fasa terbalik,
kemampuan elusi akan menurun seiring dengan meningkatnya polaritas pelarut.
Kemudian dilakukan analisis terhadap larutan-larutan tersebut. Eluen dari kolom dimonitor
dalam bentuk adsorben. Adsorben berbanding lurus dengan konsentrasi, sehingga bentuk
kromatogramnya akan sebanding dengan jumlah kafein total yang terdapat di dalam sampel. Asam
fosfat (H3PO4) memiliki kepolaran yang lebih tinggi jika dibandingkan dengan kafein sehingga
memiliki waktu retensi yang lebih cepat. Sehingga sinyal yang ditangkap oleh detektor terlebih
dahulu adalah sinyal dari asam fosfat. Puncak yang dihasilkan oleh asam fosfat pada kromatogram
dapat disebut dengan puncak inisial. Kromatogram yang baik memiliki puncak inisial yang terpisah
dengan puncak analit sehingga mempermudah proses analisis. Untuk memisahkan puncak inisial
dengan analit dibutuhkan senyawa yang memiliki kepolaran yang lebih besar dibandingkan dengan
analit, namun tidak ikut bereaksi dengan analit maupun dengan fasa diam. Semakin besar
perbedaan kepolaran, maka akan semakin besar jarak antar puncak-puncak yang dihasilkan oleh
kromatogram. Sedangkan tinggi puncak pada kromatogram, menunjukkan semakin tinggi
konsentrasi pada larutan.
Dari kromatogram diperoleh data pengamatan berupa waktu retensi, tinggi puncak, dan luas
puncak. Berdasarkan grafik diatas didapat bahwa persamaan kurva yang terbentuk adalah
y=40,076x+20,085 , dengan y (1641,34363) adalah luas area yang terbentuk oleh sampel dan x
sebagai konsentrasi dari sampel. Diapatkan konsentrasi sampel 40,436 ppm.

IV. Kesimpulan

Didapatkan kadar kafein dalam teh berdasarkan luas kurva 40,436 ppm

V. Referensi

Braithwaite, A. and Smith,F.J. 1999. Chromatographic Methods, 5 th ed. Kluwer academic


Publisher: London. Hal 23-26, 258-266, 379-383.

D. A. Skoog, D. M. West: F. J. Holler Fundamental of Analytical Chemistry. 9th Ed. United


States: Global. 2014.

Day.R.A , Underwood.A.L, 2002. Analisis Kimia Kuantitatif, Edisi keenam, Erlangga,


Jakarta,. P 553-560

Harvey, David. 2000. Modern Analytical Chemistry. 1st ed. McGraw Hill. USA. hlm. 550-
556.