III.

METODOLOGI PENELITIAN

Metodologi penelitian meliputi aspek- aspek yang berkaitan dengan

preparasi sampel, bahan, alat dan prosedur kerja yang dilakukan, yaitu :

A. Sampel Uji Penelitian

Tanaman Ara diperoleh dari daerah Tanggamus yang diambil pada bulan

Agustus 2014 berupa akar keras yang terdapat di dalam tanah. Diambil 5 kg lalu

dikeringkan dengan diangin-anginkan dan terlindung dari cahaya matahari secara

langsung selanjutnya dipisahkan kulit dari bagian batang dan digiling menjadi

serbuk kemudian diayak dengan ukuran ayakan 65 mesh.

B. Bahan Penelitian

Aquades, heksana, kloroform, etil asetat, butanol, metanol, etanol 70%,

serbuk magnesium, serbuk DPPH, serbuk Natrium asetat anhidrat, serbuk AlCl3,

pereaksi sitroborat, serbuk silika, plat KLT GF254 dan DMSO.

C. Peralatan

Timbangan, oven, seperangkat alat gelas, lampu UV, spektroskopi UV -VIS,

1
spektrofotometer H-NMR, corong pisah, rotary evaporator, mikropipet dan

corong pisah.
 28

D. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan di :

1. Laboratorium Kimia Organik, Fakultas MIPA, Universitas Lampung.

2. Laboratorium Teranokoko, Balai Besar Pengawas Obat dan Makanan di

Bandar Lampung untuk pengujian HPTLC.

3. Laboratorium Kimia Analitik Universitas Malahayati di Bandar

Lampung untuk uji aktivitas antioksidan.

4. Pengujian 1 H-NMR di Laboratorium Kimia Institut Teknologi Bandung,

Bandung.

Waktu penelitian dilakukan pada bulan Januari sampai Juni 2015.

E. Cara Kerja

Isolasi senyawa flavonoid dilakukan dengan metode maserasi dilanjutkan

dengan KLT. Jenis KLT yang digunakan adalah KLT GF254 yang telah diaktivasi

dengan pemanasan dalam oven pada suhu 100oC (Sastrohamidjojo, 1991).

1. Uji Pendahuluan

Sejumlah 1,0 g serbuk bahan ditambah 100 mL air panas (80oC), aduk dan

didiamkan selama 5 menit dan saring. Filtrat digunakan sebagai larutan uji.

Ditambahkan 5 mg serbuk magnesium dalam 5 mL larutan uji, 1 mL asam klorida

pekat dan 2 mL amil alkohol dikocok dengan kuat dan biarkan memisah.
 29

Terbentuknya warna kuning hingga merah jingga pada lapisan amil alkohol

menunjukkan adanya senyawa flavonoid (Harborne et al., 1987).

2. Ekstraksi Senyawa Flavonoid

Sejumlah 105 g serbuk kering akar tanaman Ara diekstraksi secara maserasi

menggunakan heksana sampai diperoleh filtrat jernih. Ampas dikeringkan

kemudian diekstraksi dengan etanol 70% berkali-kali hingga diperoleh filtrat jenih.

Masing-masing ekstrak dipekatkan dengan penguap vakum putar sehingga

diperoleh ekstrak kental (Adam et al., 2002; Fan et al., 2006). Selanjutnya yang

digunakan untuk penelitian adalah ekstrak etanol. Bagan isolasi simplisia tersebut

seperti terlihat pada Lampiran 1.

Ekstrak etanol pekat kemudian diekstraksi dengan heksana lalu dikumpulkan

dan dipekatkan sehingga diperoleh ekstrak kental heksana (Fraksi A). Fraksi air

kemudian diekstraksi dengan kloroform selanjutnya dikumpulkan dan dipekatkan

hingga diperoleh fraksi kloroform pekat (Fraksi B). Fraksi air diekstraksi kembali

dengan etil asetat selanjutnya dikumpulkan dan dipekatkan hingga diperoleh

fraksi kental etil asetat (Fraksi C). Fraksi air diekstraksi kembali menggunakan

butanol selanjutnya dikumpulkan dan dipekatkan hingga diperoleh ekstrak butanol

pekat (Fraksi D)(Harborne, 1987; Qing et al., 2005). Diagram alir dari proses

fraksinasi di atas dapat dilihat pada Lampiran 2.

 30

a. Uji Kualitatif Flavonoid

Masing-masing fraksi (A, B, C dan D) diverifikasi kandungan flavonoidnya

dengan mengambil sejumlah 10 mg fraksi kental di atas dan diuji seperti prosedur

pada uji pendahuluan.

b. Uji Total Flavonoid

Uji kuantitatif dilakukan untuk mempertegas keberadaan senyawa flavonoid

dalam fraksi di atas, karena bila hasilnya nol berarti bisa saja hasil positif pada uji

kualitatif di atas bersifat bias/palsu.

Uji kuantitatif dinyatakan sebagai jumlah flavonoid total menggunakan

metode yang diperkenalkan oleh Chang et al. (2002). Metode ini menetapkan

flavonoid sebagai senyawa kuersetin sehingga dalam perlakuannya menggunakan

kuersetin sebagai baku pembanding.

Prosedurnya adalah sebagai berikut : Sebanyak 5 mg kuersetin ditimbang dan

dilarutkan dalam 10 mL metanol sebagai larutan stok (500g/mL) lalu diencerkan

sedemikian rupa sehingga diperoleh konsentrasi larutan 40 – 120 g/mL. Ambil

0,5 mL larutan lalu tambahkan 1,5 mL metanol; 0,1 mL AlCl 3 10%; 0,1 mL Na

asetat anhidrat 1M dan 2,8 mL aquades. Inkubasi selama 30 menit lalu ukur

absorbansinya pada  415 nm. Buat persamaan regresi linearnya.

 31

Sampel uji ekstrak kloroform dengan konsentrasi 1000 g/mL dan ekstrak etil

asetat 1000 g/mL dilarutkan dalam metanol. Tambahkan 0,1 mL AlCl3 10 %;

0,1 mL Na asetat anhidrat 1M dan 2,8 mL aquades. Inkubasi selama 30 menit lalu

ukur absorbansinya pada  415 nm.

Kadar flavonoid total dilakukan dengan mengukur absorbansi senyawa uji

lalu diekstrapolasikan menggunakan persamaan regresi linear serangkaian seri

kadar kuersetin standar yang telah diukur absorbansinya sehingga kadar total

flavonoid sampel ditentukan sebagai kadar kuersetin (mg QE/100 g bahan ).

3. Identifikasi Senyawa Flavonoid

Proses KLT dilakukan pada fraksi yang positif mengandung flavonoid

dengan prosedur berikut :

Cairan pengembang : Dilakukan proses optimasi

Jarak rambat : 10 cm

Pengembangan : Menaik

Penotolan : Bentuk garis

Pendeteksi : Sinar UV 254/366

Bercak pada KLT yang terbentuk selanjutnya disemprot dengan pereaksi

sitroborat. Bercak positif flavonoid ditandai dengan warna kuning yang berpendar

di bawah UV 366 (Markham, 1988).

 32

4. Kromatografi Kolom

Isolasi dilakukan dengan menggunakan kromatografi kolom gravitasi.

Langkah pertama diawali dengan melakukan impregnasi ekstrak pekat

menggunakan eluen yang akan dipakai berupa penambahan silika gel dengan

komposisi berat ekstrak dan silika gel (1 : 10). Impregnasi dilakukan agar

komponen ekstrak terdistribusi merata dalam silika sehingga proses kromatografi

kolom akan lebih teratur dan terkontrol. Eluen yang digunakan sama dengan

eluen pada proses KLT yang diperoleh dengan cara optimasi. Hasil elusi

ditampung dalam vial – vial berukuran 15 mL dan keberadaan senyawa yang

tereluen dikontrol dengan melakukan penotolan pada plat KLT. Untuk vial yang

memberikan bercak yang sama dapat digabungkan satu sama lain.

5. Penentuan Struktur Flavonoid

Penentuan struktur flavonoid dilakukan dengan menginterpretasi data-data

1
dari spektroskopi H-NMR terhadap senyawa uji yang diperoleh dari

kromatografi kolom. Penentuan struktur difokuskan pada senyawa yang memiliki

indikasi antioksidan yaitu dengan melihat pola kromatogram pada plat KLT yang

positif terhadap sitroborat dan larutan DPPH 0,2%.

 33

6. Uji Aktivitas Antioksidan

a. Uji Kualitatif

Sebelum diuji potensi antioksidannya, plat KLT disemprot dengan larutan

DPPH 0,2%. Positif antioksidan ditandai dengan perubahan warna larutan DPPH

pada bercak KLT dari biru menjadi kuning setelah 30 menit.

b. Uji Potensi Antioksidan (IC50)

Potensi antioksidan dilakukan dengan tahap berikut :

i). Pembuatan larutan DPPH

Larutan pereaksi adalah DPPH dalam metanol yang selalu dibuat baru dan

dijaga pada suhu rendah dan terlindung dari cahaya. Larutan DPPH dibuat pada

konsentrasi yang memberi serapan pada angka sekitar 1,0 yaitu pada konsentrasi

50-100 M (Molyneux, 2004).

ii). Pembuatan seri konsentrasi larutan uji

Ditimbang 5 mg senyawa uji lalu dilarutkan dalam metanol sehingga

diperoleh konsentrasi 10, 20, 30, 40 dan 50 ppm. Selanjutnya tambahkan DPPH

50 g/mL dengan perbandingan volume yang sama (1:1) pada setiap seri

konsentrasi dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37oC. Absorbansi diukur

pada  515 - 517 nm tergantung pada  maksimal hasil optimasi. Untuk kontrol

positif digunakan larutan vitamin C dengan kadar 2, 5, 7, 10 dan 50 ppm dan

diperlakukan sama seperti pada larutan uji

 34

Nilai absorbansi yang diperoleh kemudian dikonversi menjadi nilai IC 50

dengan cara membuat persamaan garis regresi linear, y = bx + a dengan

ketentuan y = daya hambat terhadap DPPH dan x= kadar senyawa uji.

Prosentase daya

hambat dihitung dengan persamaan berikut :

% daya hambat = 1 – Absorbansi senyawa uji /Absorbansi DPPH x 100 %

Nilai IC50 merupakan hasil ekstrapolasi dari persamaan y = bx + a di atas.

Nilai ini menggambarkan kadar suatu senyawa yang dapat menonaktifkan

separuh dari kekuatan radikal bebas DPPH. Interpretasi dari IC 50 seperti pada

Tabel 6 berikut.

Tabel 6. Nilai IC50 dan potensi antioksidannya (Molyneux, 2004)

Kriteria Nilai IC50

Sangat kuat < 50 ppm
Kuat 50 – 100 ppm
Sedang 101 – 250 ppm
Lemah 251 – 500 ppm
Tidak bersifat antioksidan > 500 ppm