Instituto Politécnico Nacional.

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas.

1. Laboratorio de Métodos de Análisis.

2. “Separación e identificación de aminoácidos de jugos de frutos

por cromatografía bidimensional en capa fina”.

3. Alumno: Sarabia Hernández Edgar Jasiel.

4. Grupo: 4IM1 5. Sección: II.

6. Profesor: Luis Francisco Vázquez Flores.

7. Fechas de trabajo experimental: 25 y 28 de Septiembre de 2015.

8. Fecha de entrega: 9 de Octubre de 2015.

9. Situación escolar: Inscrito.

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Práctica. “Separación e identificación de aminoácidos de jugos de frutos por
cromatografía bidimensional en capa fina”.

 Objetivos.

1. Conocer y aplicar la técnica de cromatografía bidimensional en capa fina para la

separación de aminoácidos de una muestra de jugo de frutos.
2. Aplicar el cálculo de Rf como un método de comparación e identificación en
muestras problema.
3. Determinar las fuentes de error que afectan a la cromatografía bidimensional en
capa fina.

 Introducción.

La cromatografía es un método analítico de separación e identificación de compuestos. Existen

mezclas demasiado complejas en los cuales sus componentes no se separan por completo en un
cromatograma con una fase móvil, por lo cual es necesario realizar un cromatograma bidimensional
que permita una mejor resolución de él. La cromatografía bidimensional se realiza sobre el mismo
cromatograma cambiando la fase móvil cuando la primera fase ha sido secada completamente,
girándolo a 90°. Las fases móviles deben de seguir un orden de polaridad, es decir, deben respetar
la serie eluotrópica que es la ordenación de los disolventes con base a su capacidad para desplazar
solutos de un adsorbente.

 Resultados.

Tabla 1. Cromatogramas unidimensionales tipo desarrollados en las 2 fases móviles.

Primera fase móvil (Cloroformo- Segunda fase móvil (Butanol-ácido

Aminoácido. metanol-amoniaco) acético-agua)
Frente del Frente del Frente del Frente del
Rf Rf
soluto. disolvente. soluto. disolvente.
Phe 8.0 9.3 0.86 4.8 7.9 0.60
Tyr 7.9 10 0.79 4.4 7.9 0.55
Met 7.0 9.1 0.77 4.1 7.9 0.51
His 6.1 6.0 0.71 0.8 7.9 0.10
Glu 5.3 4.0 0.63 2.5 7.9 0.31
Gly 5.0 8.0 0.57 2.1 7.9 0.26
Pro 4.7 8.9 0.53 2.0 7.9 0.25
Thr 5.0 9.6 0.52 2.4 7.9 0.30
Lys 2.2 8.4 0.26 0.7 7.9 0.08
Arg 1.7 8.3 0.20 0.9 7.9 0.11

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Cálculo de Rf:
𝐹𝑟𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜
𝑅𝑓 =
𝐹𝑟𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒𝑙 𝑑𝑖𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒
8.0
𝑅𝑓 𝑃ℎ𝑒 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑃𝑟𝑖𝑚𝑒𝑟𝑎 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑚ó𝑣𝑖𝑙 = = 0.86
9.3

Figura 1. Cromatograma unidimensional desarrollado en la primera fase móvil revelado con solución de
ninhidrina. Las manchas corresponden a los siguientes aminoácidos Thr, Phe, Met, Pro, Gly, His, Glu, Lys,
Arg y la muestra de jugo de jitomate, respectivamente.

Tabla 2. Cromatograma bidimensional tipo desarrollado en las 2 fases móviles.

Primera fase móvil

Segunda fase móvil (Butanol-
No. De (Cloroformo-metanol-
ácido acético-agua) Aminoácido
mancha. amoniaco)
correspondiente.
Frente del Frente del Frente del Frente del
Rf Rf
soluto. disolvente. soluto. disolvente.
10 6.6 7.6 0.86 4.7 7.8 0.60 Phe
9 6.0 7.6 0.78 3.8 7.8 0.48 Met
5 5.5 7.6 0.72 1.2 7.8 0.15 His
6 5.5 7.6 0.72 2.0 7.8 0.25 Pro
7 5.5 7.6 0.72 2.4 7.8 0.30 Thr
8 5.5 7.6 0.72 4.2 7.8 0.53 Tyr
4 4.8 7.6 0.63 2.5 7.8 0.32 Glu
3 4.7 7.6 0.61 1.6 7.8 0.20 Arg
2 4.5 7.6 0.59 2.1 7.8 0.26 Gly
1 2.5 7.6 0.32 0.8 7.8 0.10 Lys

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 Figura 2. Cromatograma unidimensional desarrollado en la segunda fase móvil revelado con solución de
ninhidrina. Las manchas corresponden a los siguientes aminoácidos Tyr, Thr, Phe, Met, Pro, Gly, His, Glu,
Lys, Arg y la muestra de jugo de jitomate, respectivamente.

Tabla 3. Cromatograma unidimensional de jugo de jitomate desarrollado en las 2 fases

móviles.

Primera fase móvil (Cloroformo- Segunda fase móvil (Butanol-ácido

No. De metanol-amoniaco) acético-agua)
mancha. Frente del Frente del Frente del Frente del
Rf Rf
soluto. disolvente. soluto. disolvente.
4 7.1 8.1 0.87 2.1 7.9 0.26
3 6.3 8.1 0.77 1.6 7.9 0.20
2 5.5 8.1 0.67 1.1 7.9 0.13
1 4.0 8.1 0.49 0.6 7.9 0.07
5 3.0 7.9 0.37
6 4.3 7.9 0.54
7 4.7 7.9 0.59

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Figura 3. Cromatograma bidimensional patrón de aminoácidos desarrollado en las dos fases móviles revelado
con solución de ninhidrina.

Tabla 4. Cromatograma bidimensional de jugo de jitomate desarrollado en las 2 fases

móviles.

Rf en la primera fase móvil Rf en la segunda fase móvil

No. De Aminoácido
(Cloroformo-metanol- (Butanol-ácido acético-
mancha. correspondiente.
amoniaco) agua)
10 0.92 0.64 Phe
12 0.92 0.94 No identificado.
9 0.89 0.52 Tyr
11 0.89 0.94 No identificado.
2 0.82 0.26 Pro
7 0.76 0.42 Met
6 0.74 0.34 His
3 0.69 0.29 Thr
8 0.57 0.45 Arg
4 0.56 0.28 Gly
5 0.52 0.32 Glu
1 0.34 0.10 Lys

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Figura 4. Cromatograma bidimensional de jugo de jitomate desarrollado en las dos fases móviles revelado con
solución de ninhidrina.

Tabla 5. Contenido de aminoácidos de jugo de tomate fresco y procesado (“Amino acid

content of fresh and processed tomato juice”)

Tomada de “Tomato Production, Processing and Technology”, WA Gould.

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 Preguntas extras.

1. Escribir la reacción completa y con nombres, de la ninhidrina con un aminoácido.

2. ¿Es posible cambiar el orden de las fases móviles? Explique su respuesta.

No, ya que las fases móviles deben de seguir un orden de polaridad, es decir, deben respetar la serie
eluotrópica que es la ordenación de los disolventes con base a su capacidad para desplazar solutos
de un adsorbente. En el caso de la práctica llevada a cabo, la serie va de lo menos polar a lo más
polar.

3. Indique las posibles fuentes de error de esta técnica.

 Colocar una cantidad excesiva de fase móvil debido a que puede provocar la disolución de
la muestra.
 Elegir la fase móvil inadecuada que no permita la apropiada separación de los componentes
del analito.
 Un exceso de analito aplicado en la cromatoplaca debido a que puede interferir en la
resolución ocasionando una mancha demasiado amplia.
 Al momento de ingresar la cromatoplaca en la cámara de cromatografía se debe evitar mover
esta, ya que provoca un sesgo en el corrimiento.

 Discusión.
La cromatografía en capa fina es una técnica analítica rápida y sencilla que permite identificar y
comparar muestras desconocidas con patrones determinados. Al iniciar la práctica se conocía que
los aminoácidos presentes en la muestra de jugo de jitomate iban a ser separados y que estos
presentarían diferentes valores de Rf entre sí, lo cual se pudo constatar al finalizar la práctica.

Los aminoácidos son moléculas orgánicas constitutivas que al enlazarse mediante un enlace
peptídico pueden formar largos polímeros que se denominan proteínas. En un pH neutro, los
aminoácidos existen como iones bipolares (zwiterion, del alemán ion hibrido). (Figura 5).

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 Figura 5. Fórmula tradicional de Fischer ilustrando la estructura general de un aminoácido. Tomada de
Bioquímica Interactiva UNAM.

Existen dos clasificaciones de aminoácidos según su procedencia y características: aminoácidos

esenciales y aminoácidos no esenciales, en el caso de la práctica realizada se trabajó con
aminoácidos esenciales, estos son obtenidos en la ingesta de alimentos a diferencia de los
aminoácidos no esenciales que puede sintetizar nuestro cuerpo a partir de otras fuentes
(intermediarios del Ciclo de Krebs como α-cetoglutarato y el oxalacetato, principalmente)

Los variación de resultados en el cálculo de Rf, presentados en las tablas 1 y 2, muestran las
diferentes posiciones de los aminoácidos sobre la placa, resultado de la variación en la estructura
molecular de cada uno de ellos, así como la afinidad de estos por la fase móvil y la competencia por
los sitios de adsorción de la silica gel entre los aminoácidos y cada una de las fases móviles.

Por ejemplo, en el cromatograma unidimensional desarrollado en la primera fase móvil (Cloroformo-

metanol-amoniaco) se muestra que la Arg y la Lys tienen un menor Rf debido a que estos
aminoácidos son de carácter polar pues exhiben grupos cargados positivamente en su composición
(Figura 6), la fase estacionaria silica gel cuyas cadenas de SiO2 forman grupos denominados silanol,
SiOH, le confieren una alta polaridad, resultado de esto es la adsorción de estos aminoácidos con
ella y no la elución con la fase móvil que tiene un carácter medianamente polar.

Mientras que Phe tiene un mayor Rf consecuencia de su apolaridad debido a su contenido de una
cadena alifática que no genera zonas electronegativas o electropositivas, favoreciendo su elución
con la fase móvil y su no adsorción con la fase estacionaria.

Figura 6. Estructura molecular de Arg, Lys y Phe.

“Para un sistema de solventes y un tipo de papel determinado, cada sustancia tiene un valor de R f
característico” (Voet, 2006) tal como está reflejado en la Tabla 1, debido a que al cambiar la fase
móvil (Butanol-ácido acético-agua) esta participa en la competencia, pues es polar, por los sitios de
adsorción de la silica gel con los aminoácidos polares, es por esto que el R f de toda esta fase es
menor en comparación con la primera fase móvil debido a que la velocidad de migración se ve
influenciada por esta competencia.

El cálculo de Rf de cada uno de los Cromatogramas unidimensionales desarrollados en cada una de

las fases móviles respectivamente, nos permitió comparar e identificar los aminoácidos aplicados en
el cromatograma bidimensional tipo, identificando asi cada una de las manchas presentes
asignándoles un aminoácido, para esto se aceptó una variación de aproximadamente ±0.5. En el

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caso de Arg (Tabla 2) a pesar de no coincidir sus valores de Rf con base a la premisa anterior, se le
asignó esta mancha debido a que era el último aminoácido disponible pues los anteriores
aminoácidos habían sido identificados.

Al analizar los cromatogramas unidimensionales desarrollados en cada una de las fases móviles, se
observa que la muestra problema contiene varios aminoácidos, comparando los Rf del jugo de
jitomate del cromatograma unidimensional con los de aminoácidos tipo, podemos identificar algunos
aminoácidos sin embargo no todos debido a que algunos R f tienen valores muy cercanos entre si lo
que es muy confuso dar una afirmación.

El cromatograma bidimensional de aminoácidos tipo, muestra una mejor resolución, permitiendo

identificar a cada uno de los aminoácidos del cromatograma bidimensional en el cual fue aplicada
nuestra muestra de jugo de jitomate, con la comparación de dos fases móviles y no solamente una
como en el caso del cromatograma unidimensional, dando como resultado una excelente separación
de aminoácidos debido a que fueron identificados al menos todos los aminoácidos presentes en el
cromatograma bidimensional patrón, también se obtuvieron manchas no identificadas en
consecuencia de que el jitomate contiene más aminoácidos de los utilizados en esta práctica (Tabla
5).

 Conclusiones.
La cromatografía en capa fina es un criterio parcial de identificación debido a que depende de las
polaridades de las muestras y las fases móviles elegidas. La mínima variación de polaridad entre
éstas puede verse reflejada en la distancia recorrida de las muestras. Por lo tanto puede llegar un a
ser un método un tanto subjetivo al momento de comparar resultados.

El uso de la cromatografía bidimensional en capa fina del jugo de jitomate permitió identificar los
aminoácidos presentes en él, en base a su Rf con aminoácidos patrón desarrollados en la misma
fase móvil.

Durante el desarrollo de la práctica es importante trabajar en las condiciones adecuadas que

permitan obtener una resolución optima al momento de revelar las placas por lo que cuidar el proceso
de aplicación con la cantidad suficiente de muestra en la placa es esencial, así como elegir las fases
móviles adecuadas y la concentración idónea de ellas para obtener los resultados planeados.

 Bibliografía.

 “Aminoácidos” consultado el día 4 de Octubre de 2015 de

http://www.fagro.edu.uy/~bioquimica/docencia/material%20nivelacion/2%20Aminoacidos%
202010.pdf

 “Bioquímica interactiva” consultado el día 3 de Octubre de 2015 de

http://laguna.fmedic.unam.mx/~3dmolvis/aminoacido/

 “Síntesis de aminoácidos” consultado el día 6 de Octubre de 2015 de

https://es.wikipedia.org/wiki/S%C3%ADntesis_de_amino%C3%A1cidos

 “Técnicas cromatográficas” consultado el día 6 de Octubre de 2015 de

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/M.Cromatogrficos_6700.pdf

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 1Voet, “Bioquímica”, Editorial medica panamericana, Argentina, 2004, Tercera edición, pp
151.

 WA Gould, “Tomato Production, Processing and Technology”, Elsevier, Baltimore USA,

2013, Tercera edicion.

 Walton, Harold, Reyes, Jorge, “Análisis químico instrumental moderno”, Editorial Reverté,
Argentina, 2005, pp. 334-335.

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