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“UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO – PUNO”

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

ESCUELA PROFESIONAL DE
INGENIERIA AGRONOMICA

CURSO: MICROBIOLOGIA

DOCENTE: ING. JUAN ZAPANA

PRESENTADO POR:
DENNIS QUISPE PERALTA
CODIGO: 143916 CICLO: III

AÑO: 2015
Este presente presente esta dado al curso de
MICROBIOLOGÍA; local está siendo presentado al
Ing. JUAN ZAPANA; lo cual trata de la historia
general del MICROSCOPIO.
El término “microscopio” es la conjunción de dos
conceptos, por un lado “micro” que es equivalente a
“pequeño” y “scopio” que significa “observar”, en suma
se refiere a la observación pequeña, o en menor grado.
El microscopio es un instrumento que permite
observar objetos que son demasiado pequeños
como para ser vistos por la vista del ser humano.
Este instrumento óptico aumenta la capacidad de
observación a niveles de acercamiento tal que hasta
hace posible el análisis de partículas. La imagen que se
obtiene es realmente una investigación sobre la
composición de los objetos diminutos. Al estudio y
análisis de los objetos pequeños se lo denomina
“microscopia”.
El microscopio se inventó, hacia 1610, por Galileo, según los italianos, o
por Jansen, en opinión de los holandeses. La palabra microscopio fue
utilizada por primera vez por los componentes de la "Academia dei
Lincei" una sociedad científica a la que pertenecía Galileo y que
publicaron un trabajo sobre la observación microscópica del aspecto de
una abeja.

Sin embargo las primeras publicaciones importantes en el campo de la


microscopia aparecen en 1660 y 1665 cuando Malpighi prueba la teoría
de Harvey sobre la circulación sanguínea al observar al microscopio los
capilares sanguíneos y Hooke publica su obra Micrographia.

A mediados del siglo XVII un comerciante holandés, Leenwenhoek,


utilizando microscopios simples de fabricación propia describió por
primera vez protozoos, bacterias, espermatozoides y glóbulos rojos.
Durante el siglo XVIII el microscopio sufrió diversos adelantos mecánicos
que aumentaron su estabilidad y su facilidad de uso aunque no se
desarrollaron mejoras ópticas. Las mejoras más importantes de la óptica
surgieron en 1877 cuando Abbe publica su teoría del microscopio y por
encargo de Carl Zeiss mejora la microscopía de inmersión sustituyendo
el agua por aceite de cedro lo que permite obtener aumentos de 2000A
principios de los años 30 se había alcanzado el limite teórico para los
microscopios ópticos no consiguiendo estos, aumentos superiores a
500X o 1000X sin embargo existía un deseo científico de observar los
detalles de estructuras celulares ( núcleo, mitocondria... etc.).

El microscopio electrónico de transmisión (T.E.M.) fue el primer tipo de


microscopio electrónico desarrollado este utiliza un haz de electrones
en lugar de luz para enfocar la muestra consiguiendo aumentos de
100.000 X. Fue desarrollada por Max Knoll y Ernst Ruska en Alemania en
1931. Posteriormente, en 1942 se desarrolla el microscopio electrónico
de barrido (SEM).

CRONOLOGÍA DEL DESARROLLO DEL


MICROSCOPIO
1. 1590: con posterioridad, algunos autores (Pierre Borel
1620 - 1671 o 1628 - 1689 y Willem Boreel 1591 - 1668)
reivindican que en esta fecha los fabricantes holandeses
de anteojos, Hans Janssen y su hijo Zacharias Janssen
inventaron un microscopio compuesto, pero este hecho
no se ha podido verificar.

2. 1609: Galileo Galilei desarrolla un occhiolino o


microscopio compuesto de una lente convexa y una
cóncava.

3. 1612: Galileo presenta el occhiolino al rey de Polonia


Segismundo III.

4. 1619: Cornelius Drebbel (1572 - 1633) presenta en


Londres, un microscopio compuesto de dos lentes
convexas.
5. c.1622: Drebbel presenta su invento en Roma.

6. 1624: Galileo presenta su occhiolino al Príncipe Federico


Cesi, fundador de la Academia de los Linces).

7. 1625: Giovanni Faber de Bamberg (1574 - 1629),


miembro de la Academia de los Linces, acuña la palabra
microscopio por analogía con telescopio.

8. 1665: Robert Hooke publica Micrographia, una colección


de micrografías biológicas. Acuña la palabra célula para
las estructuras que descubre en una corteza de corcho.

9. 1674: Anton van Leeuwenhoek inventa el microscopio


simple.

10. 1931: Ernst Ruska y Max Knoll construyen el primer


microscopio electrónico.

11. 1965: se desarrolla el primer microscopio


electrónico de barrido.

12. 1981: Gerd Binnig y Heinrich Rohrer desarrollan el


microscopio de efecto túnel.

13. 1985 Binnig y Rohrer desarrollan el microscopio


de fuerza atómica.

HISTORIA DEL MICROSCOPIO


El microscopio fue inventado hacia los años 1610, por Galileo Galilei,
según los italianos, o por Zacharias Janssen, en opinión de los
holandeses. En
1628 aparece en la obra de William Harvey sobre la circulación
sanguínea al observar al microscopio los capilares sanguíneos y
Robert Hooke publica su obra Micrographia.
En 1665 Hooke observó con un microscopio un delgado corte de
corcho y notó que el material era poroso, en su conjunto, formaban
cavidades poco profundas a modo de celditas a las que llamó células.
Se trataba de la primera observación de células muertas. Unos años
más tarde, Malpighi, anatomista y biólogo italiano, observó células
vivas. Fue el primero en estudiar tejidos vivos al microscopio.
A mediados del siglo XVII un holandés, Anthony van Leeuwenhoek,
utilizando microscopios simples de fabricación propia, describió por
primera vez protozoos, bacterias, espermatozoides y glóbulos rojos.
El microscopista Leeuwenhoek, sin ninguna preparación científica,
puede considerarse el fundador de la bacteriología. Tallaba él mismo
sus lupas sobre pequeñas esferas de cristal, cuyos diámetros no
alcanzaban el milímetro (su campo de visión era muy limitado, de
décimas de milímetro). Con estas pequeñas distancias focales
alcanzaba los 275 aumentos. Observó los glóbulos de la sangre, las
bacterias y los protozoos; examinó por primera vez los glóbulos rojos
y descubrió que el semen contiene espermatozoides. Durante su vida
no reveló sus métodos secretos y a su muerte, en 1723, 26 de sus
aparatos fueron cedidos a la Royal Society de Londres.
Durante el siglo XVIII continuó el
progreso y se
lograron objetivos acromáticos por
asociación de vidrios flint y crown
obtenidos en 1740 por H. M. Hall y
mejorados por John Dollond. De
esta época son los estudios
efectuados por Isaac Newton y
Leonhard Euler. En el siglo XIX, al
descubrirse que la dispersión y la
refracción se podían modificar con
combinaciones adecuadas de dos
o más medios ópticos, se lanzan
al mercado objetivos acromáticos
excelentes.
Durante el siglo XVIII el microscopio tuvo diversos adelantos
mecánicos que aumentaron su estabilidad y su facilidad de uso,
aunque no se desarrollaron por el momento mejoras ópticas. Las
mejoras más importantes de la óptica surgieron en 1877, cuando
Ernst Abbe publicó su teoría del microscopio y, por encargo de Carl
Zeiss, mejoró la microscopía de inmersión sustituyendo el
agua por aceite de cedro, lo que permite obtener aumentos de 2000.
A principios de los años 1930 se había alcanzado el límite teórico
para los microscopios ópticos, no consiguiendo éstos aumentos
superiores a 500X
o 1000X. Sin embargo, existía un deseo científico de observar los
detalles de estructuras celulares (núcleo, mitocondria, etc.).
El microscopio electrónico de transmisión (TEM) fue el primer tipo de
microscopio electrónico desarrollado. Utiliza un haz de electrones en
lugar de luz para enfocar la muestra consiguiendo aumentos de
100.000X. Fue desarrollada por Max Knoll y Ernst Ruska
en Alemania en 1931. Posteriormente, en 1942 se desarrolla el
microscopio electrónico de barrido (SEM).
• Concepto de Microscopio: es un instrumento que permite observar
objetos que son demasiado pequeños para ser vistos a simple vista.
• Tipos de Microscopio
a. Simple: es aquel que solo utiliza un lente de aumento. Es el
microscopio más básico. El ejemplo más clásico es la lupa. El
microscopio óptico estándar utiliza dos sistemas de lentes alineados.
El objeto por observar se coloca entre el foco y la superficie de la
lente, lo que determina la formación de una imagen virtual, derecha
y mayor cuanto mayor sea el poder dióptrico del lente y cuanto más
alejado esté el punto próximo de la visión nítida del sujeto.
El holandés Antony van Leeuwenhoek construyó microscopios muy
eficaces basados en una sola lente. Esos microscopios no padecían
las aberraciones que limitaban tanto la eficacia de los primeros
microscopios compuestos, como los empleados por Robert Hooke, y
producían una ampliación de hasta 300 veces; gracias a ellos
Leeuwenhoek fue capaz incluso de describir por primera vez las
bacterias.

b. Óptico: es un microscopio basado en lentes ópticos. También se


le conoce como microscopio de luz, (que utiliza luz o "fotones") o
microscopio de campo claro. El desarrollo de este aparato suele
asociarse con los trabajos de Anton van Leeuwenhoek. Los
microscopios de Leeuwenhoek constaban de una única lente
pequeña y convexa, montada sobre una plancha, con un mecanismo
para sujetar el material que se iba a examinar (la muestra o
espécimen). Este uso de una única lente convexa se conoce como
microscopio simple, en el que se incluye la lupa, entre otros aparatos
ópticos.
A. Ocular: lente situada cerca del ojo del
observador. Capta y amplia la imagen
formada en los objetivos.
B. Objetivo: lente situada cerca de la
preparación. Amplía la imagen de ésta, lo
que significa que es muy importante este
elemento del microscopio, es un elemento
vital que permite ver a través de los
oculares
C. Portador de Objetos: es donde se
colocan las muestras.
D. Lentes de iluminación: es por donde
ingresa la luz que permite ver las
muestras.
E. Sujeción de objetos: es la que sujeta los
objetos donde están las muestras, esto
para que estén firmes y no se muevan.
F. Espejo de Iluminación: es aquel que refleja la luz que permite ver las
muestras

TIPOS DE MICROSCOPIO

1.Microscopio simple

Microscopio simple de Leeuwenhoek. La


muestra se colocaba en la punta del tornillo,
en frente de la única lente, de la que destaca
la pequeñez de su diámetro.
Un microscopio simple es aquel que
utiliza una sola lente para ampliar las
imágenes de los objetos observados. Es
el microscopio más básico. El ejemplo
más clásico es la lupa.1
El microscopio óptico estándar utiliza
dos sistemas de lentes alineados.
Historia
 1267 - Roger Bacon explica los principios de la lente y
propone la idea de telescopio y microscopio.2
 1590 - Los montadores de espectáculos neerlandeses
Hans Jansen y su hijo Zacharias Jansen son
reivindicados por haber inventado un microscopio
compuesto por escritores posteriores (Pierre Borel 1620-
1671 o 1628–1689 y Willem Boreel 1591–1668)
 1609 - Galileo Galilei desarrolla
un occhiolino o microscopio compuesto con una lente
convexa y una cóncava.
 1612 - Galileo presenta el occhiolino al rey
de Polonia Segismundo III.
 1619 - Cornelius Drebbel (1572–1633) presenta en
Londres un microscopio compuesto con dos lentes
convexas..
 ca.1622 - Drebbel presenta su invento en Roma.
 1624 - Galileo presenta su occhiolino al príncipe Federico
Cesi, fundador de la Academia de los Linces (Accademia
dei Lincei).
 1625 - Giovanni Faber de Bamberg (1574-1629) de los
Linceanos acuña la palabra microscopio por analogía
con telescopio.
 1665 - Robert Hooke publica Micrographia, una colección
de micrografías biológicas y acuña la palabra célula (cell)
para las estructuras que descubre en una corteza
de corcho.
 1674 - Anton van Leeuwenhoek mejora un microscopio e
inventa el microscopio simple para ver especímenes
biológicos.
 1863 - Henry Clifton Sorby desarrolla un microscopio
metalúrgico para observar la estructura de meteoritos.
 década de 1860 - Ernst Abbe descubre la relación de
senos de Abbe, un gran avance en el diseño del
microscopio, que hasta entonces se basaba en gran
medida en el ensayo y error. La compañía de Carl Zeis-
s explotó este descubrimiento y se convirtió en el
fabricante de microscopios dominante de su época.
Hace más de quinientos años, se desarrollaron las lupas de
cristal simples. Estas eran lentes convexas (más gruesas en
el centro que en la periferia). La muestra u objeto podrían
entonces ser enfocados por el uso de la lupa colocada entre
el objeto y el ojo. Estos "microscopios simples" podrían
difundir la imagen en la retina por ampliación mediante el
aumento del ángulo visual en la retina.

Diagrama óptico de un microscopio simple.


Se observa que la imagen virtual creada
por la lente, es mayor que el objeto de
estudio
El objeto a observar se coloca entre el foco
y la superficie de la lente, lo que determina
la formación de una imagen virtual,
derecha y mayor cuanto mayor sea el
poder dióptrico de la lente y cuanto más
alejado esté el punto próximo de la visión
nítida del sujeto.
El aumento obtenido con estos
microscopios es reducido, debido a que la
longitud de onda de la luz visible le impone limitaciones.
Se le atribuye a el holandés Anton van Leeuwenhoek (1632-
1723) haber introducido el microscopio a la atención de los
biólogos, a pesar de que ya se estaban produciendo lupas
simples en el siglo XVI. Leeuwenhoek construyó
microscopios muy eficaces basados en una sola
lente. 3 4 Sus observaciones fueron lo suficientemente
famosas como para recibir a numerosos visitantes de la
altura de la reina María II de Inglaterra (1662-1694), Pedro
el Grande () o Federico I de Prusia (), además de filósofos y
sabios, médicos y eclesiásticos. Van Leeuwenhoek realiza
ante ellos numerosas demostraciones: le mostró a Pedro el
Grande la circulación sanguínea en la cola de una anguila.
El microscopio que se observa en la foto fue construido hacia
1668 y mide 10 cm de longitud; esos microscopios simples
de una sola lente producían una ampliación de hasta 275
veces (275x) y tenían un poder de resolución de 1,4 μm.;5 no
padecían las aberraciones que limitaban la eficacia de los
primeros microscopios compuestos, como los empleados
por Robert Hooke. Con ellos Leeuwenhoek fue capaz incluso
de describir por primera vez protistas microscópicos de vida
libre y parasítica, células espermáticas, células sanguíneas,
nematodos microscópicos, rotíferos y hasta bacterias.6
Tomó cerca de 150 años de desarrollo, antes de que la
óptica del microscopio compuesto fuera capaz de
proporcionar la misma calidad de imagen de los
microscopios simples de Van Leeuwenhoek, debido a
dificultades en las múltiples lentes que utiliza.

2. Microscopio de luz ultravioleta

Microscopio de luz fluorescencia - Las lentes del objetivo,


que habitualmente se componen de vidrio se sustituyen por
lentes de cuarzo, y la iluminación se produce por lámparas
de mercurio. No usa filtros y se observa en placas
fotográficas. La variedad de fluorescencia, si usa filtros, y la
observación es directa.

Microscopio de luz ultravioleta – La imagen en el


microscopio de luz ultravioleta depende de la absorción de
esa luz por las moléculas de la muestra. La fuente de luz
ultravioleta tiene una longitud de onda de 200 nm, por lo
tanto puede alcanzar una resolución de 100 nm. La
microscopia ultravioleta no es muy diferente del
funcionamiento de un espectrofotómetro pero sus
resultados son registrados en fotografías. La muestra no se
puede observar directamente a través del ocular porque la
luz ultravioleta puede dañar la retina. El método sirve para
detectar ácidos nucleicos, proteínas que contienen
determinados aminoácidos. Mediante longitudes de ondas
específicas para la iluminación se puede obtener mediciones
espectrofotométricas para cuantificar el ADN y el ARN de
cada célula.
El microscopio de luz ultravioleta utiliza el rango ultravioleta
del espectro luminoso en lugar del rango visible, bien para
aumentar la resolución con una longitud de onda menor o
para mejorar el detalle absorbiendo selectivamente distintas
longitudes de onda de la banda ultravioleta. Dado que el
vidrio no transmite las longitudes de onda más cortas de la
luz ultravioleta, los elementos ópticos de estos microscopios
están hechos con cuarzo, fluorita o sistemas de espejos
aluminizados. Además, dado que la radiación ultravioleta es
invisible, la imagen se muestra con fosforescencia
(véase Luminiscencia), en fotografía o con un escáner
electrónico. El microscopio de luz ultravioleta se utiliza en la
investigación científica.

3. Microscopio de fluorescencia

El microscopio de fluorescencia es una variación


del microscopio de luz ultravioleta en el que los objetos son
iluminados por rayos de una determinada longitud de onda.
La imagen observada es el resultado de la radiación
electromagnética emitida por las moléculas que han
absorbido la excitación primaria y reemitido una luz con
mayor longitud de onda. Para dejar pasar sólo la emisión
secundaria deseada, se deben colocar filtros apropiados
debajo del condensador y encima del objetivo. Se usa para
detectar sustancias con auto fluorescencia (vitamina A) o
sustancias marcadas con fluorocromos.
Fluorescencia y microscopio

Estructura de un microscopio
de fluorescencia.
El fenómeno de
la fluorescencia se produce
cuando un electrón de
un átomo absorbe toda la
energía de una
determinada longitud de
onda de la luz, saltando a
otros orbitales. Es una
situación inestable durante la cual se emite la mayor parte
de la energía que se ha absorbido (con mayor longitud de
onda) y vuelve a desplazarse a su orbital.
Aprovechando este fenómeno, se han creado
los fluorocromos (también conocido como fluoroforos). Para
utilizarlos necesitamos una bombilla que emita luz
ultravioleta y luz visible. Para excitar el fluorocromo
necesitamos un filtro de excitación que seleccione la longitud
de onda que excita nuestro flurocromo. Los más comunes
son el DAPI que tiñe
4. Microscopio de luz polarizada
Microscopio petrográfico usado para
el estudio de secciones delgadas de
roca en petrografía.

Microfotografía de un gabro con


nicoles cruzados.

Cristales de vitamina B6 bajo el microscopio de polarización.

El microscopio petrográfico, microscopio


polarizador o de luz polarizada es un microscopio
óptico al que se le han añadido dos polarizadores (uno entre
el condensador y la muestra y el otro entre la muestra y el
observador). El material que se usa para los polarizadores
son prismas de Nicol o prismas de Glan-Thompson (ambos
de calcita), que dejan pasar únicamente la luz que vibra en
un único plano (luz polarizada). Esta luz produce en el
campo del microscopio claridad u oscuridad, según que los
dos nícoles estén paralelos o cruzados.
Algunos compuestos inorgánicos responden al efecto de
la luz, éstos tienen un alto grado de orientación molecular
(sustancias anisótropas), que hace que la luz que los
atraviesa pueda hacerlo en determinados planos vibratorios
atómicos.

El prisma de Nicol permite el paso de luz en un solo plano,


así la calcita gira la posición de polarización, facilitando
la identificación desustancias que extinguen la luz. Al
fenómeno de extinción de luz causado por estos planos
atómicos y orientaciones moleculares se llama
birrefringencia.

Este tipo de microscopio se usa para poder identificar


sustancias cristalinas (minerales) o fibrosas (como el cito
esqueleto), sustancia amiloide, asbesto, colágeno, cristales
de uratos, queratina, sílice, polen, etc.

Algunos tejidos vivos pueden ser observados bajo


microscopía óptica de luz polarizada debido a la
birrefringencia provocada por la orientación de
sus fibroinas,1 tales como la actina o miosina. Algunos
animales tales como los Anisakis pueden observarse
mediante esta técnica.

Tronco
de Anisakis visto al
microscopio óptico con
polarizadores
cruzados. 100x
aumentos.
Labirrefrigencia se da
por la orientación de
las fibroinas proteicas
componentes de los
tejidos blandos de estos animales.
El primer microscopio de polarización completa fue
construido en 1830 por Amici.2
5. Microscopio de campo oscuro
La microscopía de campo oscuro
produce imágenes con un fondo
oscuro.

Diagrama que ilustra la trayectoria de la luz a través de un


microscopio de campo oscuro.

El microscopio de campo oscuro (en inglés: Dark field


microscope or dark ground microscope)? Es
un microscopio que utiliza un haz enfocado de luz muy
intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el
espécimen. El objeto iluminado dispersa la luz y se hace así
visible contra el fondo oscuro que tiene detrás, como las
partículas de polvo iluminadas por un rayo de sol que se
cuela en una habitación cerrada. Por ello las porciones
transparentes del espécimen quedan oscuras, mientras que
las superficies y partículas se ven brillantes, por la luz que
reciben y dispersan en todas las direcciones, incluida la del
eje óptico que conecta el espécimen con la pupila del
observador. Esta forma de iluminación se utiliza para
analizar elementos biológicos transparentes y sin pigmentar,
invisibles con iluminación normal, sin fijar la muestra, es
decir, sin matarla. También es bastante utilizado en la
observación de metalográficas para la observación de
detalles en superficies con alta reflectancia.
El objetivo recibe la luz dispersa o refractada por las
estructuras del espécimen. Para lograrlo, el microscopio de
campo oscuro está equipado con un condensador especial
que ilumina la muestra con luz fuerte indirecta. En
consecuencia el campo visual se observa detrás de la
muestra como un fondo oscuro sobre el cual aparecen
pequeñas partículas brillantes de la muestra que reflejan
parte de la luz hacia el objetivo.
El efecto es similar a las partículas de polvo que se ven en
el haz de luz emanado de un proyector de diapositivas en
una habitación oscura. La luz reflejada por las partículas de
polvo llega hasta la retina del ojo, lo que las hace visibles.
La luz dispersa permite incluso distinguir partículas más
pequeñas que el poder separador del sistema óptico usado
por transparencia.
Los condensadores que se emplean en microscopía de
campo oscuro son de dos tipos: del tipo paraboloide (tiene
una superficie espejada), y los del tipo cardioide, con dos
superficies espejadas. El empleo de uno u otro es indistinto,
mediante cualquiera de ambos, la luz no incide directamente
en el objetivo (este es el objetivo de estos condensadores),
sino que incide con una apertura numérica mayor al del
objetivo.

6. Microscopio de contraste de fases

El microscopio de contraste de fases permite


observar células sin colorear y resulta especialmente útil
para células vivas.1 Este aprovecha las pequeñas
diferencias de los índices en las distintas partes de una
célula y en distintas partes de una muestra de tejido.
La luz que pasa por regiones de mayor índice de refracción
experimenta una deflexión y queda fuera de fase con
respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la
muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por
medio de una serie de anillos ópticos del objetivo y del
condensador, anula la amplitud de la porción fuera de fase
inicial del haz de luz y produce un contraste útil sobre la
imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las
porciones densas del espécimen; las partes claras de la
imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo
tanto estos microscopios se utilizan para observar células
vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados.2
Dos modificaciones del microscopio de fase son
el microscopio de interferencia y el microscopio de
interferencia diferencial.[cita requerida]
Su inventor fue en 1932 el físico neerlandés Frits Zernike, lo
que junto al método de contraste de fases le valió para ganar
el Premio Nobel de Física en 1953.3

7. Microscopio con focal

Principios en
los que se
basa la
microscopía
con focal.

El microscopio con focal es un microscopio que emplea


una técnica óptica de imagen para incrementar
el contraste y/o reconstruir imágenes tridimensionales
utilizando un "pinhole" espacial (colimador de orificio
delimitante) para eliminar la luz desenfocada o destellos de
la lente en especímenes que son más gruesos que el plano
focal.1 El pinhole es una apertura localizada delante del
fotomultiplicador que evita el pasaje de fluorescencia de las
regiones de la muestra que no están en foco, la luz que
proviene de regiones localizadas por encima o por debajo
del plano focal no converge en el pinhole y no es detectada
por el fotomultiplicador. Esta técnica ha ido adquiriendo cada
vez mayor popularidad entre las comunidades científica e
industrial. Se aplica típicamente en las ciencias biológicas y
en la inspección de semiconductores.
Concepto básico

El concepto de imagen con focal fue patentado por Marvin


Minsky en 1957.2 En un microscopio de
fluorescencia convencional (p.ej., de campo amplio), el
espécimen entero está sobresaturado de luz a partir de la
fuente de iluminación. Debido a la conservación de la
intensidad de la luz en su recorrido, todas las partes del
espécimen a lo largo de su ruta óptica serán excitadas y la
fluorescencia detectada por un foto detector o una cámara.
Por el contrario, un microscopio con focal utiliza iluminación
puntual y un "pinhole" en un plano óptico conjugado en frente
del detector para eliminar la información que está fuera del
plano focal. Sólo la luz que está dentro de este plano puede
ser detectada, de modo que la calidad de imagen es mucho
mejor que las de campo amplio. Puesto que sólo se ilumina
un punto cada vez en el microscopio con focal, se requiere
una exploración (scanning) sobre un raster regular en el
espécimen para obtener imágenes bi o tridimensionales. La
delgadez del plano focal se define mayormente como el
cuadrado de la apertura numérica de la lente del objetivo y
también por las propiedades ópticas del espécimen y el
índice de refracción del ambiente.
Tipos
Existen tres tipos de microscopios con focales disponibles
comercialmente:
El Microscopio con focal láser de barrido,
el microscopio con focal de disco giratorio (disco de
Nipkow) y microscopios de matriz
programable,(Programmable Array Microscope, PAM).
La microscopía con focal de barrido por láser produce
un mayor rendimiento en la calidad de la imagen que
los de disco o PAM, pero la tasa de frames era muy
lenta (menos de tres frames/segundo) hasta hace poco.
Los microscopios de disco pueden lograr velocidades
compatibles con la creación de videos —un rasgo
desable para observaciones dinámicas, como pueden
ser las imágenes de células vivas. La microscopía con
focal láser de barrido actualmente ha sido mejorada
para obtener tasas superiores a las del video (60
frames/segundo) utilizando MEMS basados en espejos
de barrido.
Imágenes

β-tubulina enTetrahymena,
(unprotozoo ciliado).

Perfil parcial de la superficie de


una moneda de 1 Euro medido
con un microscopio con focal de
disco de Nipkow.

Información del reflejo de una moneda de


1 Euro.

Corte transversal a través de una


moneda de 1 Euro (x - en el plano de
la moneda, z - hacia adentro de la
moneda).

8. Microscopio electrónico

Un microscopio electrónico es aquél que


utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para
formar imágenes de objetos diminutos. Los microscopios
electrónicos permiten alcanzar ampliaciones
antes que los mejores microscopios ópticos,
debido a que la longitud de onda de los
electrones es mucho menor que la de los
fotones "visibles".
El primer microscopio electrónico fue diseñado
por Ernst Ruska y Max
Knoll entre 1925 y 1930, quienes se basaron
en los estudios de Louis-Victor de
Broglie acerca de las propiedades
ondulatorias de los electrones
Limitaciones del microscopio electrónico

 El limitado diámetro de la apertura no permite


que la información detallada alcance la
imagen, limitando de este modo la resolución.
 El contraste de amplitud (que radica en la naturaleza
corpuscular de los electrones) se debe al contraste de
difracción, provocado por la pérdida de electrones del
rayo. Es un contraste dominante en especímenes
gruesos.
 El contraste de fase (que radica en la naturaleza
ondulatoria de los electrones) se debe al contraste de
interferencia provocado por los desplazamientos en las
fases relativas de las porciones del rayo. Es un contraste
dominante en especímenes finos.
 Existen también distintas aberraciones producidas por las
lentes: astigmática, esférica y cromática
 El problema de la función de transferencia de contraste
(CTF): la CTF describe la respuesta de un sistema óptico
a una imagen descompuesta en ondas cuadráticas.
El material biológico presenta dos problemas
fundamentales: el entorno de vacío y la transferencia de
energía. Para resolverlos, se utilizan distintas técnicas
dependiendo del tamaño de la muestra:

 para muestras grandes como órganos, tejidos o células,


se utilizan tres técnicas:

1. la fijación química o la crio fijación;


2. la inclusión en resinas (crio sustitución);
3. la réplica metálica;

 para muestras pequeñas como complejos


macromoleculares se utilizan las siguientes técnicas:

1. la tinción negativa: los agentes de tinción más usados


son el molibdato amónico, el fosfotungstato sódico y
sales de uranio como acetato y formiato. Todos ellos
presentan las siguientes propiedades: interactúan
mínimamente con la muestra y son estables en la
interacción con los electrones, son altamente solubles
en agua, presentan una alta densidad que favorece el
contraste, tienen un punto alto de fusión, tienen un
tamaño de grano pequeño;
2. la réplica metálica: para construir la réplica metálica
se evapora el metal (estaño), que se deposita sobre la
muestra a la vez que esta, por el vacío, se disuelve;
3. la crio microscopía.
Tipos de microscopios electrónicos

(1) carcasa, (2) emisor de


electrones, (3) electrones, (4)
cátodo, (5) ánodo, (6) Lente
condensador, (7) muestra
analizada, (8) Lente objetivo, (9)
Lente proyector, (10) Detector
(sensor o película fotográfica).
Existen dos tipos principales de
microscopios electrónicos: el
microscopio electrónico de
transmisión y el microscopio
electrónico de barrido.
Microscopio electrónico de
transmisión[editar]
Artículo principal: Microscopio
electrónico de transmisión
El microscopio electrónico de
transmisión emite un haz de
electrones dirigido hacia el objeto
cuya imagen se desea aumentar.
Una parte de los electrones rebotan
o son absorbidos por el objeto y
otros lo atraviesan formando una
imagen aumentada de la muestra.
Para utilizar un microscopio
electrónico de transmisión debe cortarse la muestra en
capas finas, no mayores de unos 2000 ángstroms. Los
microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar
la imagen de un objeto hasta un millón de veces.
9.Microscopio electrónico de barrido (MEB)

Imagen de una hormiga tomada con


un MEB (microscopio electrónico de
barrido).
Artículo principal: Microscopio
electrónico de barrido
En el microscopio electrónico de
barrido (MEB) la muestra es
recubierta con una capa de metal
delgado, y es barrida con electrones enviados desde un
cañón. Un detector mide la cantidad de electrones enviados
que arroja la intensidad de la zona de muestra, siendo capaz
de mostrar figuras en tres dimensiones, proyectados en una
imagen de TV. Su resolución está entre 3 y 20 nm,
dependiendo del microscopio. Permite obtener imágenes de
gran resolución en materiales pétreos, metálicos y
orgánicos. La luz se sustituye por un haz de electrones, las
lentes por electroimanes y las muestras se hacen
conductoras metalizando su superficie.
Aplicaciones en distintas áreas
En el estudio de los circuitos integrados se suele utilizar el
microscopio electrónico debido a una curiosa propiedad:
Como el campo eléctrico modifica la trayectoria de los
electrones, en un circuito integrado en funcionamiento, visto
bajo el microscopio electrónico, se puede apreciar el
potencial al que está cada elemento del circuito.

10. Microscopio electrónico de transmisión

El microscopio electrónico de transmisión (TEM, por sus


siglas en inglés, o MET, en español) es un microscopio que
utiliza un haz de electrones para visualizar un objeto, debido
a que la potencia amplificadora de un microscopio óptico
está limitada por la longitud de onda de la luz visible. Lo
característico de este microscopio es el uso de una muestra
ultra fina y que la imagen se obtenga de los electrones que
atraviesan la muestra.
Los microscopios electrónicos de transmisión pueden
aumentar un objeto hasta un millón de veces.
Historia
El primer microscopio electrónico de transmisión fue
desarrollado entre 1931 y 1933 por Ernst Ruska y sus
colaboradores. La óptica básica de ese primer microscopio
electrónico se mantiene hasta nuestros días; los cambios en
los microscopios modernos consisten en adicionar más
lentes para incrementar el ámbito de aumentos y darle
mayor versatilidad. El primer microscopio electrónico de
transmisión comercial lo construyó Siemens en 1939.
Estructura
Debido a que los electrones tienen una longitud de onda
mucho menor que la de la luz visible, pueden mostrar
estructuras mucho más pequeñas.
Las partes principales de un microscopio electrónico de
transmisión son:
 Cañón de electrones, que emite los electrones que
chocan o atraviesan el espécimen (dependiendo que tipo
de microscopio electrónico es), creando una imagen
aumentada.
 Lentes magnéticas para crear campos que dirigen y
enfocan el haz de electrones, ya que las lentes
convencionales utilizadas en los microscopios ópticos no
funcionan con los electrones.
 Sistema de vacío es una parte muy importante del
microscopio electrónico. Debido a que los electrones
pueden ser desviados por las moléculas del aire, se debe
hacer un vacío casi total en el interior de un microscopio
de estas características.
 Placa fotográfica o pantalla fluorescente que se coloca
detrás del objeto a visualizar para registrar la imagen
aumentada.
 Sistema de registro que muestra la imagen que
producen los electrones, que suele ser un ordenador.
El microscopio electrónico de transmisión emite un haz de
electrones dirigido hacia el objeto que se desea aumentar.
Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el
objeto y otros lo atraviesan formando una imagen
aumentada de la muestra.
Cañón de electrones

Esquema de un
microscopio electrónico de
transmisión.
De arriba a abajo, el TEM
consiste en una fuente de
emisión, que puede ser

un filamento de tungsteno o bien una fuente de hexaboruro


de lantano (LaB6). Para el caso del tungsteno el filamento
puede ser o bien en la forma de una horquilla de pelo o bien
pequeño y en forma de púa. Las fuentes de LaB6 utilizan un
pequeño mono cristal. Conectando dicho cañón a una fuente
de alto voltaje (~120kV para muchas aplicaciones)
comenzará a emitir electrones hacia el vacío. Esta
extracción de electrones suele reforzarse con la ayuda de
un cilindro Wehnelt. Una vez extraídos, las lentes de la parte
superior del TEM manipulan los haces de electrones
permitiendo su focalización al tamaño deseado y su
localización sobre la muestra.
La manipulación de los electrones se consigue mediante la
combinación de dos efectos físicos. La interacción de los
electrones con un campo magnético hace que estos se
muevan de acuerdo a la fórmula vectorial F= (q.v) x B
(siendo v y B, el vector velocidad del electro, B el vector
campo magnético y "x" el producto vectorial). Este efecto
permite que los electrones emitidos puedan ser manipulados
por medio de electroimanes. Esta técnica permite la
formación de una lente magnética de distancia
focal variable, dependiendo de la distribución del flujo
magnético. Además un campo eléctrico puede deflectar la
trayectoria de los electrones en un ángulo fijo. Mediante dos
deflexiones seguidas pueden desplazarse lateralmente las
trayectorias de los electrones. Esta técnica permite
el desplazamiento lateral de los haces de electrones en el
TEM, siendo esta operación especialmente importante para
el barrido de los haces en la variante STEM. De la
combinación de estos dos efectos así como del empleo de
un sistema de visualización (tal como una pantalla de
fósforo) se obtiene el nivel de control de los haces requerido
para la operación del TEM.
Las lentes del TEM permiten realizar la convergencia de los
haces y el control del ángulo de la misma. Dicho control se
ejerce modificando la cantidad de corriente que fluye a
través de las lentes cuadrupolares y hexapolares y permite
modificar los aumentos del TEM. La lente cuadripolar
consiste en un conjunto de cuatro bobinas situadas en los
vértices de un cuadrado. La lente hexapolar simplemente
incrementa el grado de simetría del campo resultante.
Típicamente un TEM contiene tres conjuntos de lentes con
muchas posibles variantes en la configuración de las lentes,
en particular la de TEM con filtrado energético o EFTEM. Los
conjuntos se denominan respectivamente lentes
condensadoras o condensador, lentes de objetivo o
simplemente objetivo y lentes de proyección o proyector. Las
lentes condensadoras se encargan de la formación inicial del
haz tras la emisión de los electrones. Las lentes de objetivo
focalizan el haz sobre la muestra y finalmente las lentes de
proyección se encargan de expandir el haz reflejado hacia la
pantalla de fósforo u otro dispositivo de visualización tal
como película. Los aumentos del TEM vienen dados por la
razón de las distancias entre la muestra y el plano
imagen del objetivo.
Es de apreciar que la configuración de un TEM varía
significativamente según su implementación. Así algunos
fabricantes usan configuraciones especiales de lentes, tales
como en instrumentos corregidos de aberración esférica, en
particular en aplicaciones de alto voltaje en TEM de emisión
de campo.
El sistema de visualización en un TEM puede consistir en
una pantalla de fósforo para observación directa por el
operador y opcionalmente en un sistema de registro de
imágenes tales como película o una retina CCD combinada
con una pantalla de fósforo. Normalmente estos sistemas de
visualización pueden ser intercambiados a conveniencia del
operador.
Sistema de vacío
Para conseguir el flujo ininterrumpido de electrones, el TEM
debe operar a bajas presiones, típicamente en el orden
de a Pa. La necesidad de esto se debe a dos
razones: primero, permitir una diferencia de voltaje entre
el cátodo y tierra sin que se produzca un arco voltaico.
Segundo, reducir la frecuencia de las colisiones de los
electrones con los átomos del aire a niveles despreciables.
Ya que el TEM, contrariamente a un CRT, es un sistema que
debe permitir la reposición de componentes, la inserción de
muestras y, particularmente en modelos antiguos, el cambio
de carrete de película, se hace imprescindible la posibilidad
de reproducir el vacío regularmente. Por ello los TEM están
equipados con sistemas de bombeo completos y su sellado
de vacío no es permanente.
El sistema de visualización en un TEM puede consistir en
una pantalla de fósforo para observación directa por el
operador y opcionalmente en un sistema de registro de
imágenes tales como película o una retina CCD combinada
con una pantalla de fósforo. Normalmente estos sistemas de
visualización pueden ser intercambiados a conveniencia del
operador.
Procedimiento para su uso
Para utilizar un microscopio electrónico de transmisión debe
cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de
miles de ángstroms. Los microscopios electrónicos de
transmisión pueden aumentar un objeto hasta un millón de
veces.
Base teórica
Teóricamente la resolución máxima alcanzable con un
microscopio óptico se encuentra en principio limitada por la
longitud de onda de la luz que se utiliza para examinar la
muestra, y por la apertura numérica del sistema.

Los físicos de principios del siglo XX teorizaron sobre


posibles maneras de superar las limitaciones impuestas por
la relativamente grande longitud de onda de la luz visible (de
400 a 700 nm) mediante el uso de electrones. Como toda la
materia, los electrones exhiben propiedades tanto
de onda como de partícula (como ya propuso Louis-Víctor
de Broglie). Como consecuencia se puede hacer que un haz
de electrones se comporte como un haz de radiación
electromagnética. La longitud de onda del electrón se
obtiene igualando la ecuación de Broglie a la energía
cinética de un electrón. Debe introducirse una corrección
relativista adicional, ya que los electrones en un equipo TEM
alcanzan velocidades próximas a la de la luz .

En un microscopio electrónico los electrones se producen


generalmente en un filamento, normalmente de tungsteno,
parecido al de una bombilla, mediante un proceso conocido
como emisión termoiónica o bien mediante emisión de
campo. Los electrones emitidos se aceleran entonces con
ayuda de un potencial eléctrico (medido en V, o voltios) y se
focalizan mediante lentes electrostáticas
o electromagnéticas.
Aplicaciones
La principal función del microscopio electrónico de
transmisión es estudio de los metales y minerales y el
estudio de las células a nivel molecular. Siendo así un papel
muy importante en la industria de la metalurgia. A su vez se
utiliza en la microbiología, para observar la estructura de
los virus. También es usado en la anatomía patológica, para
diagnosticar partiendo de la ultra estructura celular.
Novedades
Titán 80-300 Cubed, es el microscopio de electrones más
avanzado del mundo, capaz de ver el espacio entre átomos,
construido en Holanda por la Compañía FEI con un costo de
US$15 millones. Su resolución es equivalente a la del
telescopio espacial Hubble, pero en lugar de ver a las
estrellas y los astros, escrutará átomos en la Tierra.
11. Microscopio electrónico de barrido

Microscopio electrónico de
barrido.
El microscopio electrónico de
barrido o SEM (Scanning
Electrón Microscope), inventado
en 1937 por Manfred von
Ardenne, es aquel que utiliza un
haz de electrones en lugar de un
haz de luz para formar una
imagen. Tiene una
gran profundidad de campo, la
cual permite que se enfoque a la
vez una gran parte de la muestra.
También produce imágenes
de alta resolución, de forma que las características más
ínfimas de la muestra pueden ser examinadas con gran
amplificación. La preparación de las muestras es
relativamente fácil ya que la mayoría de los SEM sólo
requieren que estas sean conductoras. De esta forma, la
muestra generalmente es recubierta con una capa de
carbono o una capa delgada de un metal como el oro para
conferirle carácter conductor. Posteriormente, se barre la
superficie con electrones acelerados que viajan a través del
cañón. Un detector formado por lentes basadas
en electroimanes, mide la cantidad e intensidad de
electrones que devuelve la muestra, siendo capaz de
mostrar figuras en tres dimensiones mediante imagen
digital. Su resolución está entre 4 y 20 nm, dependiendo del
microscopio.
Antecedentes
Los primeros instrumentos desarrollados para este propósito
fueron los microscopios ópticos. Estos instrumentos
consistieron, a lo largo de los años, entre una
simple lupa hasta un microscopio compuesto. Sin embargo,
aún en el mejor instrumento óptico, la resolución está
limitada a la longitud de onda de la luz que se utilice, que en
este caso es la luz violeta, cuya longitud de onda es de
aproximadamente 400 nanómetros, separación máxima
entre detalles que puede observarse de esta manera. En
términos de amplificación, esto quiere decir que no podemos
amplificar más de 1000 veces.
Una salida inmediata a éste límite de resolución, fue utilizar
alguna radiación de longitud de onda más corta que la de la
luz violeta. Los candidatos inmediatos son los rayos X, que
se caracterizan por una longitud de onda del orden de 0,15
nanómetros; desafortunadamente éstos tienen la gran
desventaja de ser absorbidos rápidamente por
las lentesde vidrio, y de no poder ser desviados por las
lentes magnéticas (además de las precauciones que debería
tener el operador).
Otra posibilidad que se contempló fue la de aprovechar el
comportamiento ondulatorio de los electrones acelerados
por alguna diferencia de potencial. Sea el caso, por ejemplo,
de electrones acelerados en un campo de
100000 voltios que presentan comportamiento ondulatorio
con una longitud de onda de 0,0037 nm (3,7 picómetros), lo
que en principio permitiría tener un aparato que resolviera
detalles del mismo orden. Esto, en principio, sería suficiente
para resolver detalles atómicos, puesto que los átomos en
un sólido están separados en un orden de 0,2 nm. Sin
embargo, en la práctica, los detalles inherentes a la técnica
de observación o los defectos en el maquinado de las piezas
polares producen aberraciones.
Manfred von Ardenne
Artículo principal: Manfred von Ardenne
En 1928, Manfred von Ardenne estableció su laboratorio de
investigación privadaForschungslaboratorium für
1
Elektronenphysik, en Berlin-Lichterfelde, para llevar a cabo
su propia investigación en tecnología de radio y
televisión y microscopía electrónica. Inventó
2 3
el microscopio electrónico de barrido.
Funcionamiento
En el microscopio electrónico de barrido es necesario
acelerar los electrones en un campo eléctrico, para
aprovechar de esta manera su comportamiento ondulatorio,
lo cual se lleva a cabo en la columna del microscopio, donde
se aceleran mediante una diferencia de potencial de 1000 a
30000 voltios. Los electrones acelerados por un voltaje
pequeño se utilizan para muestras muy sensibles, como
podrían ser las muestras biológicas sin preparación
adicional o muestras muy aislantes. Los voltajes elevados se
utilizan para muestras metálicas, ya que éstas en general no
sufren daños como las biológicas y de esta manera se
aprovecha la menor longitud de onda para tener una mejor
resolución. Los electrones acelerados salen del cañón, y se
enfocan mediante las lentes condensadora y objetiva, cuya
función es reducir la imagen del filamento, de manera que
incida en la muestra un haz de electrones lo más pequeño
posible (para así tener una mejor resolución). Con las
bobinas deflectoras se barre este fino haz de electrones
sobre la muestra, punto por punto y línea por línea.
Cuando el haz incide sobre la muestra, se producen muchas
interacciones entre los electrones del mismo haz, y
los átomos de la muestra; puede haber, por ejemplo,
electrones que reboten como las bolas de billar. Por otra
parte, la energía que pierden los electrones al "chocar"
contra la muestra puede hacer que otros electrones salgan
despedidos (electrones secundarios), y producir rayos
X, electrones Auger, etc. El más común de éstos es el que
detecta electrones secundarios, y es con él que se hace la
mayoría de las imágenes de microscopios de barrido.
También podemos adquirir la señal de rayos X que se
produce cuando se desprenden estos mismos de la muestra,
y posteriormente hacer un análisis espectro gráfico de la
composición de la muestra .
Utilización

Cabeza de hormiga vista con un (MEB).


Se utilizan ampliamente en la biología celular.
Aunque permite una menor capacidad de
aumento que el microscopio electrónico de
transmisión, éste permite apreciar con mayor
facilidad texturas y objetos en tres dimensiones que se
hayan pulverizado metálicamente antes de su observación.
Por esta razón solamente pueden observarse organismos
muertos, y no se puede ir más allá de la textura externa que
se quiera ver. Los microscopios electrónicos sólo pueden
ofrecer imágenes en blanco y negro puesto que no utilizan
la luz visible.
Este instrumento permite la observación y caracterización
superficial de materiales inorgánicos y orgánicos,
entregando información morfológica del material analizado.
A partir de él se producen distintos tipos de señal que se
generan desde la muestra y se utilizan para examinar
muchas de sus características. Con él se pueden observar
los aspectos morfológicos de zonas microscópicas de
diversos materiales, además del procesamiento y análisis de
las imágenes obtenidas.
3D en SEM
Los microscopios electrónicos de barrido no proporcionan
naturalmente las imágenes en 3D contrarias a microscopio
de sonda de barrido. Sin embargo los datos 3D se pueden
obtener utilizando un SEM con diferentes métodos, tales
como:

 Fotogrametría (2 o 3 imágenes de muestra inclinado)


 Stereo fotométrica también llamado "la forma con
sombreado" (con 4 imágenes)
 Reconstrucción inversa utilizando modelos interactivos de
electrones de material
Las aplicaciones posibles son la medición de rugosidad,
medida de la dimensión fractal, medición de la corrosión y la
evaluación altura de los escalones.
12. Microscopio de iones en campo

Imágenes obtenidas al microscopio


de iones con un cátodo de tungsteno.
El sistema muestra la localización de
manchasen el borde de átomos
individuales. La disposición anular los
puntos es una foto de una red cúbica
en una superficie esférica
Diagrama de microscopía de
iones
La microscopía de iones en
campo (FIM) es una técnica
analítica empleada en ciencia
de materiales. El microscopio
de iones en campo es una
variedad de microscopio que
puede ser usado para visualizar la ordenación de
los átomos que forman la superficie de la punta afilada de
una aguja de metal. Fue la primera técnica con la que se
consiguió resolver espacialmente átomos individuales. La
técnica fue desarrollada por Erwin Müller. En 1951 se
publicaron por primera vez imágenes de estructuras
atómicas de tungsteno en la revista Zeitschrift für Physik.
En la FIM, se produce una aguja de metal afilada y se coloca
en una cámara de ultra alto vacío, que después se llena con
un gas visualizador tal como el helio o el neón. La aguja se
enfría hasta alcanzar temperaturas criogénicas (20-100 K).
Luego se aplica un voltaje positivo que va de 5.000 a 10.000
voltios sobre la punta. Los átomos de gas absorbidos por la
punta se ven ionizados por el fuerte campo eléctrico que
existe en las proximidades de ella. La curvatura de la
superficie cercana a la punta provoca una magnetización
natural; los iones son repelidos bruscamente en dirección
perpendicular a la superficie (un efecto de "proyección de
punto"). Se coloca un detector de modo que pueda recoger
esos iones repelidos; y la imagen formada por todos los
iones repelidos puede tener la resolución suficiente como
para mostrar átomos individuales en la superficie de la
punta.
Al contrario que los microscopios convencionales, donde la
resolución espacial se ve limitada por la longitud de onda de
las partículas empleadas en la visualización, el microscopio
basado en FIM funciona por proyección y alcanza
resoluciones atómicas, con una magnificación aproximada
de unos pocos millones de aumentos.

13. Microscopio de sonda de barrido


Un microscopio de sonda de barrido (también
llamado SPM por sus siglas en inglés Scanning Probe
Microscopy) es aquel que tiene el transmisor en la parte
exequimal del lente (Objetivo 4x). Este microscopio
electrónico utiliza una sonda que recorre la superficie del
objeto a estudiar. La rama de microscopios SPM se fundó
con la invención del microscopio en 1981.
Su uso en investigaciones científicas es el de regular la
imagen mediante un barrido de electrones haciendo que la
imagen aumente (10.000.000 nm).

14. Microscopio de efecto túnel

Imagen de reconstrucción sobre


una superficie limpia de oro (100).

Una imagen STM de


un nanotubode carbono de pared
simple.
Un microscopio de efecto
túnel (en inglés: Scanning
tunneling microscope o STM) es un
instrumento para tomar imágenes
de superficies a nivel atómico. Su desarrollo en 1981 hizo
ganar a sus inventores, Gerd Binnig y Heinrich
Rohrer (de IBM Zúrich), el Premio Nobel de Física en
1986.1 2 Para un STM, se considera que una buena
resolución es 0.1 nm de resolución lateral y 0.01 nm de
resolución de profundidad.3 Con esta resolución, los átomos
individuales dentro de los materiales son rutinariamente
visualizados y manipulados. El STM puede ser usado no
solo en ultra alto vacío, sino que también en aire, agua, y
varios otros líquidos o gases del ambiente, y a temperaturas
que abarcan un rango desde casi cero Kelvin hasta unos
pocos cientos de grados Celsius.4
El STM está basado en el concepto de efecto túnel. Cuando
una punta conductora es colocada muy cerca de la superficie
a ser examinada, una corriente de polarización (diferencia
de voltaje) aplicada entre las dos puede permitir a los
electrones pasar al otro lado mediante efecto túnel a través
del vacío entre ellas. La resultante corriente de
tunelización es una función de la posición de la punta, el
voltaje aplicado y la densidad local de estados (LDOS por
sus siglas en inglés) de la
muestra.4 La información es
adquirida monitoreando la
corriente conforme la posición de
la punta escanea a través de la
superficie, y es usualmente
desplegada en forma de imagen.
La microscopía de efecto túnel puede ser una técnica
desafiante, ya que requiere superficies extremadamente
limpias y estables, puntas afiladas, excelente control de
vibraciones, y electrónica sofisticada.

Animación mostrando el efecto túnel y su aplicación al


microscopio de efecto túnel
Un acercamiento de una cabeza de microscopio de efecto
túnel simple usando una punta de
platino-iridio.
Primero, una tensión de voltaje es
aplicada y la punta es colocada
cerca de la muestra por un burdo
control "muestra a punta", que es
apagado cuando la punta y la
muestra están suficientemente
cerca. En un rango cercano, el fino control de la punta en
todas las tres dimensiones cuando está cerca de la muestra
es típicamente piezoeléctrico, manteniendo la separación
punta-muestra, W, típicamente en el rango entre 4-7 Å, que
es la posición de equilibrio entre interacciones atractivas
(3<W<10Å) y repulsivas (W<3Å).4En esta situación, la
tensión de voltaje causará que los electrones realicen el
efecto túnel entre la punta y la muestra, creando una
corriente que puede ser medida. Una vez que el
"tunelamiento" es estabilizado, la tensión de voltaje de la
punta y su posición con respecto a la muestra pueden ser
variadas (con los detalles de esta variación dependiendo del
experimento) y los datos son obtenidos de los resultantes
cambios en corriente.
Si la punta es movida a través de la muestra en el plano x-y,
los cambios en la altura de la superficie y la densidad de
estados causan cambios en la corriente; estos cambios son
mapeados en imágenes. El cambio en la corriente con
respecto a la posición puede en sí mismo ser medido, o bien,
puede ser medida la altura de la punta, z, correspondiente a
una corriente constante.4 Estos dos modos de operación son
llamados modo de altura constante y modo de corriente
constante, respectivamente. En el modo de corriente
constante, la electrónica de retroalimentación ajusta la altura
por un voltaje al mecanismo piezoeléctrico de control de
altura.5 Esto lleva a una variación de altura y así la imagen
viene de la topografía de la punta a través de la muestra y
da una superficie de densidad de carga constante; esto
significa que el contraste en la imagen es debido a
variaciones en la densidad de carga.6 En el modo de altura
constante, el voltaje y la altura se mantienen ambos
constantes mientras que la corriente cambia para impedir
que el voltaje cambie; esto lleva a una imagen hecha de
cambios de corriente sobre la superficie, que pueden ser
relacionados a la densidad de carga.6 El beneficio de usar
un modo de altura constante es que es más rápido, debido
a que los movimientos del piezoeléctrico requieren más
tiempo para registrar el cambio de altura en el modo de
corriente constante, que el cambio de voltaje en el modo de
altura constante.6 Todas las imágenes producidas por STM
están en escala de grises, con color opcionalmente añadido
en post-procesado para enfatizar visualmente
características importantes.
Además de escanear a través de la muestra, la información
sobre la estructura electrónica a una localización dada en la
muestra puede ser obtenida por medio de barrer el voltaje y
medir la corriente en un lugar específico.3 Este tipo de
medida es llamada espectroscopia de efecto túnel (STS por
sus siglas en inglés) y típicamente resulta en un mapa de la
densidad de estados locales como una función de la energía
en la muestra. La ventaja de la STM sobre otras medidas de
la densidad reside en su habilidad para hacer medidas
extremadamente locales: por ejemplo, la densidad de
estados en un sitio de impureza puede ser comparada con
la densidad de estados lejos de las impurezas.7
Frecuencias de imágenes de al menos 1 Hz permiten
realizar la llamada Video-STM (es posible más de
50 Hz).8 9 Esto puede ser usado para escanear
la difusión de superficie.10
Instrumentación

Vista
esquemática de
un STM.
Los componentes
de un STM
incluyen la punta
de exploración,
un piezoeléctrico
de altura
controlada,
escáner x-y,
control muestra-
a-punta, sistema de aislamiento de vibraciones, y
computadora.5
La resolución de una imagen está limitada por el radio de
curvatura de la punta del STM. Además, si la punta tiene dos
puntas en vez de una, pueden observarse irregularidades en
la imagen obtenida; esto lleva a "imágenes de doble punta",
una situación en la que ambas puntas contribuyen al efecto
túnel y en la que se percibe una imagen duplicada.3 Por
tanto ha sido esencial desarrollar procesos para obtener
consistentemente puntas afiladas y útiles. Recientemente se
han utilizado nanotubos de carbono con este propósito.11
La punta puede estar fabricada de tungsteno o platino-iridio,
aunque también se utiliza el oro para ello.3 Las puntas de
tungsteno están fabricadas habitualmente por grabado
electroquímico, y las puntas de platino-iridio están
fabricadas por corte mecánico.3
Debido a la extrema sensibilidad de la corriente túnel a la
altura, es imperativo un apropiado aislamiento de
vibraciones o un cuerpo extremadamente rígido del STM
para obtener resultados útiles. En el primer STM de Binnig y
Rohrer, se usó levitación magnética para mantener el STM
libre de vibraciones; ahora se usan a menudo sistemas de
resortes o resortes de gas.4 Adicionalmente, son
implementados a veces mecanismos para reducir
las corrientes parásitas.
Manteniendo la posición de la punta con respecto a la
muestra, el escaneo de la muestra y la adquisición de los
datos son controlados por computadora.5 La computadora
puede ser usada también para mejorar la imagen con la
ayuda de procesamiento digital de imágenes12 13 así como
también para realizar medidas cuantitativas.14
Otros estudios STM relacionados

Nano manipulación por medio de


STM de una
monocapaautoensamblada de
un polímero semiconductor (aquí:
moléculas de PTCDA) en grafito, en
las cuales el logo del Centro para la
Nano ciencia(CeNS), LMU ha sido
escrito.
Muchas otras técnicas de microscopía han sido
desarrolladas basadas en el STM. Estas incluyen
la microscopía de escaneo de fotones(PSTM), que usa una
punta óptica para hacer efecto túnel en
3
fotones; potenciometría de escaneo por efecto túnel (STP),
que mide el potencial eléctrico a través de una
superficie;3 microscopía por efecto túnel de espín
polarizado (SPSTM), que usa una punta
ferromagnética para hacer efecto túnel en electrones
polarizados de espín en una muestra magnética,15 y
la microscopía de fuerza atómica (AFM), en la cual es
medida la fuerza causada por la interacción entre la punta y
la muestra.
Otros métodos de la STM envuelven el manipular la punta
para cambiar la topografía de la muestra. Esto es atractivo
por varias razones. Primero, el STM tiene un sistema de
posicionado atómicamente preciso que permite
manipulación a una muy precisa escala atómica. Además,
después de que la superficie es modificada por la punta, es
después una simple cuestión tomar la imagen con la misma
punta, sin cambiar el instrumento. Los investigadores
de IBM desarrollaron una forma de manipular átomos
de xenón adsorbidos en una superficie de níquel.3 Esta
técnica ha sido utilizada para crear "corrales" de electrones
con un pequeño número de átomos adsorbidos, que
permiten que el STM sea usado para observar oscilaciones
electrónicas de Friedel en la superficie del material. Aparte
de modificar la superficie actual de la muestra, se puede usar
también el STM para hacer efecto túnel en electrones dentro
de una capa de fotoresistorde haz de electrones en una
muestra, para hacer litografía. Esto tiene la ventaja de
ofrecer más control de exposición que la tradicional
litografía. Otra aplicación práctica del STM es la deposición
atómica de metales (Au, Ag, W, etc.) con cualquier patrón
(pre-programado) deseado, que puede ser usada como
contactos a nano dispositivos o como los propios nano
dispositivos.
Recientemente ciertos grupos han encontrado que pueden
usar la punta del STM para rotar enlaces individuales dentro
de moléculas individuales.[cita requerida] La resistencia
eléctrica de la molécula depende de la orientación del
enlace, así que la molécula se vuelve efectivamente un
interruptor molecular.
Principio de operación
El efecto túnel es un concepto que surge de la mecánica
cuántica. Clásicamente, un objeto que choca con una
barrera impenetrable no pasará a través de ella. Sin
embargo, los objetos con una muy pequeña masa, tales
como el electrón, tienen características de onda que
permiten el evento conocido como efecto túnel.
Los electrones se comportan como haces de energía, y en
la presencia de un potencial U(z), asumiendo un caso
unidimensional, los niveles de energía ψn(z) de los
electrones están dados por las soluciones a la ecuación de
Schrödinger,

donde ħ es la constante de Planck reducida, z es la


posición, y m es la masa de un electrón.4 Si a un electrón
de energía E se le hace incidir hacia una barrera de
energía de altura U(z), la función de onda del electrón es
una solución de onda,

donde

si E > U(z), que es verdad para una función de onda


dentro de la punta o dentro de la muestra.4 Dentro
de una barrera, E < U(z) así que las funciones de
onda que satisfacen esto son ondas en
descomposición,

donde

cuantifica el decaimiento de la onda dentro de


la barrera, con la barrera en la dirección
+z para .4
Conociendo la función de onda es posible
calcular la densidad de probabilidad para que
el electrón se encuentre en una localización en
particular. En el caso de efecto túnel, las
funciones de onda de la punta y la muestra se
traslapan tal que cuando están bajo una
tensión de voltaje, existe alguna probabilidad
finita de encontrar al electrón en la región de
barrera e incluso del otro lado de la
barrera.4 Se asume que la tensión de voltaje
es V y la anchura de la barrera es W. La
probabilidad mencionada, P, de que un
electrón enz=0 (borde izquierdo de la barrera)
pueda ser encontrado en z=W (borde derecho
de la barrera) es proporcional al cuadrado de
la función de onda,
.4
Si la tensión de voltaje es pequeña, puede
asumirse que U − E ≈ φM en la expresión
para κ, donde φM, la función trabajo, da la
energía mínima necesaria para arrancar un
electrón desde un nivel ocupado, el mayor
de los cuales está al nivel de Fermi (para
metales a T=0 Kelvin), a un nivel vacío.
Cuando una pequeña tensión de
voltaje V es aplicada al sistema,
únicamente los estados electrónicos muy
cerca del nivel de Fermi, dentro de eV (un
producto de la carga del electrón y el voltaje,
no debe confundirse con la unidad
electronvoltio), son excitados.4 Estos
electrones excitados pueden hacer efecto
túnel a través de la barrera. En otras
palabras, el efecto túnel ocurre
principalmente con electrones de energías
cercanas al nivel de Fermi.
Sin embargo, el efecto túnel requiere que
haya un nivel vacío de la misma energía del
electrón para que el electrón realice el
efecto túnel hacia el otro lado de la barrera.
Esto es debido a la restricción de que la
corriente de tunelamiento puede ser
relacionada a la densidad de estados
disponibles o llenos en la muestra. La
corriente debida a un voltaje aplicado V (se
asume que el efecto túnel ocurre de la
muestra a la punta) depende de dos
factores: 1) el número de electrones
entre Ef y eV en la muestra, y 2) el número
entre ellos que tiene estados libres
correspondientes para hacer túnel hacia el
otro lado de la barrera en la punta.4 Entre
mayor sea la densidad de estados
disponibles será mayor la corriente de
tunelamiento. Cuando V es positivo, los
electrones en la punta hacen túnel hacia los
estados vacíos en la muestra; para una
tensión de voltaje negativa, los electrones
hacen túnel desde los estados ocupados en
la muestra hacia la punta.4
Matemáticamente, esta corriente de
tunelamiento está dada por

.
Se puede sumar la probabilidad sobre las
energías entre Ef − eV y Ef para obtener
el número de estados disponibles en este
rango de energía por unidad de volumen,
encontrando así la densidad local de
estados (LDOS) cerca del nivel de
Fermi.4 La densidad local de estados
cerca de alguna energía E dentro de un
intervalo ε está dada por
,
y la corriente de túnel a una pequeña
tensión de voltaje V es proporcional a
la densidad local de estados cerca del
nivel de Fermi, que brinda información
importante acerca de la muestra.4 Es
deseable usar la densidad local de
estados para expresar la corriente
debido a que este valor no cambia
conforme cambia el volumen, mientras
que sí lo hace la densidad de
probabilidad.4 Así, la corriente de
tunelamiento está dada por

Donde ρs(0,Ef) es la densidad local


de estados cerca del nivel de Fermi
de la muestra en su
4
superficie. Esta corriente puede
también ser expresada en términos
de la densidad local de estados
cerca del nivel de Fermi de la
muestra en la superficie de la punta,

El término exponencial en las


ecuaciones superiores significa
que pequeñas variaciones en W
tienen mucha influencia en la
corriente de tunelamiento. Si la
separación es reducida por 1 Ǻ,
la corriente se incremente por un
orden de magnitud y viceversa.6
Esta aproximación falla en tener
en cuenta la tasa a la cual los
electrones pueden pasar la
barrera. Esta tasa debería
afectar la corriente de túnel, así
que puede ser tratada usando
la regla de oro de Fermi con el
apropiado elemento de matriz de
tunelamiento. John
Bardeen resolvió este problema
en su estudio de la unión metal-
aislante-metal.16 Él encontró que
si se resuelve la ecuación de
Schrödinger para cada lado de la
unión de manera separada para
obtener las funciones de onda ψ
y χ de cada electrodo, se podría
obtener la matriz de
tunelamiento, M, a partir del
traslape de estas dos funciones
de onda.4 Esto puede ser
aplicado al STM haciendo
electrodos a la punta y a la
muestra, asignando ψ y χ como
funciones de onda de la muestra
y la punta, respectivamente, y
evaluando M en alguna
superficie S entre los electrodos
metálicos, donde z=0 en la
superficie de la muestra y z=W
en la superficie de la punta.4
Ahora, la regla de oro de Fermi
da la tasa para la transferencia
de electrones a través de la
barrera, y se escribe

,
donde δ(Eψ–Eχ) restringe que
el efecto túnel ocurra solo
entre niveles de electrones
con la misma energía.4 El
elemento de matriz de túnel,
dado por

,
es una descripción de la
menor energía asociada
con la interacción de
funciones de onda en el
traslape, llamada también
energía de resonancia.4
Sumando sobre todos los
estados da la corriente de
tunelamiento como

,
donde f es la función de
Fermi, ρs y ρT son la
densidad de estados en
la muestra y la punta,
respectivamente.4 La
función de distribución
de Fermi describe el
llenado de niveles de
electrones a una
temperatura dada T.
Invención anterior[editar]
Un invento similar
anterior,
el Topografiner de R.
Young, J. Ward, y F.
Scire del NIST,17 se
basaba en la emisión de
campo. Sin embargo,
Young tiene crédito por
el Comité Nobel como la
persona que se dio
cuenta que sería posible
alcanzar una mejor
resolución utilizando el
efecto túnel.18

15. Microscopio de fuerza atómica

Diagrama de un microscopio de
fuerza atómica
El microscopio de fuerza
atómica (AFM, de sus siglas en

inglés Atomic Force Microscope) es un instrumento


mecano-óptico capaz de detectar fuerzas del orden de
los nano newton. Al rastrear una muestra, es capaz de
registrar continuamente su topografía mediante una sonda o
punta afilada de forma piramidal o cónica. La sonda va
acoplada a un listón o palanca microscópica muy flexible de
sólo unos 200 µm. El microscopio de fuerza atómica ha sido
esencial en el desarrollo de la nanotecnología, para la
caracterización y visualización de muestras a dimensiones
nano métricas ( ).
Historia
Gerd Binnig y Heinrich Rohrer fueron galardonados con
el Premio Nobel de Física en 1986 por su trabajo en
microscopía de barrido de túnel. Binnig y Rohrer fueron
reconocidos por el desarrollo de la técnica de microscopía
poderosa, que puede formar una imagen de cada uno de los
átomos sobre una superficie de metal o de semiconductores
mediante el escaneo de la punta de una aguja sobre la
superficie a una altitud de sólo unos pocos diámetros
atómicos. Compartieron el premio con el científico
alemán Ernst Ruska, el diseñador del primer microscopio
electrónico.1
Comparación del AFM con otros microscopios

Microscopio óptico
El microscopio óptico es una herramienta muy útil para
obtener imágenes de muestras orgánicas e inorgánicas,
pero está limitado para una resolución de 1mm a 1 micra.2

Microscopio electrónico
El microscopio electrónico tiene una resolución entre 1mm y
1nm. Es, por lo tanto, idóneo para la determinación de
estructuras a nivel molecular y atómico. La resolución no
está limitada por la difracción, pero sí por las lentes. El
microscopio de campo cercano tiene una resolución todavía
mayor: entre 1µm y 1Å.3

TEM
El Microscopio electrónico de transmisión, tiene las
siguientes características que lo hacen muy útil:

 Resolución atómica.
 Puede determinarse estructuras en 2 dimensiones.
 Interacción electrones a electrones.
SEM
El Microscopio electrónico de barrido tiene las siguientes
características:

 Resolución atómica.
 Requiere vacío.
 Debe cubrirse a menudo el espécimen.
 Permite características superficiales.

STM
El microscopio de efecto túnel (STM) es un instrumento que
permite visualizar regiones de alta o baja densidad
electrónica superficial, y de ahí inferir la posición de átomos
individuales o moléculas en la superficie de una red.
La "observación" atómica se ha vuelto una tarea común en
muchos laboratorios debido al bajo costo de este tipo de
microscopía en comparación con la microscopía
electrónica.4
Las técnicas de microscopía de barrido por sondeo (SPM:
Scanning probing microscopy) que incluyen al STM y al AFM
se utilizan en áreas de la ciencia que van desde la biología
hasta la física del estado sólido.

Principales restricciones y observaciones en su uso

 Algunas superficies parecen demasiado lisas al STM, la


altura aparente o corrugación es de 1/100 a 1/10
diámetros atómicos.
 Entonces, para resolver átomos individuales la distancia
entre punta y muestra debe mantenerse constante a
menos de 1/100 de diámetro atómico o hasta 0.002 nm.,
por ello el STM debe aislarse de las vibraciones.
 Debe tomarse en cuenta que el resultado es una
visualización que permite conocer características de la
muestra.
 No es una fotografía de los átomos en la superficie. Los
átomos parecen tener superficies sólidas en las imágenes
de STM, pero en realidad no las tienen.
 Sabemos que el núcleo de un átomo está rodeado de
electrones en constante movimiento. Lo que parece una
superficie sólida es en realidad una imagen de un
conjunto de electrones.
 Las imágenes también dependen de ciertos mecanismos
de interacción punta-muestra que no se entienden bien
hasta la fecha.
 Aun cuando no necesita alto vacío para su operación, es
deseable para eliminar contaminación y además una
cámara de vacío aísla de vibraciones externas.
Recientemente (4 de junio de 2007) un equipo liderado por
el Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) ha
perfeccionado la técnica empleada por los microscopios
atómicos. La nueva técnica, denominada Phase Imaging
AFM, está basada en la microscopía de fuerzas, y permite
realizar medidas tanto en aire como en medios líquidos o
fisiológicos. El desarrollo de esta técnica podría tener
aplicaciones en áreas diferenciadas, como la biomedicina, la
nanotecnología, la ciencia de materiales o estudios
medioambientales.
Instrumentación
Diagrama de un microscopio de
fuerza atómica
Los componentes de un AFM son:

 Diodo láser: Fuerza normal,


Fn=A+B-(C+D), y Fuerza lateral,
Fl=A+C-(B+D).
 Micro palanca
 Fotodiodo
 Tubo piezoeléctrico

Micro palancas

Históricamente las primeras


palancas tenían un tamaño de
varios mm y solían fabricarse con
metal, por ejemplo a partir de un
hilo de tungsteno con un extremo
afilado y doblado en ángulo recto
para producir la punta. Más tarde se hizo necesario, para
mejorar la velocidad de barrido sin perder resolución, que las
palancas tuvieran masas cada vez menores y
simultáneamente frecuencias de resonancia mayores. La
solución a este problema se halló en la micro fabricación de
las palancas.
Las micro palancas se producen en la actualidad empleando
métodos de micro fabricación heredados inicialmente de la
industria microelectrónica como litografía de superficie y
grabados reactivos de plasma de iones (RIE y DRIE siglas
en inglés de Reactive Ion Etching y Deep Reactive Ion
Etching).
Las puntas suelen fabricarse a partir de deposiciones de
vapor de algún material idóneo sobre la palanca ya
fabricada, en cuyo caso el resultado suele ser una punta
cónica o más comúnmente, cuando el silicio es el material
de elección, recurriendo a técnicas de grabado anisótropo.
El grabado anisótropo involucra el uso de una solución
grabadora que excava el material sólo o preferentemente en
ciertas direcciones cristalográficas. De esta manera, es
posible producir puntas piramidales limitadas por planos
cristalográficos del material.
La fuerza de la micropalanca viene dada por el fabricante y
se determina por la ley de Hooke. En este caso, la ley de
Hooke se representa por la ecuación del resorte, donde se
relaciona la fuerza F ejercida por el resorte con la distancia
adicional x producida por alargamiento, del siguiente modo:

, siendo
El ruido de Johnson-Nyquist, también conocido como
ruido térmico, es un factor importante en la calibración de
la micropalanca, pues está a su frecuencia de resonancia
por la temperatura.
Sensores de flexión
Existen actualmente distintos sistemas para medir la
flexión del listón. El más común en instrumentos
comerciales es el llamado óptica en éste la flexión del
listón se registra mediante un haz láser que se refleja en
la parte posterior de la micropalanca para luego alcanzar
un foto detector. A este efecto, la mayor parte de las
micropalancas (listones) de AFM se fabrican actualmente
con una capa de oro de unas decenas de nm de espesor
en su parte posterior para optimizar su reflectancia al haz
del láser. Sin embargo históricamente el primer sistema
de detección usado fue un microscopio de STM (efecto
túnel). En este sistema una punta de STM era ajustada al
listón siendo la flexión de este medida a través de la
variación en la corriente de túnel, ya que dicha corriente
es sensible a cambios subnanométricos en la distancia
entre punta de STM y listón. La razón de que se pensara
inicialmente en este sistema es que en su origen el
microscopio de AFM se concibió como modificación del
microscopio de STM para ser usado con muestras
eléctricamente aislantes ya que el microscopio de STM
sólo funciona con conductores. Posteriormente se pasó a
sustituir este sistema de detección por un interferómetro
y finalmente se introdujo la palanca óptica. Más
recientemente se han incorporado nuevos métodos de
detección basados en piezorresistividad o en medidas de
capacitancia. Sin embargo ninguno de estos métodos
"electrónicos" alcanza los niveles de resolución tanto
espacial como temporal de la palanca óptica.
Por otra parte la palanca óptica presenta un problema de
calibración que afecta especialmente a las medidas de
fuerza. Este se debe a la necesidad que se da en las
medidas de fuerza de registrar de forma precisa la flexión
de la palanca en su extremo libre. Ya que el fotodiodo
solamente registra el desplazamiento del punto de laser
sobre su superficie es necesario calibrar este
desplazamiento con una flexión real de la palanca para
poder obtener medidas de flexión. Este procedimiento
conocido como calibración de la sensibilidad se lleva a
cabo imprimiendo una flexión conocida al extremo de la
micropalanca mientras simultáneamente se registra la
señal del fotodiodo. La forma más común de obtener una
flexión conocida es presionar verticalmente el extremo de
la palanca contra una superficie rígida, asegurando así
que el desplazamiento vertical de la palanca equivale a
flexión en su extremo.
Los métodos interferométricos o de efecto túnel no
requieren de este procedimiento.
Punta

Ampliación a 3000x de una palanca


usada de AFM
Unos de los aspectos más
importantes en la resolución de las
imágenes obtenidas por AFM es la
agudeza de la punta. Las primeras
utilizadas por los precursores del AFM consistieron en
pegar el diamante sobre pedazos de papel de aluminio.
Las mejores puntas con radio de curvatura se encuentran
alrededor de los 5nm.
Existen tres tipos de influencias para formar las imágenes:

 Ensanchamiento
 Compresión
 Interacciones punta-muestra: En no
contacto, fuerzas electrostáticas y magnéticas; en casi
contacto, fuerzas de van der Waals; en
contacto, capilaridad y fuerzas de contacto.
 Aspecto del radio

Precisión

Es de 50pm (según el Ross)

La resolución vertical del instrumento es de menos de 1


nm, y permite distinguir detalles tridimensionales en la
superficie de la muestra con una amplificación de varios
millones de veces.
Tipos de medidas, modos de operación y
aplicaciones
El microscopio de AFM puede realizar dos tipos de
medidas: imagen y fuerza.
 En el modo de imagen la superficie es barrida en el
plano de la superficie (X-Y) por la punta. Durante el
barrido la fuerza interatómica entre los átomos de la
punta y los átomos en la superficie muestra provoca
una flexión del listón. Esta flexión es registrada por un
sensor adecuado (normalmente balanza óptica) y la
señal obtenida se introduce en un circuito o lazo de
realimentación. Este último controla un actuador
piezoeléctrico que determina la altura (Z) de la punta
sobre la muestra de forma que la flexión del listón se
mantenga a un nivel constante (Normalmente
introducido por el operador). Representando la altura
de la punta (Z) frente a su posición sobre la muestra
(X, Y) es posible trazar un mapa topográfico de la
muestra Z=Z(X, Y). La fuerza interatómica se puede
detectar cuando la punta está muy próxima a la
superficie de la muestra.
 En medidas de fuerza la punta se hace oscilar
verticalmente mientras se registra la flexión del listón.
La medida se expresa entonces representando fuerza
(F) frente a altura (Z) sobre la muestra. Las medidas de
fuerza son útiles en estudios de fuerzas de adhesión y
permiten estudiar a nivel de una sola molécula
interacciones específicas entre moléculas (ej:
interacción antígeno-anticuerpo, interacción entre
hebras complementarias de ADN) o interacciones
estructurales de las biomolecular (plegado de
proteínas) así como caracterizar la elasticidad de
polímeros. También es útil en estudios de indentación
de materiales blandos (polímeros) que permitan
caracterizar propiedades elásticas de la muestra como
el módulo de elasticidad o visco elásticas.
Modos de operación en imagen
Modos de operación: a. Modo contacto, b. Modo de no
contacto, c. Modo de repiqueteo
Modo contact
En el barrido en modo contacto (figura a) la fuerza entre
punta y muestra se mantiene constante, manteniendo una
constante de deflexión. La deflexión de la punta estática
se utiliza como una señal de retroalimentación.
La fuerza de adhesión es una fuerza fundamental en el
modo contacto:

Donde es la tensión superficial del agua, es el ángulo


del menisco entre punta y muestra, y R hace referencia al
radio de la punta y de la muestra.
En condiciones normales, la fuerza de adhesión es de
unos 7nN. La fuerza de adhesión es uno de los mayores
inconvenientes del modo contacto en aire. En el Hertz se
asume que la superficie es suave y continua, que el área
de contacto es pequeña, y que no existen fuerzas de
fricción ni adhesión. Sin embargo, la fuerza de adhesión
es muy importante a escala nanométrica, afectando
especialmente a la resolución lateral. Para superar este
inconveniente, se utiliza el Jumping mode, un modo de
contacto en el que se evitan las fuerzas laterales. El AFM
en líquido supera también este problema, pues en líquido
no existen fuerzas de adhesión.
El principal problema del modo contacto es que las
muestras biológicas (blandas y delicadas) pueden
dañarse. De ahí que funcione especialmente bien con
muestras fuertemente adheridas a la superficie. En
cristales de proteína, por ejemplo, las fuerzas laterales no
modifican la muestra, pero sí en moléculas individuales.
Modo dinámico
En los modos dinámicos se hace vibrar la micropalanca
a su frecuencia de resonancia valiéndose para ello del
actuador piezoeléctrico. La interacción punta-superficie
modifica la amplitud, frecuencia y fase de la resonancia,
mientras el lazo de realimentación mantiene constante
alguna de estas tres propiedades. Qué propiedad sea
ésta es el criterio que determina el modo concreto de
operación:

 En el Modo de no contacto o de frecuencia


modulada (FM-AFM) (figura b) se mantiene constante
la frecuencia de resonancia. La principal aplicación del
FM-AFM es levantar topografías de superficies duras a
escala atómica y operando en vacío extremo o UHV
(de sus siglas en inglés Ultra High Vacuum)
 En el Modo de repiqueteo (del inglés "tapping
mode") o de amplitud modulada (AM-AFM) (figura c)
se mantiene constante la amplitud. Se usa
principalmente en medio líquido para obtener
imágenes de muestras biológicas que sólo son
estables en soluciones acuosas.
Originalmente el uso del modo de no contacto implicaba
que la punta se encontraba siempre a distancia constante
de la superficie, mientras que en el modo de repiqueteo la
punta golpeaba intermitentemente la superficie.
Posteriormente se ha demostrado que ambos modos
pueden ser operados tanto a distancia de la muestra
como en contacto con ella.
Modos dinámicos en líquido
En el modo dinámico en líquido existen dos formas de
hacer oscilar la micropalanca:

 En los modos acústicos se sitúa el piezoeléctrico, o


bien en la parte trasera de la celda líquida, o bien bajo
la muestra. En este caso, el movimiento de la muestra
induce el de la micropalanca. La principal desventaja
de este modo es que resulta en resonancias muy
sucias.
 En los modos electrostático y magnético, la
micropalanca se hace oscilar mediante un campo
eléctrico o electrostático. La principal desventaja de
este modo es que hay que metalizar las micropalancas.
El modo dinámico en líquido, además de tratarse de una
técnica todavía en desarrollo, presenta
fundamentalmente dos problemas:

1. Es menos sensible a las fuerzas de la interacción


punta-muestra que el modo en aire. Esto es debido
a la reducción en agua de la constante de
amortiguamiento, lo que provoca que los cambios de
la frecuencia de resonancia se manifiesten en la
amplitud con menor sensibilidad.
2. Al existir contacto entre punta y muestra, se
necesitan micropalancas más blandas con
frecuencias de resonancia más altas.
Las aplicaciones del AFM en líquido son muy variadas:
permite la resolución de problemas estructurales y la
caracterización mecánica de proteínas, detectar el
funcionamiento de proteínas in situ (como el
desplegamiento de proteínas) y manipular proteínas
individuales.

16. Microscopía virtual

Vista microscópica de una muestra


histológica humana de mama, teñida
con hematoxilina yeosina.
El estudio a distancia de las imágenes
se puede
denominar telehistología, telecitología o telepatología
dinámica virtual dependiendo del tipo de información
biológica. Mediante un microscopio virtual, una persona
localizada en cualquier lugar del mundo controlará el área de
estudio del preparado microscópico (lámina virtual), y
analizará los tejidos o células en el aumento que desee con
el simple uso de los periféricos como el ratón con unos
pocos clics y sin factores horarios intervinientes.
Descripción
Un microscopio virtual puede ser estático o dinámico y
estático es cuando una imagen se encuentra previamente
digitalizada a un aumento determinado (20x, 50x, 100x). Un
microscopio virtual dinámico (también denominado
interactivo) permite hacer zoom a la imagen en tiempo real,
y en algunos casos, permitir el control del campo visualizado
mediante la manipulación remota de las muestras un
microscopio robotizado, el cual consiste básicamente en un
microscopio con un sistema de captación de imágenes
adosado (p. ej., cámara digital) y conectado a una
computadora, con lo que es posible controlar los parámetros
del microscopio remotamente (ejes x,y, y z, luz, diafragma,
aumentos).
Los sistemas de digitalización para microscopía virtual
actuales permiten el "escaneo" automático de muestras
preparadas y provenientes de citología o histología creando
una preparación virtual en cuestión de minutos. Con ello, es
posible digitalizar todo tipo de preparaciones histológicas o
citológicas, desde gruesos cortes (15 μm) de tejidos
incluidos en parafina, hasta finos cortes de 5 μm de
histología o histopatología convencional con tinciones
como hematoxilina eosina, inmunohistoquímica o
de inmunofluorescencia.
Una preparación virtual es uno o un conjunto de archivos que
contienen toda la información en imágenes de toda una
preparación. Un sistema informático conectado a un
microscopio realiza el barrido mediantes fotografías de toda
la preparación, y las organiza de manera que, mediante un
software especial, es posible obtener tener una imagen a
bajo aumento a modo de mapa de la preparación y los
sucesivos altos aumentos. Una de las ventajas más
inmediatas de este sistema es que permite obtener
fotografías a bajo aumento con un enfoque perfecto, pues el
bajo aumento proviene del ensamblado de imágenes bien
enfocadas a alto aumento. Los archivos obtenidos tienen un
peso (tamaño) muy elevado que puede oscilar entre 200 MB
y 40 GB.
Microscopios virtuales en educación
Con la llegada de las imágenes digitales y redes informáticas
como Internet, es fácil compartir fotografías macro y
microscópicas. El continuo progreso de las tecnologías
permitió la aparición de una forma específica de
telepatología dinámica ("láminas virtuales) y junto con
herramientas de navegación, logran hacer de cualquier
computadora personal un microscopio digital. El uso de
estas herramientas en la educación continua, conlleva un
desarrollo óptimo del conocimiento en futuros médicos u
otros trabajadores del área de la salud.
El proyecto Microscopio Virtual es una iniciativa supervisada
por la Universidad Rutgers para realizar micro morfología y
estudiar el comportamiento de pequeños organismos,
realizando estudios en línea. El servidor está localizado en
el norte de los Estados Unidos y las imágenes son tomadas
desde la Antártica y el Mar Báltico.
El instituto de investigaciones
forenses www.institutoforense.com igualmente cuenta con
un proyecto de microscopio virtual pero dirigido a la línea de
investigación de balística forense, para ayudar en la
resolución de casos criminales.
Otras tendencias contemporáneas son los laboratorios de patología
digital creados usando tecnologías informáticas propias de
la computación en nube. Como ejemplo de esto se encuentra el
depósito de imágenes "Virtual SlideBox" de la Facultad de Medicina
de la Universidad de Iowa y el "Virtual Microscope" de la Universidad
de Nueva York, el cual utiliza como base de su plataforma web
las API de Google Maps.
 Conde, Antonio, Microscopia virtual: ¿Un cambio en
la forma de hacer telepatología? [1]

 Mccullough, B, Ying, X, Monticello, T, & Bonnefoi, M,


Digital Microscopy Imaging and New Approaches in
Toxicologic Pathology.
 http://www.tecnicaenlaboratorios.com/Agilent/modo
s_de_imagen.htm
 http://www.tecnicaenlaboratorios.com/Agilent/que_e
s_afm.htm
 http://www.icmm.csic.es/fis/espa/afm.html
 Volver arriba↑ Pawley JB (editor) (2006). Handbook
of Biological Confocal Microscopy (3rd ed. edición).
Berlin: Springer. ISBN 038725921X.
 Volver arriba↑ «Patente de los Estados Unidos
Nº3013467».
 Volver
arriba↑ http://www.nobelprize.org/educational/physic
s/microscopes/phase/
 Volver
arriba↑ http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/mi
croscopy/phase.html
 Volver
arriba↑ http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/physi
cs/laureates/1953/
 Volver arriba↑ Arenas CM. Microscopía.
http://www.facmed.unam.mx/ (2010)
 Volver arriba↑ Leopold Dippel, Das Mikroskop und
seine Anwendung
 Volver arriba↑ Abramowitz M, Davidson MW
(2007). «Introduction to Microscopy». Molecular
Expressions.
 Volver arriba↑ O'Connor, J. J; Robertson, E
F. «Roger Bacon».
 Volver arriba↑ Ford, Brian J. (Jan1982). «Bacteria
and cells of human origin on van Leeuwenhoek's
sections of 1674». Transactions of the american
microscopical society 101(1): 9.
 Volver arriba↑ Ford, Brian J. (1984). «The origins of
biological microscopy». Royal Society soiree.
Catalogue of Exhibits.
 Volver arriba↑ Porter (1976) p. 262.
 Volver arriba↑ ucmp.berkeley.edu. «Antony van
Leeuwenhoek (1632-1723)».
http://www.brianjford.com/a-84-roysoc_soiree.pdf
http://www.sciences.demon.co.uk/whistmic.htm
http://www.brianjford.com/wav-mics.htm
http://www.brianjford.com/wav-spf.htm
http://www.brianjford.com/wavrbcs.htm
http://www.ucmp.berkeley.edu/history/hooke.html
http://www.uv.es/mabegaga/leeuwenhoek/leeuvenhoek.
html