TÉCNICAS INSTRUMENTALES ANALÍTICAS T12. Cromatografía de líquidos.



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Tema 12: Cromatografía de !"#$%&'#()"#$*")"$!+
líquidos.
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1. Las muestras para cromatografía de líquidos.

La cromatografía de líquidos amplía el campo de

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aplicación de la cromatografía de gases a compuestos polares,
termolábiles y de alto peso molecular.



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En términos generales, podemos dividir esta técnica en
cromatografía líquida clásica o cromatografía líquida de alta
resolución HPLC; esta última será objeto de estudio de este
tema y se caracteriza por el menor diámetro de la columna,
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menor longitud y tamaño de partícula y los mayores caudales a
los que se puede trabajar, también tiene un gran número de
platos teóricos por metro de longitud.

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2. Instrumentación en cromatografía de líquidos.
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Un cromatógrafo de líquidos consta de los siguientes componentes:
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Fase móvil.

Los depósitos para la fase móvil pueden ser: recipientes inertes, como botellas de
vidrio y tubos de teflón, o disolventes (agua, disoluciones tampón acuosas y disolventes
orgánicos) puros (previa filtración para eliminar partículas y desgasificado para eliminar las
burbujas que producen un ensanchamiento de banda).

La separación de los componentes se puede hacer por elución en gradiente, cambio

en la composición de la fase móvil, o elución isocrática, disolvente de composición constante.

Sistemas de bombeo.

Los sistemas de bombeo deben estar construidos con materiales inertes y su flujo debe
ir libre de pulsaciones, además debe generar presiones muy elevadas.

Introducción de la muestra.

Se introducen volúmenes pequeños para evitar sobrecarga de la columna mediante

válvulas de inyección con bucles de volumen conocido.

Jesús Ayllón, 2008 1


Profesora: Concepción Parrado Quintela

TÉCNICAS INSTRUMENTALES ANALÍTICAS T12. Cromatografía de líquidos.


3. Tipos de cromatografía líquida.

Cromatografía de reparto.

La separación está basada en el reparto del soluto entre dos fases líquidas, en función
de la solubilidad relativa. Se clasifica en:

 Fase normal: la fase estacionaria es polar (sílice) y la fase móvil es no polar

(hexano). El componente menos polar se adelante en la columna.
 Fase reversa: la fase estacionaria es no polar (C18) y la fase móvil es polar
(acuosa). El componente más polar se adelanta en la columna.

En general, la polaridad del componente es igual a la de la fase móvil y distinta de la de fase

estacionaria.

Cromatografía de adsorción.

La fase estacionaria es un sólido. La separación es debida a una serie de pasos de

adsorción y desorción. Las moléculas de soluto y la fase móvil compiten por los sitios de
adsorción sobre una fase estacionaria polar, ésta puede ser de aluminio o sílice. Se aplica a
compuestos orgánicos de peso molecular menor de 5000, no polares ni hidrosolubles. Tienen
la ventaja de que permiten la resolución de mezclas de isómeros de derivados de benceno.

Cromatografía de intercambio iónico.

La fase estacionaria tiene una superficie carga iónicamente, opuesta a los eluentes.
Los analitos son, por tanto, especies cargadas (cationes, aniones), la fase estacionaria es una
resina de intercambio iónico y sirve para determinar polímetros sintéticos de alto peso
molecular que contienen grupos ácidos y bases fuertes y débiles.

Cromatografía de exclusión molecular.

La separación está basada en el tamaño molecular. La fase estacionaria es una matriz

porosa que permite la separación de especies de alto peso molecular. La fase estacionaria
puede ser de filtración en gel (separa especies polar) o de permeación en gel (separa
especies no polares).

Cromatografía de afinidad.

La fase estacionaria contiene un ligando bioespecífico que interacciona sólo con un

componente de una mezcla. La elución del componente se realiza modificando las condiciones
experimentales.

4. Aplicaciones de la cromatografía líquida.

La cromatografía líquida con detección de fluorescencia tiene múltiples aplicaciones

en hidrocarburos aromáticos polinucleares, quinoleínas, esteroides, alcaloides…

Jesús Ayllón, 2008 2


Profesora: Concepción Parrado Quintela