METODO FUNCIÓN
Método de El método más comúnmente
Kjeldahl utilizado para la determinación de
nitrógeno orgánico es el
llamado método Kjeldahl, que se
basa en una volumetría ácido-base.
El procedimiento es directo, el
material necesario es muy simple
(aparato de destilación Kjeldahl), y
es fácilmente adaptable al análisis
rutinario de un gran número de
muestras. Es el método estándar
para la determinación del contenido
proteico en grano, harinas, carnes, y
en general, en materiales biológicos.
PROCEDIMIENTO
DIGESTIÓN.
 Medir muestra liquida y colocar
en el matraz de digestión.
Agregar ácido sulfúrico
concentrado al matraz
Verificar que el digestor este
en 440ºC y que haya succión
en la columna de
fraccionamiento.
 Digerir la muestra por 4 min
después de haber alcanzado
la temperatura indicada.
 Añadir de peróxido de hidrógeno al 50% a la muestra a través de un embudo
de la columna de fraccionamiento. Si el digesto no se torna incoloro, añadir
porciones adicionales de 5 ml hasta que el digesto se aclare.
 Diluir el digesto con 50 ml de agua destilada.
DESTILACIÓN
 El digesto obtenido y diluido se traslada a un balón de destilación.
 Preparar un vaso de 100 ml que contenga ácido bórico al 4% (en volumen)
adicionándole indicador azul de metileno y rojo de metilo, dando una coloración
violeta.
 El balón de destilación que contiene el digesto se añade hidróxido de sodio al
50% v/v y 2 a 3 granallas de zinc.
 Conectar el equipo de destilación y destilar el digesto (hasta que el vaso
receptor tenga una coloración verdusca y su volumen sea más o menos 3 veces
del volumen inicial)
TITULACIÓN.
 Preparar una solución de ácido sulfúrico 0.1 N y valorizarla.
 Titular el contenido del matraz receptor hasta que vire de verde a violeta
Método El método comprende un ensayo  Colocar en un tubo de ensayo 3ml de solución de albúmina al 1-2%.
Biuret colorimétrico de un paso donde se  Añadir 4-5 gotas de solución
cuantifica la formación de un de SO4Cu al 1%.
complejo estable entre proteínas y  Añadir 3ml de solución de
cobre (II). El complejo presenta un NaOH al 20%.
color violeta característico, que se  Agitar para que se mezcle
puede observar a 310nm o 540- bien.
560nm, el cual se da por la  Observar la coloración violeta.
coordinación de un átomo de cobre
con cuatro átomos de nitrógeno. El
complejo basa en la desprotonación
de los grupos amida para formar el
enlace con el cobre (II) o por el
establecimiento de un enlace
coordinado entre el metal y los pares
de electrones libres de los átomos de
oxígeno y de nitrógeno del péptido.
Después de la adición del reactivo de
cobre se requiere de tiempo para
desarrollar una coloración de Biuret
estable; es necesario considerar la
posible influencia de aminoácidos
libres que forman buffer en
configuración tris y amoniaco.

Método de El método de Lowry (1951) es un Para determinar la concentración de proteínas de la muestra problema se
Lowry método colorimétrico de valoración construye una curva patrón o de calibrado a partir de una solución patrón (BSA)
cuantitativa de las proteínas. A la (2 mg/mL). La concentración que tienen las muestras problema se determina por
muestra se añade un reactivo que interpolación de los valores de absorbancia en la curva patrón. El tubo 0, que sólo
forma un complejo coloreado con las contiene agua destilada y los reactivos, sirve de blanco para el ajuste del
proteínas, siendo la intensidad de colorímetro a cero de absorbancia. Pasos a seguir:
color proporcional a la concentración  Numerar del 0 al 6, tubos de plástico de 10 mL
de proteínas, según la ley de  Pipetear las cantidades de agua, solución patrón de albúmina y solución
Lambert-Beer A= ε.l.c Este método problema señaladas en la tabla.
consta de dos etapas:  Preparar el reactivo C, a partir de A, B1 y B2
 1) Los iones Cu2+, en medio  Pipetear a todos los tubos el reactivo C. Mezclar el contenido de cada tubo
alcalino, se unen a las proteínas y dejarlo reposar 15 minutos en oscuridad (dentro de la taquilla).
formando complejos con los átomos  A continuación añadir a todos los tubos el reactivo de Folin (diluido 1/4),
de nitrógeno de los enlaces mezclando bien por agitación. Dejar reposar 30 minutos en la oscuridad para
peptídicos. Estos complejos Cu2+- que así se desarrolle completamente la reacción coloreada.
proteína tienen un color azul claro.  Leer las absorbancias en el colorímetro a 580 nm. Previamente el aparato
Además, provocan el se ajusta a Absorbancia=0 con el blanco (tubo nº 0); de esa forma sólo se mide
desdoblamiento de la estructura el color producido por las proteínas, puesto que se resta el color debido a los
tridimensional de la proteína, reactivos. Anotar la medida de absorbancia en la tabla.
exponiéndose los residuos fenólicos
de tirosina que van a participar en la
segunda etapa de la reacción. El
Cu2+ se mantiene en solución
alcalina en forma de su complejo con
tartrato.
2) La reducción, también en medio
básico, del reactivo de Folin-
Ciocalteau, por los grupos fenólicos
de los residuos de tirosina, presentes
en la mayoría de las proteínas,
actuando el cobre como catalizador.
El principal constituyente del reactivo
de Folin-Ciocalteau es el ácido
fosfomolibdotúngstico, de color
amarillo, que al ser reducido por los
grupos fenólicos da lugar a un
complejo de color azul intenso.

Método El reactivo de ensayo BCA, se une al  Preparación de reactivo BCA :En 1 tubo de 10 ml , mezclamos Reagent A
del ácido cobre reducido Cu+1, formando un y Reagent B del kit, en la siguiente proporción :50 l Reagent A / 1 l Reagent
bicinconin- complejo ternario en un medio B Utilizamos placa de 96 pocillos
ico (bca) alcalino, con una elevada  Preparación de recta patrón de BSA (Bovine Serum Albumin)
sensibilidad y selectividad en la El patrón de BSA que viene con el kit tiene una concentración de 2mg/ml.
detección calorimétrica, de esta Ajustar el volumen de BSA dependiendo de la concentración del stock.
 manera la quelación de un ion cobre
por dos moléculas de BCA
por el BCA, dará como resultado el
complejo de color púrpura el cual es
soluble en agua y exhibe una mayor
absorbancia a 562 nm.
En la macro estructura de la
proteína el número de enlaces
peptidicos y la presencia de cuatro
aminoácidos (cisteina, cistina,
triptofano y tirosina) son los
responsables de la formación del
complejo de BCA coloreado
finalmente.
Método de
absorción
uv A
280nm
Lo hacemos por triplicado para tener 3 lecturas. Esto se usa para generar una
muestra patrón con g BSA en abscisas, y A562 en ordenadas. La recta es
“buena” si 0.98<R2<1
 Preparación de muestras a cuantificar (normalmente por triplicado, pero
depende de la cantidad de muestra que tengamos y la concentración que
estimemos “a ojo”: si creemos que nuestra muestra está muy concentrada, se
pueden hacer diluciones de uso para medir, ej. 1:2, o 1:5, usando buffer de lisis
para no cambiar la composición, que puede afectar a las medidas). x l muestra
+ 100 l BCA
 Incubar 30 minutos a 37º C , en estufa.
 Lectura de valores de absorbancia en espectrofotómetro a =562 nm
(algunos espectrofotómetros adquieren a 560 nm, esa medida también vale).
 Idealmente, interpolamos los valores obtenidos en la recta patrón (si no se
pasan por mucho, se puede extrapolar usando la fórmula; si los valores se pasan
por mucho, hay que repetir la recta usando diluciones de los lisados).
 La concentración final en g /ml viene dada por la media de valores para
un volumen dado de muestra dividido entre los l de volumen.
La reacción que se lleva a cabo en el ensayo es la siguiente:
1- Uniones peptídicas+ CU+2-------------- complejo tetradentato Cu+1.(verde
limon)
2- Cu+1 + 2acido bicinconinico (BCA) ------- BCA-Cu+1, complejo
ternario.(purpura)
Aunque ninguno de los 20 aminoácidos hallados en las proteínas absorbe luz en
la región visible del espectro electromagnético, tres de ellos (tirosina, triptófano y
fenilalanina) absorben significativamente en la región del UV cercano (alrededor
de 280 nm). Dado que muchas proteínas poseen restos de aminoácidos
aromáticos, las medidas de absorción a 280 nm constituyen un método rápido
para la estimación del contenido de proteína de una solución. Por ejemplo, se
utiliza de rutina para detectar los picos de absorción de proteínas en una corrida
cromatográfica ya que un detector UV se acopla a la salida de la muestra de la
columna. La desventaja es que algunas proteínas no poseen grupos aromáticos
(por ejemplo, una solución de hidrolizado de colágeno comercializada como

Método de Este método constituye una forma
Bradford rápida y confiable para determinar la
concentración de proteínas. Se basa
en la cuantificación de la unión del
colorante Azul Brillante de
Coomassie a una proteína
desconocida y la comparación de
esta unión con la de diferentes
cantidades de una proteína
standard. El complejo colorante -
proteína presenta un máximo de
absorción a 595 nm.
Método de Controlando el pH y la fuerza iónica
adhesión del medio los grupos funcionales
de un ácidos y básicos de las proteínas
colorante pueden interactuar con grupos
orgánicos de carga opuesta. Al
realizarse la unión se presenta
coloración o bien un cambio de ésta.
Comúnmente se usan colorantes
sulfonados los cuales reaccionan a
pH ácido con el grupo e-amino de la
lisina y el grupo guanidina de la
arginina, el imidazol de la histidina y
un número limitado de a-amino
terminales. Pueden adherirse
colorantes anionicos o pueden
adherirse colorantes catiónicos.
gelatina) y serán indetectables por este método. Si se conociera el valor del
coeficiente de absorción molar () para la proteína que se desea medir, este
método sería una forma de determinar la concentración de dicha proteína de
forma exacta.
Solución de Azul brillante de Coomassie: 100 mg de Azul Brillante de Coomassie
G-250 + 50 ml de etanol al 95 % + 100 ml de ácido fosfórico al 85 %. Llevar a 1
litro con H2O. Filtrar con papel Whatman No 1. Conservar a 4 oC.
 Agregar distintos volúmenes de la muestra, completando a 0,5 ml con
H2O, mezclar y adicionar 0,5 ml de Azul Brillante de Coomassie. Respetar el
orden del agregado de los reactivos. Mezclar y leer absorbancia a 595 nm en
un lapso de tiempo entre 2 minutos y 1 hora. La técnica implica la elaboración
de una curva de calibración con una solución proteica de concentración
conocida (por ejemplo, albúmina sérica bovina), llamada testigo o patrón.
Sensibilidad: 1 - 3,5 g de proteína en el volumen final de la determinación.
La muestra proteica se mezcla con una cantidad necesaria conocida de un
colorante aniónico en una solución buffer. Las proteínas se unen al colorante para
formar un complejo insoluble. Se mide el colorante no adherido, soluble posterior
a la equilibrarían de la reacción y la remoción del complejo insoluble por
centrifugación y filtración. colorante no adherido está inversamente relacionado
al contenido proteico de la muestra proteína en exceso de colorante: complejo
proteína-colorante insoluble colorante no adherido soluble
Método de La ninhidrina es específica para  Prepare los tubos con las soluciones indicadas según la siguiente tabla.
la aminoácidos y proteínas, para Utilice como muestra problema el extracto acuoso separado en la práctica 1
ninhidrina diferenciar entre carbohidratos y sección A:
aminoácidos y proteínas. Reacciona TUBO
con todos los α-aminoácidos REACTIVO ( ml ) Blanco 1 2 3 4 5 6 7 8
contenidos en la proteína dando Patrón de Leucina 100 g/ml - 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 - -
lugar a la formación de un complejo Agua destilada 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.9 0.9
color purpura cuyo pH se encuentra Muestra problema - - - - - - - 0.1 0.01
entre 4 y 8, a excepción de la prolina Reactivo de Ninhidrina 2% 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
e hidroxi-prolina que dan lugar a  Mezcle suavemente los tubos y tápelos con papel aluminio.
complejos de color amarillo. Este  Incúbelos en baño María a ebullición durante 15 minutos. Transcurrido el
complejo colorido (llamado púrpura tiempo enfríelos sumergiendo los tubos en un poco de agua fría cuidando que no
de Ruhemann) se estabiliza por se contaminen con el agua.
resonancia, el cual es independiente  Agregue a cada tubo 5 ml de etanol al 50 % a cada tubo y agite.
de la coloración original del  Obtenga en el espectrofotómetro la A570 de las mezclas de la curva patrón
aminoácido y/o proteína. y de los problemas (Tubo 7 y 8), calibrando con el contenido del tubo 1 (blanco
de reactivos).
Esta prueba es positiva tanto para  Con los resultados construya una curva patrón graficando g de proteína vs
proteínas como para absorbancia, en ella interpole el valor de absorbancia del tubo problema para
aminoácidos. Por ejemplo, en determinar:
aquellos casos donde la prueba de • la concentración de aminoácidos en 0.1 y 0.01 ml de la muestra y
Biuret es negativa y positiva la de • la concentración total de aminoácidos de la muestra problema en mg por gramo
Ninhidrina, indica que no hay de tejido.
proteínas, pero si hay aminoácidos
libres.
 Método Mide la reducción de la intensidad de Mezclar 1ml de solución problema con 4ml de alguna de las siguientes
turbidime la luz al pasar por una suspensión de scoluciones ácido sulfosalicílico al 2.5%
trico partículas de proteínas. Este cambio ácido tricloroacético al 5%%
se relaciona con el contenido de ferrocianuro de potasio 0.75%
proteína. Adicionar una gota de acido acético dejamdo reposr por 10 min
Medir espectrofotométricamente la turbidex
La concentración de proteínas se calcula a partir de una curva patrón preparada
con (albúmina bovina sérica con concentraciones de 1 a 10 mg/mL).

https://www.itwreagents.com/download_file/brochures/A173/es/A173_es.pdf

https://es.scribd.com/doc/42854211/ManualdeFundamentosyTecnicasdeAnalisisdeAlimentos-6501

http://www3.uah.es/bioquimica/Sancho/farmacia/practicas/Lowry.pdf

http://www.edu.xunta.gal/centros/iesquiroga/system/files/inicio/depart/bioloxia/materialbio/labbio2bac/prot.pdf