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Campus Diadema
UC - BIOQUÍMICA INTEGRADA
PROFESSORES
Giselle Zenker Justo (coordenadora)
Karin Simon
Nídia Alice Pinheiro
Virgínia Junqueira
2018
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Leia cuidadosamente os procedimentos experimentais (protocolos) e preste atenção nas instruções fornecidas
antes de iniciar o experimento.
Qualquer dúvida ou acidente peça auxílio aos professores, monitores, ou técnicos do laboratório.
OBJETIVOS
Determinar a concentração de uma solução de proteína de concentração desconhecida utilizando
o método de Biureto.
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MATERIAL E REAGENTES
Dissolva 1,5 g de sulfato de cobre (CuSO4.5H2O) e 6,0 g de tartarato duplo de sódio e potássio
(KNaC4H4O6.4H2O) em 500 mL de água destilada. Adicione, sob agitação constante, 300 mL de solução
de NaOH 10%. Adicione 1 g de iodeto de potássio (KI). Complete o volume para 1 L com água destilada
e guarde o reagente em frasco âmbar. Esse reagente conserva-se por tempo indefinido.
PROCEDIMENTO
1. Preparar os tubos como descrito na Tabela 1 utilizando uma solução de 8 mg/mL de albumina (proteína
padrão) e a solução de proteína de concentração desconhecida. Um dos tubos será o branco e nele não será
adicionada nenhuma solução de proteína. Siga a ordem de adição de reagentes mostrada na tabela.
2. Após adição dos reagentes, agitar e incubar os tubos por 15 min a 37°C.
3. Transferir o conteúdo dos tubos Branco e 6 para cubetas de espectrofotômetro. Medir a absorbância nos
diferentes comprimentos de onda: 450, 470, 500, 520, 540, 580, 600, 630, 650, 680 e 700 nm. Não esquecer de
zerar o aparelho com o branco para cada comprimento de onda.
4. Plotar os dados em um gráfico e definir o comprimento de onda a ser utilizado no ensaio.
5. Transferir o conteúdo de cada tubo da curva padrão para cubetas de espectrofotômetro e ler as absorbâncias no
comprimento de onda definido no passo acima. O espectrofotômetro será zerado com o Branco antes dessas
leituras.
6. Construir o gráfico da curva padrão, obter a equação da reta média e calcular a concentração de proteína na
amostra desconhecida. CALCULAR É DIFERENTE DE ESTIMAR!!!
Este modelo deu origem à equação de Michaelis-Menten que expressa a velocidade de uma
reação catalisada enzimaticamente e permite descrever o comportamento de diversas enzimas:
Vmax[S]
Vo =
Km+[S]
Enzimas Michaelianas apresentam uma curva hiperbólica de vo em função da concentração de
substrato. Nestas circunstâncias, o sistema tende a adquirir velocidade de reação máxima (Vmáx), que é
função da concentração inicial da enzima livre (E). Pode-se também definir uma concentração de
substrato na qual obtém-se metade de Vmáx. Esse valor corresponde ao Km, um parâmetro relacionado
com a afinidade da enzima pelo substrato.
O modo mais preciso de determinar essas grandezas num experimento de Cinética Enzimática é
através do gráfico de Duplo-recíproco ou de Lineweaver-Burk, que relaciona 1/vo com 1/[S] e constitui
uma reta.
Neste experimento, será estudada a cinética da reação catalisada pela invertase de levedura, que
hidrolisa sacarose produzindo glicose e frutose.
CH 2OH CH 2OH
O CH 2OH O O CH 2OH O CH 2OH
invertase
OH H HO
CH 2OH + H2O
OH H + H
HO
OH
HO O HO OH
OH OH
OH OH
A reação será acompanhada através da dosagem dos açúcares redutores formados, que se baseia
na reação destes com ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS). Esta reação gera um produto alaranjado cuja
formação pode ser acompanhada espectrofotometricamente pela medida da absorbância a 540 nm.
OBJETIVOS
MATERIAL E REAGENTES
Material Reagentes
PROCEDIMENTO
Curva padrão
A curva padrão tem por finalidade relacionar a quantidade (em µmols) de sacarose hidrolisada com
valores de absorbância a 540 nm.
Adicionar a seis tubos de ensaio (180 x 20 mm) volumes crescentes de solução padrão redutora,
conforme indicado abaixo, completando o volume em cada tubo para 2 mL com tampão. Como não ocorrerá
hidrólise de sacarose neste caso, pode-se acrescentar o reagente DNS logo após o tampão.
Obs: para o cálculo da concentração de sacarose hidrolisada, lembrar que a estequiometria da reação é de 1
sacarose produzindo 2 açúcares redutores.
Após a adição do DNS, colocar os tubos em banhos-maria fervente por 10 min, terminado este tempo,
esfriar em água corrente e adicionar 16 mL de água destilada. Homogeneizar os tubos por inversão e ler as
absorbâncias a 540 nm contra o branco.
Construir um gráfico Abs (540 nm) em função da quantidade de sacarose hidrolisada (µmoles/mL).
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1) Numerar nove tubos de ensaio (180 x 20 mm), que devem estar no gelo, e adicionar os reagentes
segundo o protocolo abaixo:
2) Após a adição da enzima, agitar suavemente. Retirar os tubos da temperatura de 0oC e colocá-los
simultaneamente em banho-maria a 37oC por 5 min. Transcorrido este tempo, os tubos devem
retornar imediatamente para o gelo. Assume-se que nesse instante a reação para. Ainda no gelo,
adicionar a cada tubo 2 mL de DNS. Na presença de DNS, devido à alcalinidade do reagente, a enzima
para de funcionar.
3) Transferir os tubos para banho-maria fervente e esperar 10 min. Terminado este tempo, esfriar em
água corrente e adicionar 16 mL de água destilada a cada tubo. Homogeneizar os tubos por inversão e
ler as absorbâncias a 540 nm.
4) Calcular os valores de concentração de sacarose hidrolisada utilizando as leituras de absorbância e a
curva padrão obtida no item anterior. Calcular a velocidade inicial de reação considerando o tempo de
reação a 37oC (5 min).
5) Fazer um gráfico da velocidade (µmols de sacarose hidrolisada/min) em função da concentração inicial
do substrato (mM de sacarose). Estimar os valores de Vmáx e Km.
6) Fazer um gráfico de Lineweaver e Burk e calcular os valores de Vmáx e Km.
ANEXO I: Soluções utilizadas:
5) Enzima Invertase
1,0 mg em 25 mL para uma concentração final de 40 µg/mL, em H2O. Diluir 5x para obter solução 8
µg/mL.
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Estimar o peso molecular de uma preparação de proteína. Observar a eficiência de separação por SDS-
PAGE das proteínas de uma amostra complexa.
MATERIAIS E REAGENTES
Materiais
Reagentes
PROCEDIMENTO
Serão montados géis de poliacrilamida de concentração 12% para separação de proteínas de diferentes
pesos moleculares.
Obs: Os monômeros de acrilamida são neurotóxicos, portanto, evite aspirar ou deixar cair na pele.
Caso isto ocorra, lave imediatamente, com bastante água e sabão. O polímero (poliacrilamida) é
inócuo/atóxico.
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1. Limpe bem o conjunto de duas placas de vidro com etanol e seque com papel absorvente.
2. Monte o cassete de gel com as duas placas de vidro, colocando dois espaçadores entre as mesmas, um
em cada extremidade lateral do conjunto. Esses espaçadores irão delimitar a espessura do gel que será
polimerizado entre as placas de vidro.
3. Posicione o cassete de vidro no módulo de corrida, certificando-se de que o vidro com entalhe esteja
voltado para o lado interno. Ajuste os prendedores de maneira a deixar o cassete bem preso ao módulo.
4. Para vedar a base do cassete, aplique uma solução aquecida de agarose 2% no canal localizado na base
do módulo de corrida. Deixe a agarose solidificar por 15 minutos.
OBSERVAÇÃO: Evite a formação de bolhas durante a aplicação dos géis e no posicionamento do pente.
1. Adicione o tampão de corrida (Obs: diluir 5x esta solução antes do uso) nas partes inferior e superior
da mini-cuba de eletroforese.
2. Com o auxílio de um pipetador automático, aplique lentamente 5 µL de mistura de proteínas de peso
molecular conhecido (marcador de peso molecular) a um dos poços de corrida.
3. Aplique as amostras previamente desnaturadas aos outros poços de corrida.
4. Tampe a cuba e conecte os cabos elétricos. Aplique uma tensão de 200 V por cerca de 45 minutos,
cuidando para que a linha do corante (azul de bromofenol-“linha de frente”) não ultrapasse os limites
inferiores do gel.
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1. Desmonte a cuba e retire cuidadosamente o gel das placas de vidro, mergulhando-o em solução para
coração contendo Coomassie Blue. Deixe o gel 1 hora nesta solução.
2. Retire o gel da solução de coração e coloque na solução de descoramento, até ser possível visualizar as
bandas de proteínas (para um melhor resultado, deixe “overnight”).
SOLUÇÕES UTILIZADAS:
OBJETIVOS
O teste oral de tolerância à glicose e a curva glicêmica são usados no diagnóstico de diabetes
mellitus, embora respostas anormais também ocorram em outras doenças, tais como nefrite e certas
anormalidades endócrinas. O teste avalia a capacidade do indivíduo de remover da circulação o excesso
de glicose adicionada.
Inicialmente, colhe-se uma amostra de sangue basal após o jejum de uma noite. Então, se
administra ao paciente 1 g de glicose por kg de peso, com um limite máximo de 75 g de glicose, por via
oral, diluída em cerca de 300 mL de água. A glicemia se excede na primeira hora, voltando
gradativamente ao normal após duas horas. No exame com fins clínicos, o paciente deve estar
confortavelmente sentado durante todo o teste, não deve fumar ou realizar exercícios e deve ter tido
uma dieta normal pelo menos 3 dias antes do teste.
Esta prática tem como objetivo determinar a captação de glicose por meio da curva glicêmica no
repouso e após a atividade física.
MATERIAIS E REAGENTES
Material
1) Glicosímetro.
2) Fitas para glicosímetro.
3) Lancetador automático.
4) Lancetas descartáveis.
5) Algodão.
6) Luvas descartáveis.
Reagentes
Material Biológico
1) Voluntários humanos.
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PROCEDIMENTO
1. Com o uso do lancetador automático, coletar uma pequena amostra de sangue de cada
voluntário em jejum. Dosar a concentração de glicose com auxílio do glicosímetro.
2. Ingerir 1 g/kg de peso de sacarose em solução (máximo de 75 g de sacarose) ou beber o suco
de laranja e/ou ingerir 4-5 bolachas.
3. O voluntário deverá manter-se sentado durante todos os intervalos de coleta.
4. Medir a glicemia de cada voluntário nos tempos 30, 60, 90 e 120 minutos, com o auxílio do
glicosímetro.
5. Organizar os dados por indivíduo de cada grupo, calcular a média da turma e faixa máxima e
mínima obtida na turma, construindo gráficos com os dados de valores de glicemia na
ordenada e tempo na abscissa.
QUESTÕES
1) Explique a eventual diferença (ou não) nos valores de glicemia no jejum e nos diferentes tempos
após a ingestão de açúcar.
2) Como seria a curva de um paciente com suspeita de diabetes mellitus?
3) Quais são os critérios definidos pela Organização Mundial de Saúde (OMS), American Diabetes
Association (ADA) e Sociedade Brasileira de Diabetes (SBD) para o diagnóstico de Diabetes
mellitus?
NORMAS DE SEGURANÇA EM LABORATÓRIO
Qualquer laboratório onde se manipule substâncias químicas é potencialmente perigoso. Portanto, tenha o
máximo de cautela e atenção ao realizar um experimento, evitando conversas e brincadeiras que dispersem a
concentração.
Existe uma regra geral que deve ser seguida neste ambiente: toda substância desconhecida é potencialmente
perigosa até que se prove o contrário!
A toxicidade das substâncias químicas varia enormemente e nem todas, mesmo as mais comuns, tiveram seus
aspectos toxicológicos suficientemente estudados.
Muitas das operações de laboratório necessitam de instruções específicas que os alunos devem seguir para a sua
segurança e de seus colegas. Embora as normas aqui assinaladas devam se estender a todos os ambientes onde se
manipulem substâncias químicas, nesta explanação, a sua importância se restringirá exclusivamente ao
laboratório de Bioquímica.
Diversas operações são desenvolvidas na rotina de um laboratório de Bioquímica. Entretanto, algumas práticas
gerais devem ser sempre obedecidas:
1. Não trabalhe sozinho no laboratório. O técnico responsável ou professor deverá estar presente. Além
disso, um companheiro, ao menos, sempre será uma ajuda em caso de acidente.
2. Use avental de mangas longas e confeccionado com tecido 100% algodão para proteger a roupa.
3. Use sapato fechado (NUNCA sandálias).
4. Use calças compridas (NUNCA saias, vestidos, bermudas ou shorts).
5. O material de uso pessoal deve ser guardado longe da bancada de trabalho, de modo a evitar acidentes.
6. Não fume no laboratório.
7. Não é permitido correr e realizar brincadeiras ou jogos no laboratório. Ao transitar pelo laboratório,
cuidado com os colegas que estão trabalhando nas bancadas, para evitar esbarrões que poderão causar
acidentes.
8. Se algum ácido ou outro produto químico for derramado, lave o local com bastante água.
9. Leia com atenção o rótulo dos reagentes para se ter certeza de que pegou o frasco correto.
10. Não jogue material sólido na pia.
11. Observe a limpeza dos materiais antes de utilizá-los.
12. Não gaste reagentes e soluções inutilmente, utilize somente o necessário para o experimento.
13. Nunca pese material diretamente sobre o prato da balança; use béquer, vidro de relógio, papel alumínio
ou papel manteiga.
14. Não ingira ou beba qualquer alimento no laboratório.
15. Não recoloque nos frascos soluções restantes, podem contaminar o conteúdo do recipiente.
16. Quando utilizar soluções e reagentes, certifique-se que o rótulo esteja voltado para cima, evitando que se
estrague.
17. Só use água destilada nos experimentos, a menos que indicado o contrário.
18. Não trabalhe com material defeituoso, principalmente de vidro.
19. Não deixe sobre a mesa a lamparina acesa com chama forte.
20. Não deixe vidro quente em lugar que possam pegá-lo inadvertidamente.
21. Não prove ou engula reagentes do laboratório.
22. Não trabalhe com materiais ou substâncias inflamáveis próximo a chamas.
23. Não aqueça tubos de ensaio com a boca virada para si ou para outra pessoa. Habitue-se a aquecer o tubo
de ensaio de forma intermitente.
24. Não aqueça substâncias inflamáveis ou voláteis em chama direta, use banho-maria.
25. Feche direito os frascos das soluções e regentes, principalmente os que forem voláteis e inflamáveis.
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26. Não jogue líquidos inflamáveis na pia, se o fizer abra bastante a torneira.
27. Lave bem as mãos ao deixar o laboratório.
28. NUNCA pipete com a boca soluções ou líquidos puros. Use pêras de sucção.
29. NUNCA adicione água a uma solução de ácido ou base concentrada para diluí-los. Sempre adicione
essas soluções concentradas à água.
30. Substâncias como vapores tóxicos tais como: bromo, cloro, ácido clorídrico e nítrico concentrados,
solução concentrada de amônia entre outras devem ser manipuladas na capela.
31. A neutralização de ácidos e bases deve ser realizada na capela. Use sempre luvas de borracha.
32. Tão importante quanto trabalhar em segurança é trabalhar ordenadamente, com consciência da seqüência
a ser realizada. Leia atentamente o procedimento experimental certificando-se de que todos os materiais
e reagentes necessários estão disponíveis. Anote os resultados obtidos relacionando-os à teoria da
prática.
33. Consulte o professor quando tiver dúvidas e avise-o de qualquer acidente que ocorra por menor que
pareça.
34. O laboratório gera resíduos provenientes dos restos das amostras analisadas e produtos líquidos (aquosos
ou orgânicos) ou sólidos provenientes de processos de análise, digestões etc. Em princípio, devemos
procurar reduzir ao mínimo a geração de lixo requisitando apenas o necessário e suficiente de materiais e
reagentes para a realização da análise e, sempre que possível, adotar métodos analíticos que utilizem o
mínimo de amostras. Antes de realizar o descarte de reagentes ou resíduos e a lavagem de materiais
utilizados na aula prática, procure identificar os locais apropriados, formas de tratamento e descarte dos
mesmos, especificados pelo técnico responsável.
Com relação aos tipos de substâncias que deverão sofrer tratamento antes do descarte, algumas
informações gerais que podem ser úteis são:
• Para materiais perfurocortantes como agulhas, seringas, lâminas, material descartável há um local
adequado para descarte.
• Líquidos aquosos sem metais pesados e sem fluoretos, soluções geradas em análises titulométricas
ácido-base, de precipitação, determinações de metais alcalinos terrosos com EDTA, acertar o pH entre 5
e 9, diluir com água e descartar na pia.
• Soluções contendo metais pesados (por exemplo, mercúrio presente em termômetros) requerem
tratamento especial pela alta toxidez e rigidez da legislação vigente. Portanto, há local adequado para
descarte de soluções contendo metais pesados. Muitas vezes pode-se quebrar o bulbo de um termômetro
de mercúrio. Em caso de derramamento de mercúrio, chame o professor ou técnico responsável. Deverá
ser providenciado ventilação exaustiva no laboratório e o uso de EPIs (equipamentos de proteção
individual: máscara respiratória adequada, óculos e luvas de borracha) específicos para a remoção do
mercúrio, fazendo amálgama com limalha ou fio de cobre para que o material possa ser encaminhado
para empresas de reciclagem. Por isso, seja BASTANTE CUIDADOSO com os termômetros utilizados
no laboratório; evite brincadeiras e seja cuidadoso para evitar derrubá-los no chão ou na bancada.