Kromatografi cair

LC adalah salah satu teknik pemisahan yang paling populer yang digunakan di laboratorium
untuk pemisahan campuran sampel berdasarkan interaksi antara molekul individu dalam
sampel dengan fase stasioner dan fase bergerak tersebut. Ini dapat dilakukan baik dalam
kolom atau pada lembaran dengan fase gerak cair dan dukungan solid sebagai fase diam.
Fase gerak bergerak menuruni fase diam yang membawa komponen sampel yang dipisahkan
selama kromatografi. Dalam LC, interaksi antara molekul sampel dan medium kromatografi
dapat didasarkan pada beberapa faktor seperti ukuran, muatan, pengikatan afinitas, atau
hidrofobik.
Suatu bentuk lanjutan dari teknik LC yang menggunakan tekanan tinggi untuk memaksa
sampel melalui kolom disebut kromatografi cair kinerja tinggi atau kromatografi cair tekanan
tinggi (HPLC). Saat ini metode analisis kuantitatif yang paling banyak digunakan di
laboratorium analisis farmasi dan dalam industri farmasi secara keseluruhan.
https://www.news-medical.net/life-sciences/Liquid-Chromatography-versus-Gas-
Chromatography.aspx
Kromatografi cair

Kromatografi cair adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan sampel ke dalam masing-
masing bagian. Pemisahan ini terjadi berdasarkan interaksi sampel dengan fase mobile dan
stasioner. Karena ada banyak kombinasi fase diam / bergerak yang dapat digunakan saat
memisahkan campuran, ada beberapa jenis kromatografi yang berbeda yang diklasifikasikan
berdasarkan keadaan fisik dari fase tersebut. Kromatografi kolom cair-padat, teknik
kromatografi yang paling populer dan yang dibahas di sini, memiliki fase gerak cair yang
perlahan-lahan menyaring melalui fase diam padat, membawa komponen yang terpisah
dengannya.

Skema Umum

Komponen dalam campuran dipisahkan dalam kolom berdasarkan afinitas masing-masing

komponen untuk fase gerak. Jadi, jika komponen dari polaritas yang berbeda dan fase bergerak
dari polaritas yang berbeda dilewatkan melalui kolom, satu komponen akan bermigrasi melalui
kolom lebih cepat dari yang lain. Karena molekul-molekul dari senyawa yang sama umumnya
akan bergerak dalam kelompok, senyawa-senyawa tersebut dipisahkan menjadi pita-pita
berbeda di dalam kolom. Jika komponen yang dipisahkan berwarna, band yang sesuai dapat
dilihat. Jika tidak seperti pada kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC), kehadiran pita-pita
dideteksi menggunakan teknik analisis instrumental lain seperti spektroskopi UV-VIS1.
Gambar berikut menunjukkan migrasi dua komponen dalam suatu campuran:

Pada langkah pertama, campuran komponen duduk di atas kolom basah. Ketika fase bergerak
melewati kolom, kedua komponen mulai terpisah menjadi band. Dalam contoh ini, komponen
merah memiliki afinitas yang kuat untuk fase gerak sementara komponen biru tetap relatif tetap
dalam fase diam. Karena setiap komponen dielusi dari kolom, masing-masing dapat
dikumpulkan secara terpisah dan dianalisis dengan metode apa pun yang disukai. Polaritas
relatif dari kedua senyawa ini ditentukan berdasarkan polaritas fase stasioner dan fase gerak.
Jika percobaan ini dilakukan sebagai kromatografi fase normal, komponen merah akan kurang
polar daripada komponen biru. Di sisi lain, hasil ini dihasilkan dari kromatografi fase balik
akan menunjukkan bahwa komponen merah lebih polar daripada komponen biru.

SEJARAH KROMATOGRAFI CAIR

Kromatografi pertama yang diketahui secara tradisional dikaitkan dengan ahli botani Rusia,
Mikhail Tswett yang menggunakan kolom kalsium karbonat untuk memisahkan senyawa
tanaman selama penelitiannya tentang klorofil. Ini terjadi pada abad ke-20 (1901).
Perkembangan kromatografi lebih lanjut terjadi ketika Hadiah Nobel diberikan kepada Archer
John Porter Martin dan Richard Laurence Millington Synge pada tahun 1952. Mereka mampu
menetapkan dasar-dasar kromatografi partisi dan juga mengembangkan teori Plate.
Kolom Kromatografi

Fase stasioner dalam kromatografi kolom biasanya adalah zat padat adsorben yang baik;
padatan yang mampu menahan partikel gas atau cair di permukaan luarnya. Kolom yang
biasanya digunakan dalam kromatografi kolom terlihat mirip dengan pipet Pasteur (pipet
Pasteur digunakan sebagai kolom dalam kromatografi kolom skala kecil). Keluarnya kolom
yang sempit pertama kali ditancapkan dengan glass wool atau pelat berpori untuk mendukung
material pengemasan kolom dan mencegahnya keluar dari tabung. Kemudian padatan adsorben
(biasanya silika) dikemas dengan rapat ke dalam tabung gelas untuk membuat kolom pemisah.
Pengepakan fase diam ke dalam kolom gelas harus dilakukan dengan hati-hati untuk
menciptakan distribusi materi yang seragam. Distribusi adsorben yang seragam penting untuk
meminimalkan keberadaan gelembung udara dan / atau saluran di dalam kolom. Untuk
menyelesaikan persiapan kolom, pelarut yang akan digunakan sebagai fase gerak dilewatkan
melalui kolom kering. Kemudian kolom dikatakan "dibasahi" dan kolom harus tetap basah
sepanjang seluruh percobaan. Setelah kolom disiapkan dengan benar, sampel yang akan
dipisahkan ditempatkan di bagian atas kolom basah. Foto kolom pemisah yang dikemas dapat
ditemukan di tautan.

Komponen

Kromatografi efektif karena komponen yang berbeda dalam suatu campuran tertarik ke
permukaan adsorben dari fase diam dengan berbagai tingkat tergantung pada masing-masing
komponen polaritas dan karakteristik strukturnya yang unik, dan juga interaksinya dengan fase
gerak. Pemisahan yang dicapai menggunakan kromatografi kolom didasarkan pada faktor-
faktor yang terkait dengan sampel. Jadi, komponen yang lebih tertarik pada fase diam akan
bermigrasi ke kolom pemisah pada laju yang lebih lambat daripada komponen yang memiliki
afinitas yang lebih tinggi untuk fase gerak. Juga, kemanjuran pemisahan tergantung pada sifat
dari padatan adsorben yang digunakan dan polaritas pelarut fasa gerak.

Fase Stasioner

Jenis bahan adsorben yang digunakan sebagai fase diam sangat penting untuk pemisahan
komponen yang efisien dalam suatu campuran. Beberapa padatan yang berbeda dapat
digunakan. Bahan adsorben dapat dipilih berdasarkan ukuran partikel dan aktivitas padatan.
Aktivitas adsorben diwakili oleh tingkat aktivitasnya, yang merupakan ukuran daya tarik
adsorben untuk zat terlarut dalam larutan sampel. Padatan dengan tingkat aktivitas tertinggi
adalah yang benar-benar anhidrat. Silica gel dan alumina adalah salah satu adsorben yang
paling populer digunakan. Alumina melayani dengan baik untuk sampel yang membutuhkan
kondisi khusus untuk terpisah secara memadai. Namun, penggunaan fase diam non-netral harus
dilakukan dengan sangat hati-hati, peningkatan atau penurunan pH dalam fase diam alumina
dapat memungkinkan reaksi kimia dalam komponen campuran. Silica gel, bagaimanapun,
kurang aktif daripada alumina dan umumnya dapat digunakan sebagai adsorben semua-sekitar
untuk sebagian besar komponen dalam larutan. Silica juga disukai karena kapasitas sampelnya
yang tinggi, membuatnya menjadi salah satu bahan adsorben yang paling populer.
Fase Seluler

Fase gerak yang tepat juga harus dipilih untuk pemisahan komponen yang terbaik dalam
campuran yang tidak diketahui. Eluen ini akan dipilih berdasarkan polaritasnya relatif terhadap
sampel dan fase diam. Dengan fase diam adsorben polar yang kuat seperti alumina, pelarut
polar yang digunakan sebagai fase gerak akan teradsorpsi oleh fase diam, yang dapat
menggantikan molekul sampel dalam campuran dan dapat menyebabkan komponen sampel
untuk mengelusi bervariasi dengan cepat. Ini akan memberikan sedikit pemisahan sampel,
sehingga yang terbaik adalah memulai elusi dengan pelarut polaritas yang lebih rendah untuk
mengelusi komponen yang diadsorpsi lemah ke fase diam terlebih dahulu. Pelarut juga dapat
diubah selama pemisahan untuk mengubah polaritas dan karenanya mengelompokkan berbagai
komponen secara terpisah dengan cara yang lebih tepat waktu. Metode ini sangat mirip dengan
metode pemisahan gradien yang digunakan dalam High Performance Liquid Chromatography
(HPLC).

Instrumentasi

Skema ini adalah instrumentasi dasar kromatografi cair-padat. Saluran masuk pelarut
membawa fase gerak yang kemudian dipompa melalui filter pelarut inline dan melewati katup
injeksi. Di sinilah fase gerak akan bercampur dengan sampel yang disuntikkan. Kemudian
diteruskan melalui filter lain dan kemudian melewati kolom di mana sampel akan dipisahkan
menjadi komponennya. Detektor mendeteksi pemisahan analit dan perekam, atau biasanya
komputer akan mencatat informasi ini. Sampel kemudian melalui filter backpressure dan
menjadi limbah.

Keuntungan Kerugian

Kromatografi kolom cair-padat adalah teknik pemisahan yang efektif ketika semua parameter
dan peralatan yang tepat digunakan. Metode ini sangat efektif ketika senyawa dalam campuran
diwarnai, karena ini memberi ilmuwan kemampuan untuk melihat pemisahan pita untuk
komponen dalam larutan sampel. Bahkan jika pita tidak terlihat, komponen tertentu dapat
diamati dengan metode visualisasi lainnya. Salah satu metode yang dapat bekerja untuk
beberapa senyawa adalah iradiasi dengan sinar ultraviolet. Ini membuatnya relatif mudah untuk
mengumpulkan sampel satu demi satu. Namun, jika komponen-komponen dalam larutan tidak
terlihat oleh salah satu metode ini, mungkin sulit untuk menentukan kemanjuran pemisahan
yang dilakukan. Dalam hal ini, koleksi terpisah dari kolom diambil pada interval waktu
tertentu. Karena mata manusia adalah detektor utama untuk prosedur ini, itu paling efektif
ketika band-band senyawa yang berbeda terlihat.

Kromatografi kolom cair-padat juga merupakan prosedur yang lebih murah daripada metode
pemisahan lain (HPLC, GC, dll.). Ini karena bentuk paling dasar kromatografi kolom tidak
memerlukan bantuan mesin mahal seperti pompa pelarut bertekanan tinggi yang digunakan
dalam HPLC. Dalam metode selain kromatografi flash, aliran fase gerak, pendeteksian setiap
band pemisahan, dan pengumpulan setiap komponen, semuanya dilakukan secara manual oleh
ilmuwan. Meskipun ini memperkenalkan banyak kemungkinan kesalahan eksperimental,
metode pemisahan ini dapat sangat efektif bila dilakukan dengan benar. Juga, keausan kaca
yang digunakan untuk kromatografi kolom cair-padat relatif murah dan tersedia di banyak
laboratorium. Buret biasanya digunakan sebagai kolom pemisah, yang dalam banyak kasus
akan berfungsi sama baiknya dengan kolom yang sudah disiapkan sebelumnya. Untuk
kromatografi skala kecil, pipet Pasteur sering digunakan.

Kromatografi flash memiliki potensi untuk menjadi lebih mahal daripada metode pemisahan
sebelumnya, terutama ketika pompa udara canggih dan pompa vakum diperlukan. Ketika
potongan-potongan mesin ini tidak diperlukan, bagaimanapun, saluran vakum dapat
dihubungkan ke aspirator2 pada keran air. Juga, pengontrol aliran udara bertekanan buatan
dapat dibuat seperti yang ditunjukkan sebelumnya.

Sumber :

https://chem.libretexts.org/Textbook_Maps/Analytical_Chemistry/Supplemental_Modules_(
Analytical_Chemistry)/Instrumental_Analysis/Chromatography/Liquid_Chromatography