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Soluciones

• Gradilla con 6 tubos de ensayo


•Eritrocitos humanos lavados en solución.
• Salina isotónica
• Solución de azul de metileno al 1.0%
• Cloruro de sodio en cristales (NaCl)
Objetivos
• Balanza granataria
Que el alumno:
Por grupo:
• 1 Microscopio marca Leica.
1. Identifique la existencia de soluciones en
los sistemas biológicos.
Procedimiento
2. Explique los cálculos y procedimientos
1. Hacer los cálculos para preparar una
para preparar soluciones porcentuales,
solución de KCl al 3%.
molares y normales, así como las diferentes
2. Hacer los cálculos para prepara una
diluciones de éstas.
solución de CaCl2 0.25 M se requieren 15 ml.
3. Presente ejemplos de soluciones utilizadas
3. Calcular el volumen de H2SO4 se requiere
en medicina (solución isotónica, Ringer,
para preparar una solución 3N 40 ml volumen
Darrow y Hartman).
final.
4. Hacer los cálculos correspondientes para
Responda a las siguientes preguntas:
comprobar que la solución a 0.9% de NaCl
1. ¿Qué es una solución?
es isotónica con respecto al plasma (ver pag.
2. ¿Cuántas clases de soluciones existen?
92). Considerar que:
3. ¿Qué significan los siguientes términos:
a) El cloruro de sodio se disocia en solución
mol, solución molar y solución normal?
acuosa en los iones sodio y cloruro, por lo
4. ¿Qué significan: v/v, p/v, p/p y ppm?
que la concentración iónica se duplica (1
5. ¿Cuál es la composición de las siguientes
mmol/l = 2 mosm/l).
soluciones: solución isotónica de cloruro de
b) La presión osmótica normal del plasma es
sodio, suero glucosado a 5%, Ringer-lactato?
de 290-310 mosm/l.
6. ¿Cuáles son los tipos de soluciones que
5. Preparar 20 ml de una solución de NaCl a
existen in vivo? Mencionar ejemplos.
4.5% (etiquetar como solución 1).
7. ¿Qué es una solución isotónica?
6. A partir de la solución anterior, preparar 25
8. ¿Qué es una solución osmolar?
ml a 0.9% (solución 2) y 50 ml a 0.045%
9. ¿Cómo se calcula la osmolaridad de una
(solución 3).
solución?
7. Colocar en tres tubos de ensayo las
10. ¿Qué les pasa a los eritrocitos cuando se
diferentes soluciones de cloruro de sodio
ponen en contacto con soluciones salinas de
preparadas en los puntos 1 y 2. Con la ayuda
diferente osmolaridad?
de un gotero (dejando caer lentamente por
11. ¿Qué se entiende por dilución y dilución
las paredes del tubo) 2 gotas de eritrocitos
seriada de las soluciones?
lavados. Mezclar con cuidado y dejar
reposar a temperatura ambiente unos
Material
minutos. Valorar el grado de hemólisis que
Por equipo:
sufren los eritrocitos cuando se ponen en
• 3 vasos de precipitado de 10 ml
contacto con las diferentes soluciones.
• 3 pipetas de 1.0 ml
• 3 pipetas de 5.0 ml
8. Hacer los cálculos necesarios para
• 3 pipetas de 10.0 ml
preparar otras soluciones, por ejemplo: 500
ml de etanol a 45 % (a partir de etanol a 96
%).Expresar en meq/l una concentración de
calcio de 11 mg/dl. Una solución contiene 14
g de glucosa en 25 ml. ¿Cuál es la reimpresión de la 2a. ed. México: Editorial
concentración molar de la solución? Limusa; 2004.
A un enfermo hay que inyectarle 15 g de KCl 3. Laguna J, Piña E. Bioquímica de Laguna.
y 126 g de glucosa (C6O6H12). 5a.ed. México: Editorial El Manual Moderno;
¿Cuánta agua habrá que añadirles para que 2002: p. 41-56.
resulte un suero 0.4 osmolar? 4. Holum JR. Fundamentos de química
9. Calcular la osmolaridad a partir de la general, orgánica y bioquímica para ciencias
composición de algunas soluciones como de la salud. México: Editorial Limusa Wiley;
Dextrosa a 10 % en solución salina a 0.45%. 2001.
Dextrosa a 5 % en solución salina a 0.2 %. 5. Farias GM. Química clínica. Décima
Hartman, Ringer y Darrow. edición México: Editorial El Manual Moderno;
1999.
10. Hacer la dilución y redilución (dilución 6. Bloomfield MM.Química de los organismos
seriada) de la solución de azul de metileno vivos. México: Editorial Limusa; 1997.
como se muestra en el siguiente cuadro:

DILUCIÓN SERIADA DE AZUL DE


METILENO
Tubo H2O Sol de azul Volumen de
(ml) de metileno transferencia
1 2 0.5 ml* -
2 2 - 0.5 ml
3 2 - 0.5 ml
4 2 - 0.5 ml
5 2 - 0.5 ml
6 2 - 0.5 ml

*Nota: para mezclar al hacer las diluciones se


debe succionar y soplar con cuidado la pipeta en
cada tubo varias veces antes de transferir la
dilución al siguiente tubo.

Resultados
1. Expresar en forma ordenada los cálculos
efectuados para cada uno de los ejercicios.

2. Deducir el movimiento o no del solvente


cuando se ponen en contacto eritrocitos con
soluciones hipo, hiper e isoosmóticas.

3. Calcular la dilución y la concentración de


azul de metileno en cada uno de los seis
tubos de la dilución seriada (ver pág. 93).
Asegúrese que la coloración obtenida
disminuya gradualmente conforme avanza la
dilución.

REFERENCIAS
1. Villazón SA, Cárdenas CO, Villazón DO,
Sierra UA. Fluidos y electrólitos. México: JGH
Editores; 2000.
2. Peña-Díaz A, Arroyo BA, Gómez PA,
Tapia IR, Gómez EC. Bioquímica. Undécima
INSTRUCCIONES PARA EL USO
DEL MICROSCOPIO MARCA LEICA

1. Nunca use un adaptador entre el cable y muestra con precisión utilizando el mando de
la fuente de alimentación. enfoque micrométrico.
11. Ajuste los tubos oculares a la distancia de
2. Use siempre el microscopio sobre una los ojos.
superficie dura y estable.
12. Al término del uso del microscopio retirar
3. Conecte el cable de alimentación del la muestra de la platina.
microscopio a una toma de corriente con
conexión a tierra. Se suministra un cable de 13. Bajar la platina hasta el tope y regresarla
tres terminales con toma a tierra. a su posición original si es necesario.

4. Encienda el microscopio girando el 14. Colocar el revolver de los objetivos de


interruptor de control de la iluminación manera que el objetivo de 4X sea el que
situado en la parte inferior izquierda del quede en dirección de la lámpara.
instrumento.
15. Desconectar el equipo y enrollar el
5. Coloque el interruptor de control de la cable.
iluminación en el nivel más bajo. El control
de iluminación le permite ajustar la intensidad 16. Limpiar la platina y oculares con un paño
de luz. humedecido con metanol o con un limpia
cristal comercial.
6. Abra completamente el diafragma de
apertura del condensador girando el anillo 17. Colocar al microscopio la funda contra el
hacia el extremo derecho. polvo para mantenerlo en buenas
condiciones físicas y mecánicas.
7. Usando el botón de enfoque del
condensador, suba el condensador hasta el Partes del microscopio:
extremo superior de su desplazamiento. 1) -Oculares.
Iluminación critica únicamente: si el 2) -Revolver con 4 objetivos 4X, 10X, 40X y
desplazamiento del condensador es 100X.
excesivo, limítelo con el tornillo situado 3) -Platina.
debajo de la platina hasta que la lente 4).-Diafragma.
superior del condensador se encuentre 5) -Lámpara.
debajo de la superficie de la platina. 6).-Tornillo de la platina para desplazar la
muestra.
8. Coloque la preparación de la muestra con 7).-Interruptor de control de la iluminación.
la muestra en la platina. 8).-Tornillo macrométrico.
9).-Tornillo micrométrico.
9. Gire el revólver hasta situar el objetivo 4X
en la posición de trabajo. (pag X) 1

10. Suba la platina girando el mando de 2


enfoque macrométrico hasta que observe la
preparación y, finalmente, enfoque la
6

9 3

4
8
Práctica 2
7 5
Práctica 2

Regulación del equilibrio ácido-base


después del ejercicio muscular intenso y
de la ingestión de bicarbonato de sodio

Objetivos
HCO3–/H2CO3 y, con base en ella, conteste la
1. Al finalizar la práctica, el alumno siguiente pregunta:
constatará las actividades reguladoras del
pulmón y el riñón para mantener el equilibrio 1. ¿Cómo participan el aparato respiratorio y
ácido-base en condiciones que tienden a el riñón en el control del pH sanguíneo?
romperlo.
2. Mediante la determinación del pH Material
observará la variación de la concentración de • Diez probetas o vasos de precipitado.
hidrogeniones en la orina de un individuo que • Orina.
ha realizado ejercicio muscular intenso. • Potenciómetro.
3. Relacionará los resultados obtenidos con • Piceta.
los cambios metabólicos originados por el
ejercicio muscular intenso. Método
Un alumno por equipo desayunará o comerá
Conteste las siguientes preguntas: normalmente (evitar ingestión de jugos
ácidos); después hará lo que se indica a
1. ¿Por qué es importante que se mantenga continuación:
constante, dentro de ciertos límites, el pH en
el organismo? 1. Tomar 250 ml de agua una hora antes de
2. ¿Cuáles son las fuentes de iones H+ en el la clase práctica. Vaciar la vejiga y descartar
organismo? esa orina.
3. ¿Cuáles son los sistemas reguladores que 2. Tomar 250 ml de agua inmediatamente
antes de la clase práctica.
facilitan la eliminación del H+ producido en el
3. Orinar en un vaso de precipitado de 100
organismo con el fin de mantener constante
ml. Anotar el volumen de la muestra.
el pH sanguíneo?
4. Ingerir 250 ml de agua.
4. ¿Cuáles son las reacciones de formación
5. Realizar ejercicio muscular intenso, como
del ácido carbónico (H2CO3) a partir de CO2 y
subir y bajar varias veces las escaleras de
H2O, y de su disociación para formar el ion
tres o cuatro pisos u otro ejercicio sugerido
bicarbonato? Escríbalas.
por el profesor.
5. ¿Qué sistemas amortiguadores participan
6. Obtener muestras de orina cada 15
directamente en la regulación del pH
minutos, como en el inciso 3, hasta completar
sanguíneo?
por lo menos cinco muestras.
6. ¿Cuáles son los sistemas extrasanguíneos
7. A cada muestra se le determinará el pH
que tienden a mantener el pH extracelular?
inmediatamente después de haber sido
obtenida ya que con el tiempo el pH tiende a
Escriba la ecuación de Henderson y
aumentar debido a la pérdida de dióxido de
Hasselbalch aplicada al sistema
carbono y a que el crecimiento bacteriano
produce amoniaco a partir de la urea.
Análisis de resultados 1. Tomar 250 ml de agua una hora antes de
la clase práctica. Vaciar la vejiga y descartar
Una vez obtenido el valor del pH para cada esa orina.
una de las 5 muestras de orina, trazar una
gráfica de pH contra tiempo; interpretar los 2. Tomar 250 ml de agua inmediatamente
resultados y discutirlos en grupo. antes de la clase práctica.
3. Orinar en una probeta de 100 ml. Anotar el
Segunda parte volumen de la muestra.
4. Ingerir 250 ml de agua con 7.5 g de
Objetivos bicarbonato de sodio.
5. Obtener muestras de orina cada 15
1. El alumno constatará el papel del riñón en minutos, hasta completar por lo menos 5
el mantenimiento del equilibrio ácido-base en muestras.
una situación de alcalosis metabólica 6. A cada muestra se le determinará el pH
provocada por la ingestión de bicarbonato de inmediatamente después de haber sido
sodio. obtenida.
2. Mediante la medición del pH, observar la
variación de la concentración de Análisis de resultados
hidrogeniones en la orina de un individuo que Una vez obtenido el valor del pH para cada
ha ingerido una carga de bicarbonato de una de las cinco muestras de orina, trazar
sodio. una gráfica de pH contra tiempo; interpretar
los resultados y discutirlos en grupo.
Hipótesis
REFERENCIAS
Elabore la hipótesis apropiada. 1. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con
aplicaciones clínicas. 4a. ed. Barcelona:
Material Editorial Reverte; 2004.
• Orina. 2. Montgomery R. Bioquímica: casos y texto.
• Solución de bicarbonato de sodio a 3%. 6a. ed. Editorial Harcourt-Brace; 1998: cap.4.
• Potenciómetro. 3. Villazón SA, Cárdenas CO,Villazón

Método

Práctica 3
Titulación de un aminoácido con una
base y la aplicación de la ecuación de
Henderson y Hasselbalch.
Determinación del pK1 y del pK2

11. ¿Cuál es el punto isoeléctrico de los


Objetivos aminoácidos que tienen un grupo amino y un
Que el alumno: grupo carboxilo?
1. Experimente y entienda cómo se comporta 12. ¿Cuál es la carga eléctrica de los
un sistema amortiguador de pH. aminoácidos que tienen dos grupos carboxilo
2. Aprenda el uso de la ecuación de a pH de 7.0?
Henderson-Hasselbalch. 13. ¿Cuál es la carga eléctrica de los
3. Aprenda a calcular el pK de un par ácido- aminoácidos que tienen dos grupos amino a
base. pH de 7.0?
4. Mida el pH de diferentes sustancias y
calcule su concentración de H+. Material
5. Aplique estos conocimientos al estudio de • Cuatro vasos de precipitado de 100 ml.
las propiedades de los aminoácidos. • Pipeta de 1 ml (para el NaOH).
• Potenciómetro.
Para lograr lo anterior conteste las • Piceta para enjuagar el electrodo.
siguientes preguntas y planteamientos: • Glicina 0.025 mol/l pH 2.
• Lisina 0.025 mol/l pH 2.
1. ¿Qué es el pH de una solución? • Ácido aspártico 0.025 mol/l pH 2.
2. ¿Qué es un sistema amortiguador ácido- • Histidina 0.025 mol/l pH 2.
base y para qué sirve? • NaOH 1.0 mol/l.
3. ¿Cuáles son los sistemas amortiguadores
más importantes en biología? Método
4. Escribir la ecuación de Henderson- 1. Poner 20 ml de la solución de glicina en un
Hasselbalch. vaso de precipitado de 100 ml.
5. ¿Qué es el pK de un par ácido base? 2. Proceder a la medición del pH.
6. ¿Por qué es importante la concentración 3. Añadir 0.1 ml de NaOH 1.0 mol/l. Agitar el
vaso y volver a medir el pH; anotar los
de H+ en los seres vivos? resultados.
7. Dibujar la fórmula de la glicina, de la lisina,
4. Repetir el paso 3 hasta llegar a un pH
de la histidina y del ácido aspártico
e identificar a los grupos α -amino y α - aproximado de 12.
carboxilo de estos aminoácidos, así como su 5. Hacer lo mismo (pasos 1 a 4) para los
radical, e indicar la naturaleza del mismo. otros tres aminoácidos.
8. ¿Qué les pasa a estos grupos funcionales
cuando se someten a pH ácido o básico?
9. ¿Se pueden usar los aminoácidos como
amortiguadores de pH?
10. ¿Son los aminoácidos buenos
amortiguadores a pH de 7.0?
Análisis de resultados Medición del pH y cálculo de la concentración
1. Hacer una gráfica de pH vs volumen en de H+ en diferentes líquidos
ml de NaOH gastados luego de tomar en
cuenta que cada 0.1 ml de NaOH diluido en Método
20 ml aumenta la concentración de OH en 5 1. Pedir a los alumnos desde la clase
mM. anterior que traigan diferentes muestras,
2. Localizar en la gráfica el pI y los tales como leche, café, refresco, orina, saliva,
diferentes pK de los aminoácidos. jugo de frutas, etcétera.
3. Mediante la ecuación de Henderson- 2. Colocar los líquidos en un vaso de
Hasselbalch cuantificar la relación entre cada precipitado y medir el pH en el
par de especies ionizables de los potenciómetro.
aminoácidos a diferentes pH.
4. Identificar a qué pH tienen poder
amortiguador. Análisis de resultados
Calcular la concentración molar de H+ en
cada uno de las muestras estudiadas.

REFERENCIAS
1. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con
aplicaciones clínicas. 4a. ed. Barcelona:
Editorial Reverte; 2004.
2. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de
bioquímica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones
Omega; 2005
Práctica 4

Estudio de las proteínas corporales

Objetivos • Plasmáticas o hemáticas, son las proteínas


de la sangre.
1. Aplicar los conocimientos generales sobre
las proteínas al estudio de las proteínas Aunque las proteínas tisulares son de gran
corporales. importancia en el organismo, las localizadas en
2. Conocer las alteraciones más frecuentes la sangre (la hemoglobina en los eritrocitos y
de las proteínas plasmáticas y sus las proteínas plasmáticas), por su gran
consecuencias. accesibilidad, proporcionan con facilidad
3. Conocer los métodos generales para el información importante y, por lo tanto, son las
estudio de las proteínas plasmáticas. más utilizadas en el laboratorio clínico.
4. Determinar la concentración sérica de
proteína total y de albúmina e interpretar los Proteínas plasmáticas
resultados obtenidos. La sangre está constituida por formas celulares
en suspensión (eritrocitos, leucocitos y
INTRODUCCIÓN plaquetas) en un medio líquido llamado
Las proteínas son polímeros lineales plasma. El plasma se obtiene cuando,
constituidos por los aminoácidos, que se unen inmediatamente después de extraer la sangre,
entre sí por medio de enlaces tipo amida se le agregan anticoagulantes como oxalato,
denominados enlaces peptídicos. citrato, EDTA o heparina y se centrifuga. Si se
Los polímeros compuestos por dos recoge sangre sin anticoagulante y se deja que
aminoácidos forman un dipéptido, por tres, un ésta coagule, el líquido que se separa se llama
tripéptido; cuando el número de aminoácidos suero. El suero carece de células y de factores
es mayor, oligopéptidos y polipéptidos o de la coagulación incluyendo la proteína
simplemente se denominan péptidos. Las fibrinógeno, pues ésta ha sido transformada en
proteínas son moléculas constituidas por una o fibrina insoluble en el proceso de la
más cadenas polipéptidicas. coagulación. El fibrinógeno constituye sólo de
Las proteínas pueden ser clasificadas en 3 a 6% del total de las proteínas en plasma.
función de aspectos tan diversos como su El agua constituye 92 a 93% del plasma o
composición, su disposición espacial, su suero y en ella encontramos electrolitos,
función biológica y su localización. metabolitos, nutrientes, hormonas y proteínas
Atendiendo a su localización dentro del en una proporción de 7 a 8%; de estos solutos
organismo humano, las proteínas pueden presentes, las proteínas son las que están en
clasificarse en: máxima proporción, aproximadamente 6 a 8
g/dl de suero y este valor es 0.2 a 0.4 g/dl
• Hísticas o tisulares, son las proteínas de los
mayor en plasma por la presencia de
tejidos.
fibrinógeno.
Las proteínas plasmáticas son un grupo de Las enzimas se estudian evaluando su
más de 100 moléculas distintas con actividad catalítica o su concentración de masa
características y funciones muy diversas, mediante métodos inmunoquímicos. También
aunque para fines prácticos el término es posible el estudio fraccionado de las
"proteína plasmática" se usa para todas proteínas, para lo que se recurre a otros
aquellas proteínas cuya concentración en el procedimientos más precisos de gran ayuda
plasma sea mayor a 10 mg/dl y que cumplan clínica, como la electroforesis, la
con alguna función específica dentro de él. inmunoelectroforesis y la inmunodifusión radial
Aproximadamente son 20 las proteínas que de proteínas plasmáticas.
cumplen con ambas definiciones. Todas estas
proteínas, a excepción del fibrinógeno, se
Proteína total
encuentran tanto en plasma como en suero.
La suma de las concentraciones de todas y
La mayoría de las proteínas plasmáticas son
cada una de las proteínas presentes en el
sintetizadas por el hígado. Las proteínas del
plasma se conoce como proteínas totales y la
plasma, al igual que otras proteínas del
cifra normal, en promedio, es de 7.1 g/dl,
organismo, son destruídas y reemplazadas
siendo las cifras límite entre 6 y 8 g/dl.
constantemente, con una vida media de
Las proteínas totales están integradas por
aproximadamente 10 días.
albúmina (más de la mitad) y las globulinas;
Las funciones de las proteínas plasmáticas
estas últimas agrupan a todas las proteínas
pueden agruparse en tres grandes grupos: de
que no son albúmina.
transporte como la transferrina, lipoproteínas y
La concentración de las proteínas plasmáticas
la albúmina; de defensa del organismo en el
en un momento determinado es el resultado de
ataque a agentes extraños o para limitar la
tres procesos: la velocidad de síntesis, el
respuesta inflamatoria, como las
volumen del líquido en que se distribuyen y la
inmunoglobulinas, la a1-antitripsina, la
velocidad de degradación. En diversos estados
haptoglobina y el complemento. Por último,
patológicos, estos procesos pueden
para mantener la presión oncótica de la
superponerse. En la práctica, la determinación
sangre, necesaria para prevenir pérdidas de
de la concentración de la proteína total es un
líquido del espacio vascular al intersticial: la
parámetro que sólo refleja los cambios de las
albúmina es el ejemplo más importante de este
proteínas más abundantes, como la albúmina y
grupo.
las inmunoglobulinas.
La determinación de proteína total es útil en el
Métodos para el estudio de las proteínas
diagnóstico de enfermedades del hígado, de
plasmáticas
los riñones y de la médula ósea.
El laboratorio clínico cuantifica en una muestra
de suero las concentraciones de proteína total
En clínica se puede observar hiper o
y de albúmina. A partir de estos datos, se
hipoproteinemias, pero tanto en unas como en
calcula la fracción globulina como la diferencia
otras, frecuentemente existe disminución de la
entre los dos resultados anteriores y la relación
albúmina casi nunca, aumento y generalmente
albúmina/globulina se calcula a partir de
aumento de globulinas, en alguna de sus
estos últimos. La concentración de otras
fracciones.
proteínas se determina por grupos (por
La determinación de las proteínas totales suele
ejemplo, las gamma-globulinas) o
realizarse en el suero que carece de
individualmente por métodos inmunoquímicos
fibrinógeno y de cualquier anticoagulante que
(por ejemplo algunas hormonas o marcadores
pueda diluir levemente las proteínas en el
tumorales).
plasma.
Albúmina obtenerse porque existe hiperglobulinemia,
La albúmina es la principal proteína plasmática hipoalbuminemia o ambas.
y es sintetizada y secretada por el hígado a
razón de 12 g al día. Supone alrededor de 25% Separación electroforética de las proteínas
de la producción proteica hepática total y la del suero
mitad de toda su proteína secretada. La
albúmina es una proteína globular compuesta Las técnicas de electroforesis, enfoque
por 585 aminoácidos en una sola cadena isoeléctrico y cromatografía de intercambio
polipeptídica con 50% de α-hélice y 15% de iónico son algunas de las más importantes
estructura β, posee 17 puentes disulfuro y tiene para el estudio de las proteínas basadas en su
una vida media entre 14 y 20 días. carga eléctrica.
En el adulto normal se degradan diariamente En la electroforesis, si se colocan las proteínas
12 g de albúmina que pueden proveer de en un soporte (geles poliméricos, almidón o
aminoácidos para la síntesis de otras papel) inmersas en una solución
proteínas. Además de esta función nutritiva, la amortiguadora a un pH determinado dentro de
albúmina ayuda a conservar la distribución un campo eléctrico, las proteínas se desplazan
normal de agua ya que produce cerca de 80% hacia un polo cargado. En función de la
del efecto osmótico de las proteínas relación entre el pH del amortiguador y el pI de
plasmáticas totales, debido a su alta la molécula, ésta se moverá hacia el cátodo,
concentración y bajo peso molecular. La hacia el ánodo, o permanecerá estacionaria
albúmina interviene en el equilibrio ácido- (pH=pI), por influencia del campo eléctrico
básico y se encarga también del transporte de externo.
varias sustancias como son los ácidos grasos, Cuando se realiza la electroforesis en papel o
la bilirrubina, varias hormonas e incluso acetato de celulosa a pH 8.6, que es un pH
algunos fármacos (sulfonamidas, penicilina G, significativamente superior al pI de las
aspirina, entre otras). principales proteínas plasmáticas cuyo peso
molecular oscila entre 66 000 y 700 000, las
Alteraciones en la concentración de albúmina.
proteínas están cargadas negativamente y se
La más común es la disminución en su
mueven hacia el polo eléctrico positivo. En
concentración o hipoalbuminemia. En general,
función de su velocidad de desplazamiento, las
la disminución de 1 g de albúmina sérica
proteínas del suero se separan en cinco
equivale a una pérdida de 30 g de proteína
fracciones principales: albúmina, globulina α-1,
tisular. Las principales causas de
globulina α-2, globulina β, fibrinógeno θ (para
hipoalbuminemia son las enfermedades
plasma solamente) y globulina γ (Fig. 5.1). La
renales, la desnutrición por baja ingestión de
electroforesis no separa los componentes
proteínas y la síntesis deficiente como
proteicos en sustancias químicamente puras:
consecuencia de la insuficiencia hepática,
algunas de estas fracciones representan
sobre todo en casos de cirrosis. La
decenas a cientos de proteínas individuales y
manifestación clínica más llamativa de la
diferentes que sólo tienen en común la misma
hipoalbuminemia es el edema.
velocidad de desplazamiento electroforético.
Las cifras normales de albúmina son de 4.5 Hay que tener en cuenta que la migración a
g/dl y las cifras límite entre 3.5 y 5 g/dl. La distinta velocidad en el campo eléctrico,
relación normal A/G es mayor de uno y es un obedece a la forma y carga de la molécula y
indicador importante en algunos estados menos a su tamaño o peso molecular.
patológicos. Una relación A/G baja puede Las membranas de acetato de celulosa tienen
la ventaja de ser químicamente homogéneas y
poder transparentarse, con lo que las Tabla 5.1 Algunas proteínas cuya
sustancias que se separan pueden concentración se determina en el suero
cuantificarse por densitometría, una vez NOM B RE D E L A g/L P ROP IE D A D E S Y M OTIV O PA RA LA
P ROTE ÍNA F UNC IÓN P RUE B A
teñidas. Este aparato condujo históricamente a
la separación y clasificación operacional de las A lbúmina 35-50 Transporte de D esnutrición
múltiples Hepatopatía
proteínas del plasma humano (Fig. 5.1). El sustancias Neoplasias
área de cada pico determina la concentración
Ig G 8-17 Inmunidad Inmunodeficiencias
de la proteína que posee esa movilidad
hum oral Mielom a
particular.
C3 0.5- P roteína del Obstrucción biliar
0.9 complemento Lupus eritem atoso

P roteína C <0.005 Implicada en la Infecciones agudas


reactiva respuesta
inm une

P roteína fijadora 0.2- Une y D año hepático


de vitamina D 0.55 transporta grave
vitamina D
3

Haptoglobina 0.5- Fija la Hem ólisis


3.2 hemoglobina S índrom e nefrótico

Fibronectina 0.25- P romueve la S epsis


0.4 adhesión Leucemia
celular, une P ancreatitis aguda
fibrina

Transferrina 2.3- Transporte de Hem ocrom atosis


4.3 hierro malnutrición

C eruloplasm ina 0.2- Transporte de D año hepático


La electroforesis separa las proteínas del suero 0.55 cobre grave
en patrones que pueden ser altamente S índrom e nefrótico

específicos para ciertas enfermedades como


sucede en el mieloma, el síndrome nefrótico, La tabla 5.1 describe algunas de las proteínas
la cirrosis o las quemaduras corporales cuya cuantificación es de utilidad clínica.
extensas (Fig. 5.1).
Alteraciones de las proteínas plasmáticas
Proteínas específicas Dada la gran diversidad de funciones
Las proteínas plasmáticas de interés clínico desempeñadas por las proteínas plasmáticas
pueden determinarse por procedimientos en el organismo, son también muchas las
cuantitativos específicos que proporcionan una alteraciones o disfunciones que pueden
información clinica más precisa que los aparecer.
métodos anteriores. La cuantificación se Las alteraciones pueden clasificarse en:
realiza mediante métodos como la • Alteraciones en la cantidad de proteínas
nefelometría, la turbidimetría y la totales.
inmunodifusión radial y métodos de • Alteraciones en las fracciones obtenidas tras
inmunoanálisis con reactivos marcados, como una electroforesis, disproteinemias.
el radioinmunoanálisis, el • Presencia en el plasma de alguna Ig anormal
enzimoinmunoanálisis, el fluoroinmunoanálisis y/o de alguno de sus fragmentos,
y el luminoinmunoanálisis. paraproteinemias.
• Circulación en plasma de Ig que precipitan al total en la muestra. La absorbencia se
descender la temperatura. Crioglobulinemia. determina a 540 nm con un blanco de
• Defectos aislados de alguna fracción. reactivos.

Material Preparar la siguiente serie de tubos:


• Gradilla con 6 tubos de ensayo
• 2 Pipetas de 5 ml, No. de 1. Blanco 2. Estándar 3. Suero
• Pipetas automáticas tubo problema
• Puntas para pipetas automáticas Estándar - 25 µl -
• Reactivo de Biuret para determinación de Suero - - 25 µl
proteína: tartrato de K-Na 15 mmol/l, yoduro de problema
sodio 100 mmol/l, ioduro de potasio 15 mmol/l Reactivo 1 ml 1 ml 1 ml
y sulfato de cobre 5 mmol/l. de Biuret
• Espectrofotómetro a 540 nm.
• Solución reactiva para albúmina: verde de Mezclar e incubar 15 min a temperatura
bromocresol a pH 4.2 ambiente.
• Espectrofotómetro a 630 nm. Leer frente al blanco de reactivos a 540 nm.
• Suero problema. El color es estable durante 30 min.
• Solución estándar de proteínas 7 g/dl.
• Solución estándar de albúmina 5 g/dl. Cálculo:
• Jeringa*, ligadura y torundas con alcohol.
ASuero X [Estándar g/dl] = [Proteína Total g/dl]
Precauciones. Evítese la hemólisis. La A Estándar
concentración de las proteínas del plasma se
modifica por la postura, de forma que existe un Donde A es la absorbencia.
incremento de entre un 10% y un 20% tras 30 El resultado se obtiene en g/dl.
minutos de pasar de la posición acostada a la El método es lineal hasta valores de 15 g/dl
ortostática. Además la aplicación de la ligadura (150 g/l).
para extraer la sangre puede producir un Valores esperados:
aumento significativo al cabo de unos minutos. Recién nacidos 5.2 - 9.1 g/dl
En ambos casos, la modificación se debe a un Niños (hasta 3 años) 5.4 - 8.7 g/dl
aumento del paso de líquido desde el Adultos 6.0 - 8.0 g/dl
compartimiento vascular hacia el intersticial.
Para la determinación de albúmina se requiere
de la fijación específica del verde de
Método
bromocresol a esta proteína a determinado pH
Para la determinación de proteína total se
produciéndose un cambio de coloración, de
utiliza el método de Biuret modificado, el cual
amarillo verdoso a verde azulado. El cambio en
es de gran especificidad y precisión. Los
la coloración es directamente proporcional a la
polipéptidos que contengan, por lo menos, dos
concentración de albúmina en la muestra. La
enlaces peptídicos reaccionan con las sales de
absorbencia se determina a 630 nm con un
cobre en medio alcalino para formar un quelato
blanco de reactivos.
coloreado (violeta) entre el ion Cu2+ y los
átomos de oxígeno del carbonilo y de nitrógeno
de la amida del enlace peptídico. La
concentración de este complejo es
proporcional a la concentración de proteína
Preparar la siguiente serie de tubos:

No. de 1. Blanco 2. Estándar 3. Suero


tubo problema
Estándar - 10 µl -
Suero - - 10 µl
problema
Reactivo 2 ml 2 ml 2 ml
de
albúmina

Mezclar e incubar 10 min a temperatura


ambiente.
Leer frente al blanco de reactivos a 630 nm.
El color es estable durante 60 min.

Cálculo:

ASuero X [Estándar g/dl] = [Alb’umina g/dl]


A Estándar

Donde A es la absorbencia.
El resultado se obtiene en g/dl.
El método es lineal hasta valores de 6 g/dl (60
g/l).
Los valores mayores de 6 deben diluirse 1:2
con solución salina.
Valores esperado de 3.5 a 5 g/dl (50 g/l).

REFERENCIAS
1. Peters TJ. Clin Chem. 1968; 14: 1147.
2. Murray KR, Granner DK, Mayes PA,
Rodwell VW. Bioquímica de Harper. 16a. ed.
México: Editorial El Manual Moderno; 2004.
3. González de Buitrago JM. Bioquímica
clínica. Madrid: McGraw-Hill Interamericana;
1999.
4. Laguna-Piña. Bioquímica. 4a. ed. México:
Salvat; 1990. Cap. 4.
5. Pacheco Leal D. Bioquímica médica.
México: Editorial Limusa; 2004.
Práctica 5

Cinética enzimática.
Efecto de la concentración del sustrato
sobre la velocidad de reacción enzimática
Fundamento
El método se basa en el hecho de que la
Objetivos
glucosa, en presencia del oxígeno del aire
El alumno:
y con la participación de la glucosa
1. Explicará el efecto de la concentración de oxidasa, se oxida hasta ácido glucónico.
sustrato sobre la velocidad de una reacción El peróxido de hidrógeno que se forma
enzimática. en el curso del proceso se descompone
2. Calculará por métodos gráficos la velocidad mediante la peroxidasa. El oxígeno
máxima y la constante de Michaelis de una
atómico que se desprende en esta última
reacción enzimática.
reacción se combina con un cromógeno
3. Conocerá los diferentes tipos de inhibidores
que se colorea al oxidarse. La intensidad
que existen y estudiará su efecto sobre la Km y
V máx. de la coloración del cromógeno oxidado
4. Conocerá aspectos básicos de es proporcional a la concentración de
fotocolorimetría (ver pág, 115). glucosa.
La glucosa oxidasa (ß-D-glucosa: oxígeno
Para lograr los objetivos de esta práctica
óxidorreductasa, EC1.1.2.4) tiene un peso
contestar las siguientes preguntas:
molecular de 160 000. Existe en forma
1. ¿Qué es la velocidad de una reacción dimérica y contiene dos moles de FAD
enzimática? como grupo prostético por mol de enzima.
2. ¿Cómo se define la constante de Michaelis La glucosa oxidasa es altamente
(Km) de una reacción enzimática?
específica, hecho que ha permitido su
3. ¿Cómo se define la velocidad máxima (V
empleo para el análisis cuantitativo de
máx) de una reacción?
glucosa. La reacción consiste de dos
4. ¿Para qué le sirve a un médico la
determinación de la actividad de algunas pasos:
enzimas? 1. Glucosa+glucosa oxidasa-FAD
5. ¿Cuáles son las enzimas cuya determinación δ–
tiene valor diagnóstico?
gluconolactona + glucosa oxidasa-FADH2
Hipótesis 2. Glucosa oxidasa-FADH2 + O2
Si la velocidad de una reacción enzimática es
glucosa oxidasa-FAD + H2O2
proporcional a la concentración del sustrato;
cuando la concentración del sustrato es muy La δ4-gluconolactona se hidrata
alta, por lo tanto la enzima se satura y alcanza espontáneamente dando ácido glucónico.
su velocidad máxima. La reacción global se expresa:
La enzima que sirve de modelo en esta práctica
Glucosa oxidasa
es la glucosa oxidasa acoplada a la peroxidasa.
Glucosa + O2 Acido glucónico + H2O2 Leer ambas series de tubos en el
fotocolorímetro; utilizar como blanco el
La peroxidasa cataliza la transferencia de tubo 1.
oxígeno del peróxido a un aceptor que es
cromógeno como la ortotoluidina, la
Resultados (cuadro 5.2)
ortodianisidina, la 2,2-azino-bis (3-
1. Cálculo de la concentración inicial de
etilbencentiazolin-6-sulfónico) o la 4-amino-
sustrato en cada tubo; tomar en cuenta
antipirina (y fenol) que se colorean al oxidarse.
que la solución de glucosa contiene 40
La reacción se expresa:
µmolas ml–1.
E+S ES E+P 2. La velocidad será igual a las unidades
Klett por .5 min-1 de incubación.
Material y reactivos 3. Con los datos obtenidos completar el
• 2 Gradillas con 8 tubos de ensaye cada una. cuadro 5.2 y hacer las dos gráficas en
• 1 Pipeta de 5 ml. papel milimétrico.
• 2 Pipetas de 5 ml. 4. Hacer una segunda gráfica con los
• 1 Matraz Erlemeyer de 100 ml. valores de 1/v vs 1/[S].
• Fotocolorímetro con filtro azul. 5. Calcular el valor de la velocidad
• Solución estándar de glucosa 40 mmol/l y una máxima (Vmáx) y de la constante de
dilución 1:10 de ésta para los tubos 2, 3 y 4. Michaelis (Km) con y sin inhibidor.
• 2 frascos con solución de enzimas: 41.6 Uml–1 6. Determinar el tipo de inhibidor de
de glucosa oxidasa, 4.6 Uml–1 de peroxidasa, acuerdo con las gráficas del punto
ortodianisidina 0.21 mmol/l. anterior.
• Solución de azida de sodio 400 mmol/l como 7. Analizar si los resultados obtenidos
inhibidor. están de acuerdo con la hipótesis
• Gotero con HCl. planteada.

Método I (con azida de sodio) REFERENCIAS


1. En un matraz Erlenmeyer de 100 ml 1. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto
con aplicaciones clínicas. 4a. ed.
preincubar 20 minutos la solución de enzimas
Barcelona: Editorial Reverté; 2004.
con 0.3 ml del inhibidor.
2. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios
2. Preparar la siguiente serie de tubos (tabla 1).
de bioquímica. 4a. ed. Barcelona:
3.- Considerar un intervalo de 30 segundos para
Tubo Solución de H2O Soución de
cada tubo al agregar la enzima.
No. glucosa (ml) (ml) enzimas
4.- Agitar cada tubo e incubar 5 minutos
(ml)
temperatura ambiente y de inmediato detener la
1 0.0 1.0 3
reacción agregando 3 gotas de HCl concentrado
2 dil 1:10 0.1 0.9 3
Considerar un intervalo de 30 segundos para
cada tubo al agregar el HCl. 3 dil 1:10 0.25 0.75 3
4 dil 1:10 0.5 0.5 3
5 0.1 0.9 3
6 0.25 0.75 3
Método II (sin inhibidor) 7 05. 0.5 3
1.- Preparar nuevamente una serie de tubos 8 1.0 0.0 3
como lo indica la tabla 1. Ediciones Omega; 2005.
2.- Repetir los paos 3 y 4 del Método I
3. Mathews CK, van Holde KE. Bioquímica. 3a.
ed. España: McGraw-Hill Interamericana; 2003.
4. Voet D, Voet JG, Pratt C. Fundamentals of
biochemistry. USA: John Wiley and Sons; 1999.

Cuadro 5.2 Resultados

Concentración Velocidad de Velocidad de


Tubo de sustrato la reacción la reacción
No µ molas de unidades Klett con
glucosa inicial 5 min-1 INHIBIDOR
ml-1 ORDENADAS Unidades
ABCISAS (X) (y) Klett 5 min -1
1
2
3
4
5
6
7
8
Cuadro 5.3 Resultados (inverso)

Tubo Concentración Velocidad de la Velocidad de


No. de sustrato reacción la reacción
µ molas de unidades Klett 5 con
glucosa inicial min-1 1/V INHIBIDOR
ml-1 ORDENADAS (Y) 1/V
ABCISAS (X) Unidades
Klett 5 min–1
(Y)
1
2
3
4
5
6
7
8

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