Roteiro de aulas práticas de bioquímica básica

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE
BIOQUÍMICA
ROTEIRO PARA AULAS

PRÁTICAS DE BIOQUÍMICA
BIOQUÍMICA BÁSICA
Universidade Estadual de Maringá

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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO AO LABORATÓRIO 4
1.1 RECOMENDAÇÕES GERAIS 4

1.2 ANTES DO EXPERIMENTO 4
1.3 DURANTE O EXPERIMENTO 4
1.4 DEPOIS DO EXPERIMENTO 5
1. AVALIAÇÃO DO PH DE SOLUÇÕES E SISTEMA TAMPÃO 6
2.1 PH 6
2.1.1 MEDIDA DE PH 6
2.1.2 PARTE EXPERIMENTAL 8
2.2 SISTEMAS TAMPÃO 10
3. AMINOÁCIDOS E PROTEÍNAS 12
3.1 AMINIÁCIDOS 12
3.1.1 REAÇÕES PARA AMINOÁCIDOS (REAÇÃO DA NINHIDRINA) 13
3.1.2 CURVA DE TITULAÇÃO DE AMINOÁCIDOS 14
3.1.3 CROMATOGRAFIA DE AMINOÁCIDOS 17
3.2 PROTEÍNAS 20
3.2.1 REAÇÃO DO BIURETO 20
3.2.2 FOTOMETRIA E ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO 22
3.2.2 REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS 30
3.2.3 EXTRAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E DOSAGEM DA CASEÍNA NO LEITE 35
4. ENZIMAS 40
4.1 CINÉTICA DAS REAÇÕES ENZIMÁTICAS 40

4.2 EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA UREASE DA SOJA 44
4.3 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO AMIDO 48
5. VITAMINAS 50
5.1 PARTE EXPERIMENTAL 53
6. CARBOIDRATOS 55
6.1 REAÇÕES QUALITATIVAS PARA CARACTERIZAÇÃO DE CARBOIDRATOS 56

6.1.1 REAÇÃO DE MOLISCH 56
6.1.2 REAÇÃO DE SELIWANOFF 57
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6.1.3 REAÇÃO DE BIAL 57

6.1.4 REAÇÃO COM O IODO 58
6.1.5 REAÇÃO DE FEHLING 60
6.1.6 REAÇÃO DE BARFOED 61
6.1.7 MARCHA ANALÍTICA PARA A IDENTIFICAÇÃO DE CARBOIDRATOS 62
6.2 HIDRÓLISE ÁCIDA DO AMIDO 64
6.3 DIÁLISE 66
7. LIPÍDEOS 69
7.1 ÍNDICE DE SAPONIFICAÇÃO 70

7.2 ÍNDICE DE IODO 72
8. METABOLISMO 74
8.1 CONSUMO DE GLICOSE EM LEVEDURAS - AÇÃO DO FLUORETO 77

8.1.2 ACOMPANHAMENTO DO CONSUMO DE GLICOSE 79
8.2 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA SUCCINATO DESIDROGENASE NO TECIDO HEPÁTICO 81
8.3 REAÇÃO DE HILL – FOTÓLISE DA ÁGUA 84
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 88
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1. INTRODUÇÃO AO LABORATÓRIO
O laboratório é um lugar específico para a realização de experimentos, e para isso, possui
instalações de água, luz e gás, que tornam possível a realização destes experimentos. Possui ainda um
local específico para a manipulação das substâncias tóxicas, denominado capela, que dispõe de um
sistema próprio de exaustão de gases.
Neste local há um grande número de substâncias que possuem os mais variados níveis de
toxicidade e periculosidade. É um local bastante vulnerável a acidentes, caso não trabalhe com as
devidas precauções.
As regras gerais de segurança em laboratório servem para minimizar riscos de acidentes, para
tal, é necessário que todos os usuários as conheçam, e pratiquem, desde o primeiro instante em que
entrarem em um laboratório. As regras são simples e fáceis de memorizar e seguir.
1.1 Recomendações Gerais
1. Tendo qualquer dúvida solicite aos professores os devidos esclarecimentos.

2. Compareça às aulas nos dias e nos laboratórios designados para sua turma.
3. Lembre-se que o laboratório é um lugar para trabalhos sérios e não para experimentos
ao acaso; portanto, evite brincadeiras que dispersem a sua atenção e a de seus colegas.
4. No fundo do laboratório existem armários. Neles devem ser colocados as bolsas e os
demais pertences. Utilizar nas bancadas apenas os roteiros das aulas, borrachas,
canetas e lápis.
5. Vestimenta:
Recomendada Não recomendada
Avental longo (até o joelho) Bermuda ou short
Calça comprida Calçado aberto (sandália ou chinelo)
Sapato fechado Uso de lente de contato
Cabelo comprido preso Cabelo comprido solto
6. Não é permitido:
 Fumar, comer e beber.
 Sentar no chão, sentar ou debruçar na bancada.
7. Quando houver quebra ou danos nos materiais ou aparelhos, comunique aos
professores.
8. Certifique-se da localização dos itens de emergência, principalmente chuveiros de
emergência, pias, extintores de incêndio.
1.2 Antes do Experimento
1. Leia as práticas com antecedência para obter melhor aproveitamento das aulas.
2. Use, obrigatoriamente, o avental (jaleco, guarda-pó).
1.3 Durante o Experimento
1. Não troque os reagentes de uma bancada para outra.

2. Leia duas vezes o rótulos dos frascos de reativos, antes de utilizá-los. Nunca utilize um
reagente que não esteja identificado ou rotulado.
3. Não manuseie sólidos e líquidos desconhecidos apenas por curiosidade.
4. Identifique imediatamente qualquer reagente ou solução preparada durante a aula.
5. Para evitar contaminação das soluções:
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- Antes de introduzir pipetas nas soluções, certifique-se de que estão limpas.

- Use sempre uma pipeta para cada reagente.
- Não troque as tampas dos frascos dos reagentes.
- Não use a mesma vidraria para medir substâncias ou soluções diferentes.
- Antes de introduzir pipetas nas soluções, certifique-se de que estão limpas.
- Use sempre uma pipeta para cada reagente.
- Não troque as tampas dos frascos dos reagentes.
- Não use a mesma vidraria para medir substâncias ou soluções diferentes.
6. Nunca teste amostras ou reagentes pelo sabor. Não leve à boca qualquer reagente,
nem mesmo o mais diluído.
7. Não leve a mão à boca ou aos olhos enquanto estiver manuseando produtos químicos
ou biológicos.
8. Reagentes voláteis ou tóxicos devem ser manuseados na capela.
9. Nunca deixe ou abra frascos de líquido inflamáveis (éter, álcool, acetona, benzeno,
etc.), nas proximidades de chamas.
10. Quando pipetar, ácido concentrado ou soluções alcalinas concentradas lavar
imediatamente com água o material utilizado.
11. Não pipetar soluções ou amostras com a boca, use pipetador ou pera de sucção.
1.4 Depois do Experimento
- Descartar os reagentes conforme recomendado em cada aula.

- Passe água de torneira nos tubos e outros materiais utilizados e coloque-os na bacia azul
que está na pia.
- As pipetas usadas devem ser colocadas na bacia amarela.
- Organizar as bancadas e as cadeiras antes de sair.
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1. AVALIAÇÃO DO pH DE SOLUÇÕES E SISTEMA TAMPÃO
2.1 pH
O pH é símbolo para uma medida físico-química potencial hidrogeniônico ou potencial de

hidrogénio, que indica a acidez, neutralidade ou alcalinidade de uma solução aquosa. Ele é uma
característica específica das substâncias, e é determinado pela concentração de íons de Hidrogênio (H+).
Os valores variam de 0 a 14, sendo que valores de 0 a 7 são considerados ácidos, valores em torno de 7
são neutros e valores acima de 7 são denominados básicos ou alcalinos. Quanto menor o pH de uma
substância, maior a concentração de íons H+ e menor a concentração de íons OH- . Valores abaixo de 0 e
acima de 14 são possíveis, porém muito raros e não podem ser medidos com as sondas normais.
Estes valores de pH das substâncias, variam de acordo com sua composição, concentração de
sais, metais, ácidos, bases e substâncias orgânicas, sofrem também influência da temperatura.
Matematicamente, o “p” equivale ao simétrico do logaritmo (cologaritmo) de base 10 da
atividade dos íons a que se refere. Para íons H+:
pH = -log10 [aH+]
Sendo que aH+ representa a atividade em mol/L, em soluções diluídas (abaixo de 0,1 mol/L), os
valores da atividade se aproximam dos valores da concentração, permitindo que a equação anterior
seja escrito como abaixo:
pH = -log10 [H+]
2.1.1 Medida de pH
Existem algumas técnicas e equipamentos, que nos permitem determinar qual o valor de pH de
uma substância. Para isso podemos usar medidores de pH (também conhecido como pHmetros), como
também técnicas bem simples como a adição de indicadores de pH às soluções.
2.1.1.1 Indicadores de pH
São compostos químicos que mudam de cor em soluções com diferentes concentrações de
prótons (diferentes pHs) (Tab. 2.1). Estas moléculas podem receber e doar prótons, alterando ou não,
sua cor de origem.
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Tabela 2.1 Alguns indicadores de pH

Cor em pH Faixa de pH de Cor em pH básico
Indicador
ácido transição
Violeta genciana (Metil violeta) Amarelo 0,0-2,0 Azul-Violeta
Verde de Leucomalaquita Azul de Timol
Amarelo 0,0-2,0 Verde
(primeira transição)
Verde de Leucomalaquita Azul de Timol
Verde 11,6-14 Incolor
(segunda transição)
Azul de Timol (primeira transição) Vermelho 1,2-2,8 Amarelo
Azul de Timol (segunda transição) Amarelo 8,0-9,6 Azul
Amarelo de metila Vermelho 2,9-4,0 Amarelo
Azul de Bromofenol Amarelo 3,0-4,6 Púrpura
Vermelho Congo Azul-Violeta 3,0-5,0 Vermelho
Laranja de Metila Vermelho 3,1-4,4 Amarelo
Verde de Bromocresol Amarelo 3,8-5,4 Azul-Verde
Vermelho de Metila Vermelho 4,4-6,2 Amarelo
Púrpura de Bromocresol Amarelo 5,2-6,8 Púrpura
Azul de Bromotimol Amarelo 6,0-7,6 Azul
Vermelho de fenol Amarelo 6,8-8,4 Púrpura
Vermelho Neutro Vermelho 6,8-8,0 Amarelo
Vermelho de Cresol Amarelo 7,2-8,8 Vermelho-Púrpura
Fenolfaleína Incolor 8,2-10,0 Rosa
2.1.1.2 Papel Indicador
Consiste em um papel impregnado com uma mistura de indicadores de pH. Quando submerso
em uma solução, adota uma cor que vai variar conforme a concentração de prótons (do pH) existente
na solução.
2.1.1.3 Medidor de pH (pHmetro)
O pHmetro é um aparelho usado para medição de pH, constituído basicamente por um

eletrodo e um circuito potenciômetro. Este aparelho é calibrado (ajustado) de acordo com os valores
referenciado em cada soluções de calibração. Para que se conclua o ajuste é então calibrado em dois ou
mais pontos. Normalmente utiliza-se tampões de pH 7 e 4 e depois de calibrado está pronto para uso. A
leitura do aparelho é feita em função da leitura da tensão (usualmente em milivolts) que o eletrodo
gera quando submerso na amostra. A intensidade da tensão medida é convertida para uma escala de
pH. O aparelho faz essa conversão, tendo como uma escala usual de 0 a 14 pH. Seu uso é comum em
qualquer setor da ciência que trabalhe com soluções aquosas. É utilizado na agricultura, tratamento e
purificação da água, fabricação de papel, indústria petroquímica, na produção e desenvolvimento de
medicamentos, fabricação de alimentos, entre outros.
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Cavidade de
preenchimento
Haste de prata recoberta com

cloreto de prata Ag/AgCl
Eletrólito
Elemento de referência
Junção
Elemento sensor de pH
Figura 1.1 Medidor de pH (pHmetro). Figura 1.2 Ilustração esquemática de um eletrodo de

vidro do medidor de pH.
O bulbo do eletrodo (figura 1.2) é feito com um vidro muito fino, e sua superfície é protonada
em ambos os lados. A carga de prótons é responsável pela diferença de potencial, descrita pela
equação de Nerst, e é diretamente proporcional à diferença de pH entre as soluções de dentro e fora
do vidro. O potencial medido é uma soma de todos os três potenciais.
E = Evidro + EAg/AgCl + Eref
Cada potencial é calculado pela Equação de Nerst:
𝑅𝑇
𝐸 = 𝐸0 − 𝑛𝐹 . 𝑙𝑛(𝑄), onde:
R = Constante universal dos gases

T = Temperatura
F = Faraday
n = número de elétrons
Q = Constante de equilíbrio
2.1.2 Parte Experimental
Reagentes
Vinagre Caseiro (ácido acético).

Bicarbonato de sódio caseiro.
Papel indicador de pH.
Solução de fenolftaleína a 1% em álcool etílico.
Solução de vermelho de fenol: 0,4 g/L de vermelho de fenol em NaOH 0,004 M.
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Técnica
Usar 3 béqueres de 100 mL. No Primeiro colocar 50 mL de água destilada, no segundo colocar
os mesmo 50 mL de água destilada e adicionar gotas de vinagre. No terceiro também com 50 mL de
água, adicionar uma pitada de bicarbonato de sódio.
Avaliar o pH dos três béqueres usando o papel indicador e o medidor de pH (pHmetro) e anotar
os valores.
Béquer 1 Béquer 2 Béquer 3
Em seguida remova duas alíquotas de 5 mL de cada béquer e transfira para dois tubos. Em um
dos tubos adicione 3 gotas e fenolftaleína e no outro 3 gotas de vermelho de fenol. Observe o
resultado.
Perguntas:
1. Por que o pH da água pura ficou ácido com a adição do vinagre?

2. Por que o pH da água pura ficou alcalino com a adição de bicarbonato de sódio?
3. Por que o indicador de pH fenolftaleína ficou rosa na solução de bicarbonato de sódio e incolor
na solução de vinagre?
4. Por que o indicador vermelho de fenol ficou rosa da solução de bicarbonato de sódio e amarelo
na solução de vinagre?
5. Qual é o princípio químico da mudança de cor de um indicador de pH?
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2.2 SISTEMAS TAMPÃO
Os sistemas tampão são formados pela mistura de ácidos fracos e suas bases conjugadas,
formando soluções com a propriedade de resistir às variações de pH quando nelas são adicionados
ácido (H+) ou base (OH-). Estas soluções são chamadas de soluções tampão. Elas são constituídas
geralmente por sistemas de doadores e receptores de prótons, em solução aquosa. Estes sistemas são
essenciais na manutenção da estabilidade dos fluidos corporais, pois as reações bioquímicas em plantas
ou animais são sensíveis a variações de pH. Entretanto, estas variações não ocorrem em organismos
sadios, porque seus fluídos internos são bem tamponados. Grandes variações na alimentação e na
maneira de viver e também as doenças em geral, produzem mudanças internas consideráveis no nosso
corpo, porém, alteram quase nada o pH do sangue humano, isto porque ele é tamponado por uma série
destes sistemas.
Íons H+ e OH- adicionados a uma solução tamponada:
H+(aq) + X-(aq) HX(aq)
OH-(aq) + HX(aq) H2O(l)+ X-(aq)
As quantidades de HX e X- no tampão são grandes comparadas com a quantidades de H+ e OH-

adicionadas, por isso a razão [HX]/[X-] não varia muito, tornando a variação no pH pequena.
Reagentes
Tampão fosfato 0,1 M (pH 7,0)

Tampão fosfato 0,0001 M (pH 7,0)
NaOH 0,5M
HCl 0,5M
Técnica
Usar 3 béqueres de 100 mL. No primeiro adicionar 5 mL de água destilada, no segundo 50 mL

de tampão fosfato 0,1M pH 7,0 e no terceiro 50 mL de tampão fosfato 0,0001M (pH 7,0). Avaliar o pH
das três soluções no pHmetro, em seguida adicionar gotas de HCl 0,5M a cada um dos bequers. Avaliar
o resultado. Depois adicionar gotas de NaOH nos mesmos béqueres. Observar.
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Perguntas:
1. Por que o pH da água pura não é mantido com a adição de um ácido ou de uma base?
2. Qual é o princípio químico da manutenção do pH de uma solução aquosa por um tampão?
3. Por que o tampão fosfato 0,1M foi mais eficiente na manutenção do pH da solução aquosa
do que o tampão fosfato 0,0001M?
4. Qual é o efeito do pKa do ácido fraco no par ácido-base conjugado na ação de um tampão?
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3. AMINOÁCIDOS E PROTEÍNAS
As proteínas são as biomoléculas mais abundantes nos seres vivos e exercem funções
fundamentais em todos os processos biológicos. São polímeros formados por unidades monoméricas
chamadas α-aminoácidos, unidos entre si por ligações peptídicas. As proteínas são constituídas de 20
aminoácidos-padrão diferentes reunidos em combinações praticamente infinitas, possibilitando a
formação de milhões de estruturas diversas.
3.1 AMINIÁCIDOS
Os α-aminoácidos possuem um átomo de carbono central (α) onde estão ligados

covalentemente um grupo amino primário (-NH2), um grupo carboxílico (-COOH), um átomo de
hidrogênio e uma cadeia lateral (R) diferente para cada aminoácidos (figura 3.1).
Os α-aminoácidos com um único grupo amino e um único grupo carboxila, ocorrem em pH
neutro na forma de íons dipolares (“zwitterions”) eletricamente neutros. O grupo α-amino está
protonado (íon amônio, -NH3+) e o grupo α-carboxílico está dissociado (íon carboxilato, COO-).
Figura 3.1 Estrutura de um α-aminoácido na forma de íon dipolar (“zwitterions”).
As proteínas são polímeros de aminoácidos unidos por ligações, denominadas ligações

peptídicas que são a união do grupo amino (-NH2) de um aminoácido com o grupo carboxila (-COOH) de
outro aminoácido, através da formação de uma amida. Nesta reação acontece a liberação de água.
Figura 3.2 Reação geral da formação de uma ligação peptídica

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3.1.1 Reações para aminoácidos (Reação da Ninhidrina)
As reações orgânicas características dos aminoácidos são aquelas de seus grupamentos

funcionais, isto é, os grupos carboxílicos, os grupos amino, e os grupos funcionais presentes nas
diversas cadeias laterais. Essas reações permitem, por exemplo, a identificação de aminoácidos não
hidrolisados proteicos, identificação da sequencia de aminoácidos de uma proteína, identificação de
aminoácidos essenciais para a atividade de uma enzima.
Uma reação bastante utilizada para verificar a presença de aminoácidos em pequenas amostras
é a Reação da Ninhidrina, devido à sua elevada sensibilidade.
Princípio da reação da ninhidrina: esta reação se mostra positiva para grupos -amino de
aminoácidos livres, grupos amino-terminais de peptídeos e proteínas, e grupo -amino da lisina
presentes em proteínas. A amônia e o sulfato de amônio, este último um reagente muito empregado na
purificação de proteínas, também desenvolvem cor com a ninhidrina, porém, sem a liberação de CO 2
(Figura 3.3).
A ninhidrina, um forte agente oxidante, ocasiona a oxidação descarboxilativa dos aminoácidos.
A amônia e a hidridantina assim formados reagem com uma segunda molécula de ninhidrina para
produzir um composto de cor violácea, chamado de púrpura de Rühemann , quando o aminoácido
apresenta grupo amino livre. Com a prolina e hidroxiprolina, que são iminoácidos, forma-se um produto
de cor amarela. A reação é realizada a quente e seu mecanismo pode ser representado da seguinte
forma:
Figura 3.3 Reação da Ninhidrina.
3.1.1.1 Parte Experimental
Reagentes
Solução de ninhidrina a 0,2 g% em tampão fosfato 0,01 M, pH 7,0.
Soluções de aminoácidos 0,001 M (alanina, ácido aspártico, arginina, leucina e prolina).
Técnica
Em 5 tubos de ensaio, adicionar 1 mL de cada um dos aminoácidos e 1 mL da solução de
ninhidrina. Aquecer os tubos em banho-maria fervente, até o aparecimento de cor bem intensa.
Comparar as cores obtidas nos diferentes tubos e concluir os resultados.
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3.1.2 Curva de titulação de aminoácidos
Em termos gerais, a titulação é usada para determinar a quantidade de uma substância, que
pode ser um ácido. Neste caso, um volume definido de ácido é titulado com uma solução de base,
usualmente hidróxido de sódio, de concentração precisamente conhecida. O hidróxido de sódio é
adicionado em pequenos incrementos até que o ácido seja exatamente neutralizado, o que é
determinado por um indicador ou potenciômetro. A partir do volume de hidróxido de sódio adicionado
e da sua concentração, a quantidade de ácido na solução titulada, e então a sua concentração, pode ser
calculada. Um diagrama do pH da solução versus a quantidade de hidróxido de sódio adicionada é
chamado de curva de titulação.
Este procedimento pode ser adotado para os aminoácidos, que podem agir como ácidos e como
bases. Por exemplo, quando o aminoácido alanina é dissolvido em água, ele pode agir como um doador
de prótons (ácido) ou como um aceptor de prótons (base). Assim, alanina é, na realidade, um ácido
diprótico quando está totalmente protonado, isto é, quando seu grupo carboxila e seu grupo amino já
receberam prótons. Nesta forma, ele tem dois grupos que podem ionizar-se e liberar prótons.
(Forma A) (Forma B) (Forma C)
A curva de titulação do aminoácido alanina (Figura 8) tem dois estágios distintos, cada um
correspondendo a remoção de um próton. No início da titulação, a forma predominante é a A,
totalmente protonada. Na metade do primeiro estágio, quantidades eqüimolares de espécies doadora
de prótons (forma A) e aceptora de prótons (forma B) estão presentes. Na metade da titulação, a forma
B é a predominante. Esta é a forma dipolar isoelétrica. Neste ponto, completa-se a remoção do
primeiro próton e inicia-se a remoção do segundo próton. Na metade do segundo estágio, estão
presentes quantidades eqüimolares das formas B e C. No final da titulação, a forma predominante é a
C. Os valores de pK' da ionização em duas etapas, de alanina, são suficientemente afastados para
permitir a observação de duas fases claramente distintas. Como se observa, cada parte da curva tem
um ponto central, onde existe alteração mínima no pH em presença de incrementos de -OH
progressivos. Os valores aparentes de pK' para as duas etapas de dissociação podem ser determinados
a partir dos pontos centrais de cada estágio; eles são pK'1 = 2,34 e pK'2 = 9,69. Cada uma das partes da
curva pode ser expressa matematicamente pela equação de Henderson-Hasselbach:
[aceptor de próton]
pH=pK' +log
[doador de próton]
Desta maneira, pode-se calcular as relações entre as espécies iônicas de um aminoácido em

qualquer pH, desde que se conheça os valores de pK'1 e de pK'2. Em pH = 6,02, existe um ponto de
inflexão entre as duas partes separadas da curva de titulação de alanina. Não existe carga elétrica
efetiva na molécula nesse pH. Esse é o ponto isolétrico (pHI), que é, no caso da titulação da alanina, a
média aritmética do pK'1 e o pK'2. Assim, da curva de titulação de um aminoácido pode-se extrair
importantes informações tais como: uma medida quantitativa do pK' de cada um dos grupos ionizáveis;
verificar as regiões onde o aminoácido exerce força tamponante; e, ainda, a relação entre a carga
elétrica do aminoácido e o pH da solução.
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Figura 3.4 Curva de titulação de alanina 0,1 N.
3.1.2.1 Parte experimental
Pipetar 25 mL da solução de alanina 0,05 M, em um béquer de 50 mL. Padronizar o pHmetro e

determinar o pH da solução de alanina 0,05 M. Anotar o valor.
Adicionar 50 l de ácido clorídrico 0,5 M e determinar o valor do pH. Repetir esta operação por
mais 3 vezes. A seguir, adicionar 100 l de ácido e determinar o valor do pH. Repetir esta operação até
atingir-se o volume final de 2,5 mL de ácido clorídrico 0,5 M.
Anotar os valores de pH, após cada adição do ácido.
Após o encerramento desta etapa, lavar muito bem o eletrodo com água destilada.
Repetir todo o procedimento descrito acima com hidróxido de sódio 0,5 M.
Traçar um gráfico de pH da solução versus números de mols de ácido clorídrico ou hidróxido de
sódio adicionados. Através desta curva de titulação, determinar os valores de pK' dos grupos -COOH e
+NH3 e ainda o pH isoelétrico do aminoácido alanina.
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Volume (µL) HCl 0,5 M (pH) NaOH 0,5M (pH) Nº de mols

50
50
50
50
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
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3.1.3 CROMATOGRAFIA DE AMINOÁCIDOS
Na atualidade, utiliza-se o termo cromatografia para descrever qualquer método de separação

que envolva a percolação de uma mistura de substâncias dissolvidas em um meio usado como suporte,
sólido e poroso, independentemente das forças que levam à separação da mistura.
Nos trabalhos de bioquímica, a cromatografia permite: separar e identificar uma mistura de
aminoácidos produzidos por hidrólise de proteínas; separar e identificar uma mistura de carboidratos
produzidos pela hidrólise ácida de polissacarídeos e separar e identificar ácidos graxos, esteroides, etc.
A cromatografia juntamente com outras técnicas instrumentais de análise, como por exemplo,
a espectrofotometria ou a espectrometria de massa pode facilitar na identificação e quantificação de
espécies químicas. A cromatografia é um método físico-químico de separação dos componentes de
uma mistura, realizada através da distribuição destes compostos entre duas fases, que estão em
contato íntimo. Uma das fases permanece estacionária enquanto a outra se move através dela. Durante
a passagem da fase móvel sobre a fase estacionária, os componentes da mistura são distribuídos entre
as duas fases, de tal forma que cada um dos componentes é seletivamente retido pela fase
estacionária, resultando em migrações diferenciais destes componentes.
Classificação de cromatografia
Os critérios mais comuns para classificação das diferentes modalidades são:

a) técnica empregada
b) diferentes tipos de fases utilizadas
c) mecanismo de separação envolvido
Considera-se que a classificação mais importante em cromatografia se baseia no mecanismo de
separação, que pode ser por processos físicos, químicos ou mecânicos.
A cromatografia de adsorção é considerada um processo físico, já a cromatografia de troca
iônica é um processo químico e a cromatografia por exclusão ou filtração em gel um processo
puramente mecânico.
Cromatografia de adsorção
Este é o tipo de cromatografia onde a fase estacionária é sólida e a fase móvel é líquida. A
cromatografia de adsorção em carvão ativado, alumina e sílica gel tem ampla aplicação, sendo utilizada
na separação de muitos tipos de compostos. A separação depende da adsorção diferencial de
compostos à superfície de adsorventes específicos, através de determinadas forças, como interações
dipolares, pontes de hidrogênio e interações hidrofóbicas. Neste caso os compostos são retidos por
adsorção.
A cromatografia em camada delgada (TLC - Thin Layer Chromatography) consta de placas de
vidro ou alumínio onde o adsorvente (geralmente alumina ou sílica gel) é espalhado em uma camada
fina e lisa sobre as placas. Atualmente, existem vários aparelhos para espalhar o adsorvente. Este tipo
de cromatografia é muito importante por apresentar, em comparação a cromatografia de papel: maior
rapidez; melhor separação das zonas; possibilidade do uso de reagentes mais fortes como os ácidos;
menor quantidade de material a ser cromatografado e ausência de caudas no cromatograma.
A sílica gel (dióxido de silício) é uma substância porosa e amorfa, apresentando, portanto,
propriedades importantes para uma cromatografia de adsorção como uma combinação de um
esqueleto sólido com um sistema de cavidades. Ela é fornecida comercialmente sob forma de grânulos
de 5 a 25  de diâmetro e contendo cerca de 13% de CaSO4 como material ligante.
Na preparação da placa, uma parte em peso de sílica gel G é dissolvida em dois volumes de
água. A seguir, espalha-se a sílica, com auxílio de aparelho apropriado, sobre as placas de vidro que
devem estar limpas e desengorduradas. É importante ressaltar que na preparação da suspensão de
sílica gel com água o sistema de cavidades da sílica gel fica preenchido com água. Esta água deve ser
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retirada antes de se iniciar uma cromatografia. Este processo, chamado de ativação, consiste no
aquecimento, por 30 minutos a 110°C, das placas preparadas. Este procedimento deve ser feito antes
do uso das placas.
Cromatografia de partição
Neste tipo de cromatografia, tanto a fase estacionária como a móvel são líquidas. Este tipo de
cromatografia foi desenvolvido, partindo do pressuposto que, se a fase estacionária de dois solventes
não miscíveis pudesse ser imobilizada num suporte sólido e inerte, numa coluna cilíndrica, e a fase
móvel, em equilíbrio com a fase estacionária, passasse através da coluna, seria possível separar uma
mistura de substâncias dissolvidas nos solventes, à medida que a fase móvel fosse fluindo, através da
coluna.
A cromatografia de papel provou ser a mais eficaz de todas as técnicas analíticas, uma vez que
as folhas de papel de filtro são excelentes suportes. O papel é constituído por um agregado de fibras de
celulose. Estas fibras estão dispostas em forma aproximadamente paralela e fortemente ligadas entre
si, em algumas regiões, através de pontes de hidrogênio. Isto gera, na estrutura do papel, regiões
cristalinas e regiões de estruturas parcialmente amorfas. Nas regiões amorfas, a água ou outros
solventes hidrofílicos são adsorvidos pela celulose, o que conduz a formação de pools de líquido. A
água, nesta região, pode ser de dois tipos: uma quimicamente ligada às fibras de celulose e a outra
ligada mais frouxamente. Esta última é utilizada para particionar os solutos no cromatograma.
A importância deste tipo de cromatografia pode ser comprovada na separação de aminoácidos.
Neste caso, emprega-se uma tira de papel de filtro, na qual se coloca uma pequena quantidade da
mistura perto do topo. A tira de papel é então saturada com a fase estacionária aquosa e pendurada
num recipiente, contendo a fase móvel; todo o conjunto é fechado numa câmara saturada com vapores
das fases estacionárias e móvel. A fase móvel é extraída do recipiente por capilaridade e flui pela tira de
papel. Os compostos individuais descem pelo papel em velocidade que dependem de seus coeficientes
de partição nas duas fases. A ordem de migração dos compostos pelo papel difere com diferentes
solventes. Este método é conhecido como cromatografia em papel descendente. De modo alternativo,
a cromatografia em papel ascendente é igualmente eficaz em uma ou duas dimensões. Para obter-se a
separação de uma mistura muito complexa, recorre-se à cromatografia bidimensional, inicialmente com
um solvente e, a seguir, com um segundo solvente que corre perpendicularmente ao primeiro.
Uma outra variação da cromatografia de partição é a cromatografia líquida de alta resolução
(HPLC, high performance liquid chromatography). Este tipo de cromatografia emprega pressões muito
elevadas para impelir o solvente, através de uma delgada coluna. A técnica tem uma capacidade de
resolução muito alta, sendo aplicada tanto para a análise quanto para a separação de misturas
complexas.
Finalmente, outro método de partição, denominado de cromatografia de gás-líquido (GLC), é
particularmente apropriado para a separação de substâncias voláteis. Neste caso, utiliza-se um
aparelho especial conhecido como cromatógrafo a gás. Uma coluna de vidro ou de metal, de 1 a 2
metros de comprimento por 0,2 a 2 cm de diâmetro, é preenchida com um sólido inerte finamente
dividido e impregnado com um líquido não-volátil. Uma mistura de compostos é volatilizada numa
extremidade da coluna, que é mantida em temperatura elevada (170 a 225°C). Os compostos
volatilizados são arrastados pela coluna por uma corrente de gás inerte (por exemplo, nitrogênio),
fluindo numa velocidade constante. Cada componente da mistura se desloca na coluna numa
velocidade diferente, determinada pelo seu coeficiente de partição entre a fase gasosa (móvel) e a fase
líquida não-volátil (estacionária). Os compostos individuais no gás que emerge da coluna são
detectados por meios físicos ou químicos. Esta técnica permite a resolução quantitativa e a análise de
quantidades de substâncias voláteis da ordem de nanogramas.
P á g i n a | 19
Cromatografia de troca iônica
Nesta técnica, a fase estacionária é uma resina sintética ou outro composto de peso molecular
elevado, contendo grandes quantidades de um determinado grupo iônico (+NH3; -COO-; -SO3- etc).
Utilizam-se vários tipos de materiais de troca iônica (trocadores de íons), incluindo resinas sintéticas,
celulose, dextran e agaroses, nos quais se introduzem grupos com cargas negativas ou positivas. Os
permutadores de carga negativa que fixam cátions são denominados permutadores catiônicos,
enquanto que os de carga positiva são conhecidos como permutadores aniônicos. Estes materiais são
conhecidos por seus nomes comerciais (Amberlite, Permulite, DEAE-Celulose e Sephadex).
Os componentes da mistura a ser separada (cromatografada), ao passarem pela coluna, vão
sendo retidos, conforme a natureza de sua carga (+ ou -), pelos grupos ( -COO- ou -SO3- etc) existentes
na coluna. A fase móvel (eluente) será uma solução iônica escolhida de acordo com o tipo de fase
estacionária e da substância a separar.
Material
Papel cromatográfico
Tubos capilares
Câmara cromatográfica
Amostra: solução de aminoácidos ou hidrolisado de proteínas
Soluções padrão de aminoácidos 0,1 M
Solvente: n-butanol:ácido acético:água (12:3:5)
Revelador: solução de ninhidrina 0,1g% em acetona.
Técnica
Cortar o papel cromatográfico em tamanho de 20 x 24 cm. Traçar com lápis uma linha de 2 cm
da borda inferior. Marcar sobre a linha traçada pontos para a aplicação das amostras e dos padrões,
conservando entre eles a distância de 2 cm.
Aplicar as soluções de aminoácidos com tubos capilares. A mancha não deve exceder 5 mm de
diâmetro. Secar.
Com o auxílio de agulha e fio, dar a forma de um cilindro ao papel.
Mergulhar o cilindro em uma cuba contendo o solvente, tomando o cuidado para que a altura
do solvente não alcance a linha de aplicação das manchas. Deixar que o solvente se desenvolva até 1
cm da extremidade superior do papel e marcar a linha de frente do solvente com um lápis. Retirar o
cromatograma, evitando o contato dos dedos na porção do papel que contém as amostras e os
padrões. Deixar secar a temperatura ambiente. Revelar com solução de ninhidrina 0,1% em acetona.
Secar em estufa a 100°C por alguns minutos.
Identificar os aminoácidos da amostra por comparação com os padrões. Após a identificação
dos aminoácidos medir a relação de frente (ratio front) de cada um deles.
Em cromatografia de papel e em camada delgada, usa-se como referência a Relação de frente
(Rf).
Distância percorrida por uma substância

Rf =
Distância percorrida pelo solvente
O Rf é característico para cada substância, quando as condições forem estabelecidas, sendo

utilizado para identificar os componentes de uma amostra.
P á g i n a | 20
3.2 PROTEÍNAS
Como já sabemos, as proteínas são polímeros formados por unidades monoméricas chamadas
α-aminoácidos, e possuem vários grupos funcionais. Elas podem interagir entre si ou com outras
macromoléculas para formar associações bastante complexas.
Sendo elas componentes essenciais à matéria viva, podem atuar como:
- catalizadores (enzimas);
- transportadores (oxigênio, vitaminas, fármacos, lipídeos, ferro, cobre, etc.);
- armazenamento (caseína do leite);
- proteção imune (anticorpos);
- reguladores (insulina, glucagon);
- movimento (actina e miosina);
- estruturais (colágeno);
- transmissão de impulsos nervosos (neurotransmissores);
- controle do crescimento e diferenciação celular (fatores de crescimento).
As proteínas também possuem importantes funções fisiológicas, como a responsabilidade de
manter a distribuição de água entre o compartimento intersticial e o sistema vascular do organismo;
formação de tampões para a manutenção do pH, etc.
3.2.1 REAÇÃO DO BIURETO
Na literatura, podem ser encontrados vários métodos para detecção, identificação e

quantificação de proteínas. Eles são baseados em alguma característica da molécula de proteína, tal
como a presença das ligações peptídicas, a presença de aminoácidos aromáticos ou de grupos R
fenólicos.
Uma reação bastante utilizada para verificar a presença de proteínas é a Reação do Biureto.
Figura 3.5 Fórmula estrutural do biureto.
Princípio da Reação do Biureto: em meio alcalino, os íon de Cu2+ do Reagente de Biureto

interagem com átomos de nitrogênio das ligações peptídicas das proteínas, formando um complexo de
com violeta.
Para a formação do complexo são necessárias quatro ligações peptídicas para cada íon Cu2+,
conforme ilustrado na figura 3.6.
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Figura 3.6 Complexo formado pelo tratamento de proteínas ou peptídeos com sulfato de cobre alcalino.
A Reação do Biureto pode ser empregada também para determinar a concentração de

proteínas em uma amostra, pois a intensidade da cor é diretamente proporcional à concentração de
proteínas.
Reagentes
Hidróxido de sódio 2,5 M
Sulfato de cobre 1%
Solução de albumina 0,5%
Solução de alanina 0,001 M
Técnica
Pipetar, em um tubo de ensaio, 2 mL de uma solução de albumina 0,5%, adicionando 3 gotas de

sulfato de cobre 1% e 5 gotas de hidróxido de sódio 2,5 M. Observar a formação de coloração violeta
característica de reação positiva.
Em um segundo tubo de ensaio, colocar 2mL de água destilada, 3 gotas de sulfato de cobre 1%
e 5 gotas de hidróxido de sódio 2,5 M. Observar o aparecimento de cor azul devido à alcalinização. Esta
coloração não deve ser confundida com a reação positiva do biureto, observada no tubo anterior que
contém proteínas.
Em um terceiro tubo de ensaio, adicionar 2 mL de solução de alanina 0,001M, 3 gotas de sulfato
de cobre 1% e 5 gotas de hidróxido de sódio 2,5 M.
O que você concluiu com esta reação?
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3.2.2 FOTOMETRIA E ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO
A fotometria clássica é, sem dúvida, um dos maiores trunfos de que dispõe o laboratório na
atualidade. Esta técnica de medida, continuamente aperfeiçoada, ainda permanecerá durante longo
tempo sendo um dos mais úteis instrumentos de medida. Com esta técnica, compostos desconhecidos
podem ser identificados por seus espectros característicos ao ultravioleta, visível ou infravermelho. As
concentrações de soluções de compostos conhecidos podem ser determinadas, medindo-se a absorção
de luz em um ou mais comprimentos de onda. Reações enzimáticas podem ser frequentemente
seguidas, medindo-se, espectrofotometricamente, o aparecimento de produto ou desaparecimento de
substrato. As regiões espectrais do ultravioleta e visível têm mais importância para uso quantitativo,
enquanto que a região do infravermelho e outras, para elucidação estrutural.
Nossa ideia é apresentar os princípios e operações básicas que devem ser parte integrante do
conhecimento daqueles que operam com espectrofotômetros.
Quando usamos a espectrofotometria como processo de medida, basicamente estamos
empregando as propriedades dos átomos e moléculas de absorver e emitir energia eletromagnética,
em uma das muitas áreas do espectro eletromagnético. Os fenômenos físicos que acompanham a
absorção de luz nas várias regiões do espectro eletromagnético e as características da faixa visível são
ilustradas nas tabelas a seguir.
Tabela 3.1 Características do Espectro Eletromagnético Radiante (EMR).

Comprimento de
Região Fenômeno físico
onda (λ)
Raios X 0,1 – 100 nm Elétrons de níveis excitados para níveis energéticos mais altos
Ultravioleta 100 – 400 nm Elétrons de níveis excitados para níveis energéticos mais altos
Visível 400 – 800 nm Elétrons de níveis excitados para níveis energéticos mais altos
Infravermelho 800 nm – 50 µ Vibração molecular
Microonda 50 µ – 300 µ Rotação molecular
OBS: nm (Nanômetro) = 10-9m e μ (Microm) ou μm (Micrômetro) = 10-6m.
Tabela 3.2 Faixa visível do Espectro Eletromagnético Radiante.

Comprimento de Cor Cor da
onda (λ) em nm Absorvida Solução
380-430 Violeta Amarelo-verde
430-475 Azul Amarelo
475-495 Verde-azul Laranja
495-505 Azul-verde Vermelho
505-555 Verde Púrpura
555-575 Amarelo-verde Violeta
575-600 Amarelo Azul
600-620 Laranja Azul-verde
620-700 Vermelho Verde-azul
Ao falarmos em fotometria, pensamos instintivamente em luz. Na realidade, a porção visível do

espectro eletromagnético (EMR) é pequena, sendo ela que excita a retina, produzindo nosso mais
importante sentido: a visão. Esta relação fotometria-luz é desvantajosa porque encaramos o EMR em
termos de luz e cor, quando deveria ser considerado em termos de energia, o que é a realidade.
Essa energia é propagada sob a forma de ondas, que poderiam ser esquematicamente
consideradas como uma união de vales e elevações que partem do ponto de emissão de energia. A
distância entre dois pontos mais altos de duas elevações contíguas é denominada comprimento de
onda, simbolizado por  (Figura 3.7). Os comprimentos de onda variam de menores que 0,1 nm (raios
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gama) a maiores que 25 x 107 nm (ondas de rádio). O nanômetro (nm) é a unidade empregada
atualmente para medida do comprimento de onda. A quantidade de energia é inversamente
proporcional ao comprimento de onda e, portanto, os menores comprimentos de onda fornecem os
maiores níveis de energia.
Figura 3.7 Propagação da energia radiante.
Os aparelhos que medem a absorção de energia eletromagnética radiante por soluções e que
têm aplicação no laboratório são: os fotocolorímetros, que utilizam filtros compostos para selecionar
porções do espectro, e os espectrofotômetros, que utilizam grades de difração ou prismas na seleção
da porção desejada do espectro.
Componentes básicos da fotometria
Figura 3.8 Componentes da fotometria.
A Figura 3.8 esquematiza os componentes básicos da fotometria:

1. Fonte de energia elétrica: fornecedora de energia regulada, constante e apropriada para a
operação do aparelho.
2. Fonte de energia radiante: capaz de emitir uma mistura de comprimentos de onda. A
lâmpada de tungstênio é a mais utilizada fonte de energia radiante para o ultravioleta próximo ao
visível. Já a lâmpada de hidrogênio é a melhor fonte de energia radiante constante na região do
ultravioleta. Estas lâmpadas requerem uma estabilização de 15 minutos, depois de ligadas, para que
possam fornecer quantidade constante de energia radiante.
3. Monocromador: utilizado para isolamento da porção desejada do espectro. Isto é possível
utilizando-se de filtros, prismas e grades de difração. O mais comum é o uso de prismas. Os pequenos
P á g i n a | 24
comprimentos de onda são refratados em grau maior, o que produz um espectro não linear com
pequena definição nos grandes comprimentos de onda.
4. Fenda: o prisma necessita receber energia radiante através de uma fenda de entrada (4A) e o
isolamento espectral é feito por uma fenda de saída (4B). Os prismas permitem o isolamento de faixas
do espectro com diminuta faixa de emissão (0,5 a 1,5 nm).
5. Porta-cubeta: recipiente onde se coloca a cubeta contendo a solução a ser medida.
As cubetas são, provavelmente, a porção mais negligenciada do sistema fotométrico, apesar de
serem de grande importância. Quando não são corretamente cuidadas, contribuem decisivamente no
aumento do erro fotométrico. Existem dois tipos de cubetas: quadrada e redonda. A cubeta quadrada
tem faces planas e paralelas. É polida oticamente e totalmente isenta dos efeitos de lente ou dos erros
de refração da cubeta redonda. É utilizada para medições onde se requer grande precisão e exatidão. A
cubeta para medidas no ultravioleta, em comprimentos de onda abaixo de 320 nm, deve ser de
quartzo, pois nesta região o vidro absorve energia radiante. A cubeta redonda, por sua vez, não é
exatamente redonda, não é polida, apresentando irregularidades na superfície. Está sujeita aos erros de
refração e possui efeito de lente. A cubeta redonda é muito sensível ao efeito de posição em relação ao
feixe de luz e, na maioria dos casos, contém uma marca orientadora para que seja colocada no porta-
cubeta, sempre na mesma posição. Caso esta orientação não seja seguida, pequenos erros de refração
ou de efeito de lente podem ser ampliados, acentuando, portanto, o erro fotométrico.
6. Detector: utilizado para receber a energia radiante transmitida através da solução e
transformá-la em energia elétrica. O detector pode ser uma célula fotoelétrica ou um fotomultiplicador.
A célula fotoelétrica é composta de uma placa de ferro com uma das faces recoberta por uma
camada de selênio cristalino. Um condutor elétrico transparente é colocado sobre a camada de selênio
e funciona como polo negativo. A placa de ferro atua como polo positivo. Os fótons, atingindo a
camada de selênio, transferem sua energia para elétrons que passam à placa de ferro, atingem o
circuito medidor que se liga à célula e retornam pelo polo negativo à camada de selênio.
Não há, neste caso, perda de elétrons. O fotomultiplicador se assemelha a uma válvula e
contém um cátodo recoberto de uma substância que emite elétrons proporcionalmente à energia
recebida.
7. Circuito medidor: recebe a energia elétrica emitida pelo detector, apresentando-a sob a
forma útil de medida, isto é, absorbância e/ou transmitância. Este circuito consiste basicamente em um
ímã permanente em forma de ferradura com um espiral móvel suspenso entre seus pólos. A espiral
móvel recebe a corrente fornecida pelo detector e seu eixo está perpendicular ao campo magnético
formado pelos dois pólos do ímã permanente. Um ponteiro é ligado à espiral, movimentando-se sobre
uma escala graduada em transmitância e/ou absorbância.
Leis da fotometria
Quando um raio de energia radiante atravessa uma solução, a energia incidente (Io) será
sempre mais intensa que a energia emergente (I). Esta atenuação da intensidade de energia pode ser
atribuída a (1) reflexões nas interfaces entre o ar e a parede da cubeta e entre a solução e a parede da
cubeta; (2) dispersão por partículas presentes na solução; e (3) absorção da energia pela solução em
estudo (Figura 3.9).
P á g i n a | 25
Figura 3.9 Absorção da energia radiante que atravessa uma solução.
Transmitância
É a relação entre a energia transmitida (I) e a energia incidente (I0).
T = I/I0
Se uma determinada solução não absorve energia, I e I0 têm o mesmo valor e logo I/I0 será igual
a 1. Conclui-se, assim, que qualquer solução que absorva energia terá transmitância menor que 1
(porque I é, neste caso, maior que I0). Para evitar operações com decimais, recorreu-se ao artifício da
multiplicação por 100. Assim, quando I e I0 são iguais T = 1 = 100%.
Absorbância
É a relação logarítmica entre a energia incidente (I0) e a energia transmitida (I) pela solução.
A = log I0 /I = -log T
Nas aplicações da fotometria, a absorção é o fator primário na redução da energia incidente.

Quando se usa energia monocromática (simples comprimento de onda), a fração de radiação absorvida
pela solução, ignorando perdas por reflexão e dispersão, será função da concentração da solução e da
espessura da solução.
Matematicamente, esta função pode ser definida como:

I0 = e-( · c · l)
Onde:
I0 = intensidade de energia incidente
e = base dos logaritmos neperianos (2,303).
 = absortividade; constante característica da solução e que depende do comprimento de onda.
c = concentração da solução.
l = espessura da solução atravessada pela radiação.
Portanto, esta fórmula estabelece que, quando a energia radiante monocromática atravessa
uma solução, a quantidade de energia transmitida diminui exponencialmente com (1) o aumento da
espessura atravessada e (2) aumento da concentração ou da intensidade de cor da solução.
O primeiro conceito deriva da Lei de Lambert que pode ser representada pela equação:
P á g i n a | 26
log I0/I =  · l
Já o segundo conceito deriva da Lei de Beer que, por sua vez, pode ser representada como:
log I0/I =  · c
Estes dois conceitos constituem a Lei de Lambert-Beer, que pode ser representada por:
log I0/I =  · c · l
Como A = log I0/I, então a equação acima pode ser representada como:
A=·c·l
Aplicações da fotometria
Curva de calibração ou curva padrão
A principal finalidade de uma medida espectrofotométrica, nas regiões do ultravioleta e visível,

é avaliar quantidades. Assim, é extremamente importante efetuar uma rigorosa calibração visando
obter resultados exatos. Para obter-se uma curva de calibração alguns aspectos devem ser
considerados como: a escolha de uma solução padrão, o estabelecimento de um branco adequado e a
seleção da área espectral.
Soluções padrões
Constituem parte integrante da análise quantitativa no laboratório e usada nas dosagens de

amostras desconhecidas. Uma solução padrão apresenta concentração exata de uma substância
conhecida, que servirá como referência na determinação fotométrica de concentrações desconhecidas
desta mesma substância. Uma solução padrão tem grande importância no preparo da curva de
calibração.
Brancos
As medidas de absorção de luz devem ser feitas em relação a um branco, uma solução que
contém todos os componentes do experimento exceto o composto que está sendo medido. Quando
usamos o branco em fotometria, para estabelecer o zero-Absorbância ou 100% Transmitância, estamos
realmente usando um sistema simples para eliminar a absorbância dos reagentes e das cubetas, perdas
por reflexão e refração, e compensação do efeito de lente produzido pelas cubetas redondas.
Usamos o ponto zero-A ou 100%-T porque assim eliminamos a necessidade de cálculos, pois
neste ponto a energia incidente (I0) torna-se igual a 100 (T = I/I0).
Em algumas dosagens, obtemos brancos com elevada absorbância, o que dificulta o acerto do
zero em muitos aparelhos. Neste caso, deve-se efetuar a leitura do branco e da amostra acertando o
zero com água destilada, determinando-se a seguir as diferenças entre branco e amostra para os
posteriores cálculos.
Seleção da área espectral
Quando se realiza uma medida fotométrica deve-se utilizar uma faixa do espectro na qual a
energia radiante seja absorvida ao máximo, a fim de se obter o mais alto grau de sensibilidade. Uma
solução azul absorve o amarelo com maior intensidade e, portanto, deve ser escolhida a porção
P á g i n a | 27
amarela para medida de solução azul. Na maioria das determinações colorimétricas, utiliza-se sempre
uma faixa espectral cuja cor é complementar à da solução a ser medida (ver Tabela 3.2).
O melhor processo para avaliar a correta região espectral para uma medida fotométrica
consiste no preparo do espectro de absorção, que consiste no relacionamento entre as absorbâncias e
os respectivos comprimentos de ondas.
Obtenção da Curva de Calibração
O preparo da curva de calibração é de grande importância e deve ser bem entendido. Todo
analista deve ser capaz de preparar suas próprias curvas de calibração e interpretar os resultados
obtidos.
Para se obter o valor da concentração de substâncias cuja concentração se desconhece, é
necessário estabelecer uma relação entre a absorbância desta solução em diferentes concentrações
com as suas concentrações. Isto se chama curva de calibração.
O procedimento a seguir pode ser usado como processo de preparo da curva:
1. Preparar uma série de padrões exatos, cobrindo a faixa de trabalho usada ou indicada. Usar o
padrão recomendado para o método a ser calibrado.
2. Dosar todos os padrões de acordo com a técnica recomendada. Efetuar as leituras
colorimétricas, usando o branco apropriado para acertar o zero-A ou 100%-T, além do comprimento de
onda recomendado pela literatura ou obtido pela curva de absorção espectral previamente realizada.
3. Ao proceder as leituras em Transmitância, recorrer à tabela de conversão, transformando os
resultados em Absorbância.
4. Plotar os resultados em papel milimetrado, relacionando Absorbância (ordenada) com as
concentrações dos padrões (abcissa).
Examinar bem os pontos e decidir se eles serão cobertos por uma linha reta. Se os pontos
aparentemente seguirem uma linha reta, traçar uma curva de modo que mais se aproxime de todos os
pontos obtidos. A curva não deve ser traçada de ponto a ponto, mas interpolando através dos pontos.
5. Examinar a curva traçada, avaliando se ela tem sensibilidade correta (Figura 3.10).
Abs
A
Concentração
Figura 3.10 Tipos de curva de calibração. (A) curva muito sensível; (B) curva de sensibilidade ideal e (C)
curva pouco sensível.
A curva de calibração ideal deve ter ângulo de 45° em relação ao ponto de origem. Curvas de
ângulos muito agudos ou obtusos não devem ser utilizadas.
6. Se a curva não for ideal devemos procurar um meio de corrigir este problema usando os
seguintes processos:
a. utilizar uma cubeta com diâmetro interno maior ou menor;
P á g i n a | 28
b. alterar o comprimento de onda. Este processo irá diminuir a sensibilidade em muitos casos,
mas é um recurso de muita valia;
c. aumentar ou diminuir a alíquota. Isto deve ser feito com muito cuidado, verificando se não
ocorrem alterações no sistema colorimétrico comprometendo a segurança do método;
d. aumentar ou diminuir o volume final da reação, variando os volumes dos reagentes.
Evidentemente, uma curva de calibração não é estável indefinidamente, podendo variar com:
(a) variação da sensibilidade do aparelho de medida (fonte de energia radiante, detector, calibração do
comprimento de onda, etc.) e, (b) com variações da sensibilidade dos reagentes.
Todas as vezes que forem preparados novos lotes de reagentes ou que forem substituídas
lâmpadas do aparelho, novas curvas de calibração deverão ser realizadas.
É interessante observar a relação existente entre a curva de calibração e a Lei de Lambert-Beer.
Verifica-se que a Absorbância (A) é diretamente proporcional à concentração (C) quando considera-se 
e l constantes características da solução e da cubeta, respectivamente.
Calibração com padrão diário
É prática considerada correta porque a calibração no dia-a-dia é feita com um padrão dosado
praticamente nas mesmas condições das amostras. O cálculo é feito da seguinte forma:
absorbância da amostra
[𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎] = . [𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜]
absorbância do padrão
Fator de Calibração
O fator de calibração (FC) é um artifício utilizado rotineiramente e seu cálculo é feito de acordo
com o que se segue:
Concentração do padrão
FC =
Absorbância do padrão
Outra maneira de se obter o fator de calibração é através da própria curva de calibração, ou

seja, pelo coeficiente angular da reta obtida.
1
𝐅𝐂 = cotg ∝=
tg ∝
sen ∝
como tg ∝=
cos ∝
Então:
cos ∝
𝐅𝐂 =
sen ∝
De onde se conclui que:
cateto adjacente x2 − x1
𝐅𝐂 = =
cateto oposto y2 − y1
P á g i n a | 29
De posse do fator de calibração (FC), é possível obter-se a concentração da amostra:
[amostra] = absorbância da amostra · FC
Espectro de absorção do complexo proteína-biureto
Reagentes:
Solução padrão de albumina 10 mg/mL (1g%)

Reagente de biureto: dissolver 3 g de sulfato de cobre heptahidratado e 9 g de tartarato de
sódio e potássio em 500 mL de hidróxido de sódio 2 M. Em seguida, adicionar 5 g de iodeto de potássio
e completar para 1000 mL com hidróxido de sódio 2 M.
Soro sanguíneo ou amostras de albumina com concentrações desconhecidas.
O espectro de absorção é construído pelo próprio aparelho. Para isso serão necessários os
tubos 5 (o mais concentrado) e o tubo 6 (branco) da seqüência de diluição feitas a seguir.
Curva de calibração
- A curva de calibração será preparada com soluções de concentrações conhecidas de albumina.

- Enumerar seis tubos de ensaio e preparar diferentes diluições da solução de albumina 10
mg/mL, tendo como volume final 1 mL, como indicado na tabela abaixo.
Tubo Concentração Albumina 10 Água Biureto Absorbância (nm)

(mg/mL) mg/mL (mL) (mL) (mL)
01 2,0 0,8 4,0
02 4,0 0,6 4,0
03 6,0 0,4 4,0
04 8,0 0,2 4,0
05 10,0 1,0 --- 4,0
06 --- --- 1,0 4,0 -----
- Deixar os tubos em repouso por 10 minutos.

- Ler as absorbâncias de cada tubo no λ anteriormente selecionado pela observação do
espectro de absorção (550 nm), usando o tubo 6 como branco.
- Traçar um gráfico, colocando na ordenada as absorbâncias e na abscissa as concentrações.
- Analisar.
- Calcular o fator de calibração (FC).
Dosagem de proteínas totais no soro sanguíneo.
Em um tubo de ensaio, pipetar 1,9 mL de água destilada e 0,1 mL do soro a ser testado.
Retirar uma alíquota de 1 mL. Acrescentar 4 mL do reagente de biureto e deixar em repouso
por 5 minutos. Efetuar a leitura no mesmo comprimento de onda utilizado anteriormente.
Determinar a concentração de proteínas totais, utilizando-se da curva de calibração obtida
anteriormente, bem como do fator de calibração.
Para efetuar os cálculos levar em consideração a diluição efetuada.
Valores Normais: 60 a 80 mg/mL
P á g i n a | 30
3.2.2 REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS
A solubilidade de uma proteína é muito variável e depende da distribuição e da proporção dos

grupos polares (hidrofílicos) e dos apolares (hidrofóbicos) na molécula.
Muitas proteínas são solúveis em água ou soluções salinas. Desde que uma proteína possua
muitos grupos carregados positiva e negativamente, provenientes das cadeias laterais dos aminoácidos,
as moléculas irão interagir umas com as outras com pequenos íons de cargas opostas e com a água.
Assim, ocorrem interações proteína-proteína, proteína-água e proteína-pequenos íons. Se a interação
proteína-água é alta, a proteína tende a ser solúvel.
A. Reações de precipitação com desnaturação
As proteínas possuem uma estrutura tridimensional bem definida, que está relacionada com
suas propriedades físicas e biológicas. A modificação na estrutura tridimensional nativa de uma
proteína, com consequente alteração de suas propriedades, é conhecida como desnaturação. A
desnaturação envolve alterações nas estruturas quaternária, terciária e secundária de proteínas, mas
não da primária.
Existem vários agentes desnaturantes de proteínas, tais como: calor, ácidos, álcalis, solventes
orgânicos, soluções concentradas de uréia e guanidina, detergentes, sais de metais pesados etc.
Entre as alterações que se observam em decorrência da desnaturação protéica, pode-se citar:
diminuição da solubilidade, perda de atividade biológica (por exemplo, da ação enzimática, da ação
hormonal), aumento da reatividade de radicais da cadeia polipeptídica, alterações na viscosidade e
coeficiente de sedimentação etc. A diminuição da solubilidade pode ser explicada pela exposição de
radicais hidrofóbicos e outros que prejudiquem a interação proteína-água e favoreçam a interação
proteína-proteína. A desnaturação é o evento primário. A floculação e a coagulação, que muitas vezes
são confundidas com desnaturação de proteínas, são simplesmente manifestações visíveis das
alterações estruturais causadas pelos agentes desnaturantes.
As reações de precipitação com desnaturação, além de serem utilizadas para caracterizar a
presença de proteínas em solução, também são úteis para proceder a desproteinização de líquidos
biológicos para análise de componentes não proteicos.
Reagentes
Solução de proteínas preparada pela diluição de clara de ovo 10%

Sulfato de cobre 0,1 M
Acetato de chumbo 0,1 M
Hidróxido de sódio 2,5 M
Ácido tricloroacético 10%
Álcool etílico absoluto
Acetona
Ácido pícrico 1%
A.1 Precipitação por ação de calor
De maneira geral, o calor pode desnaturar a maioria das proteínas, uma vez que a agitação
térmica afeta as interações que estabilizam a estrutura tridimensional das proteínas, como por
exemplo, as pontes de hidrogênio. É o que se observa quando se aquece clara de ovo diretamente em
bico de Bunsen. Há a formação de coágulo branco de proteína desnaturada.
P á g i n a | 31
Figura 3.9 Proteína desnaturada
Técnica
Em um tubo de ensaio colocar 2 mL de solução de proteína e aquecer diretamente na chama ou

em banho-maria. Observar a formação de coágulo brando de proteína desnaturada.
A.2 Precipitação por interação com sais de metais pesados
Em pH 7,0 ou acima, as proteínas estão normalmente carregadas com cargas negativas. Os

cátions de metais pesados neutralizam estas cargas, fazendo com que as proteínas precipitem,
formando proteinatos insolúveis. O precipitado é freqüentemente solúvel em excesso de metais
pesados, desde que o excesso de íons confira uma carga positiva estabilizadora sobre as partículas. Por
exemplo, o tratamento de uma solução de proteínas com acetato de chumbo leva à formação de um
proteinato de chumbo insolúvel.
Técnica
Em dois tubos de ensaio, colocar 2 mL da solução de proteínas (clara de ovo). Ao primeiro tubo,
adicionar 5 gotas de sulfato de cobre 0,1 M. Ao segundo tubo, adicionar 5 gotas de acetato de chumbo
0,1 M. Observar os resultados.
Após analisar os resultados, adicionar excesso de reagente e observar.
A.3 Precipitação por interação com os reagentes acídicos
Os ânions dos reagentes acídicos podem combinar-se com as proteínas que possuem carga
positiva (quando o pH da solução estiver no lado ácido do ponto isoelétrico da proteína), formando sais
insolúveis. Dentre estes reagentes tem-se: ácido pícrico, ácido tânico, ácido fosfotúngstico, ácido
sulfossalicílico e ácido tricloroacético. Estes reagentes são, portanto, mais efetivos em pH ácido, no qual
as proteínas estão carregadas positivamente.
Um exemplo deste tipo de precipitação é a reação de proteínas com ácido tricloroacético,
resultando na formação de tricloroacetato de proteína, insolúvel.
P á g i n a | 32
Técnica
Em dois tubos de ensaio, colocar 2 mL da solução de proteínas (clara de ovo). Ao primeiro tubo
adicionar duas gotas de ácido tricloroacético 10%. Ao segundo tubo adicionar duas gotas de ácido
pícrico 1%. Observar a formação de um precipitado branco e um amarelo de proteínas desnaturadas.
A seguir, adicionar excesso de reagente e observar o resultado. Finalmente, adicionar
lentamente hidróxido de sódio 2,5 M e observar o resultado com o aumento de pH.
A.4 Precipitação por ação de solventes orgânicos
A adição de solventes orgânicos como o etanol, éter etílico e acetona às soluções aquosas de
proteínas pode levar a precipitação das mesmas. Isto pode ser explicado pelo fato desses solventes
apresentarem uma constante dielétrica inferior à da água. A constante dielétrica de uma substância é
uma medida da sua capacidade de se orientar de tal modo a neutralizar uma determinada carga nas
suas proximidades.
A força de atração entre dois íons de cargas opostas (F) pode ser expressa como:
e+ e-
F=
Dr 2
onde e+ e e- são as cargas dos íons, D a constante dielétrica e r, a distância entre as cargas.
A água tem uma constante dielétrica extremamente alta (80, a 20°C) e, deste modo, a força de
atração entre moléculas protéicas contendo radicais com cargas opostas é baixa, predominando a
interação proteína-água em vez da interação proteína-proteína. A adição de solventes pode inverter
esta situação, levando a agregação e precipitação das moléculas protéicas.
Técnica
Em um tubo de ensaio, colocar 2 mL de solução de clara de ovo e adicionar álcool etílico

(constante dielétrica = 24) até a formação do precipitado.
Em um segundo tubo de ensaio, colocar 2 mL de solução de clara de ovo e adicionar acetona
(constante dielétrica = 21) até a formação de precipitado.
B. Reações de precipitação sem desnaturação
As proteínas podem ser precipitadas, sem sofrerem desnaturação, por ação de solventes
orgânicos (como foi explicado anteriormente), pela variação do pH e por alterações da força iônica do
meio.
B.1 Precipitação isoelétrica
O pH em que a proteína tem sua menor solubilidade é o pH isolétrico, que é definido como o pH
no qual a molécula de proteína não apresenta carga elétrica efetiva, sendo incapaz de deslocar-se em
um campo elétrico. Nessas condições, não existe repulsão eletrostática entre as moléculas protéicas
vizinhas, e elas tendem a precipitar. Contudo, em valores de pH acima ou abaixo do ponto isoelétrico,
todas as moléculas protéicas possuem uma carga efetiva de mesmo sinal. Em conseqüência elas repelir-
se-ão umas às outras, evitando a coalescência das moléculas isoladas em agregados insolúveis. A
proteína precipitada isoeletricamente permanece na sua conformação nativa e pode ser redissolvida
em um meio que apresente um pH adequado e concentração de sal conveniente.
P á g i n a | 33
Reagentes
Solução alcalina de caseína 1% (pH próximo de 8)

Ácido clorídrico 0,1 M
Azul de bromofenol: dissolver 0,1 g de azul de bromofenol em 100 mL de etanol
Técnica
Em um tubo de ensaio, pipetar 5 mL de solução alcalina de caseína. Adicionar, a seguir, 5 gotas

de azul de bromofenol para acompanhar as variações de pH (em pH = 3,1, cor amarela e em pH = 4,7,
cor azul). Adicionar ácido clorídrico 0,1 M, gota a gota, até ocorrer precipitação. Continuar adicionando
ácido e agitar, após a adição de cada gota. Observar.
B.2 Solubilização e precipitação por salificação
A capacidade dos sais neutros de influenciar a solubilidade das proteínas é uma função iônica,
que tanto depende de sua concentração como da valência de cátions e ânions, que formam o sal. A
força iônica (I) da solução é indicada pela expressão:
∑ 𝑐𝑖 𝑧𝑖2
I=
2
Sendo c a concentração e z a carga. Em concentrações reduzidas, ou seja, forças iônicas baixas, os sais
aumentam a solubilidade de muitas proteínas, um fenômeno denominado solubilização por salificação
(salting-in). Isto se deve, provavelmente, a uma interação da proteína com sais causando diminuição da
interação proteína-proteína e, portanto, aumentando a solubilidade. Os sais de íons divalentes, tais
como o MgCl2 e o (NH4)2SO4, são mais eficientes na solubilização por salificação do que os sais de íons
monovalentes como o NaCl, NH4Cl e KCl.
Por outro lado, em concentrações elevadas, ou seja, a medida que aumenta a força iônica da
solução, a solubilidade da proteína se reduz gradativamente. Nestas condições, uma proteína pode ser
quase completamente precipitada de sua solução, um efeito conhecido como precipitação por
salificação (salting out). Acredita-se que a concentração elevada de sais pode remover a água de
hidratação das moléculas proteicas, o que leva a um aumento na interação proteína-proteína,
resultando em precipitação. O sulfato de amônio é preferido para essa precipitação, devido a sua
acentuada solubilidade em água, o que permite produzir forças iônicas muito elevadas.
Tanto a solubilização como a precipitação de proteínas pelos sais é importantes processos para
a separação de misturas proteicas, uma vez que proteínas diferentes variam quanto a sua resposta à
concentração de sais neutros.
Reagentes
Clara de ovo "in natura"
Cloreto de sódio 2 M
Solução saturada de sulfato de amônio
Técnica
Preparar em um béquer de 250 mL a clara de um ovo. Adicionar 200 mL de água destilada e
agitar com bastão de vidro. As globulinas precipitam e a albumina permanece em solução.
P á g i n a | 34
B.3 Solubilização por salificação (salting-in)
Pipetar 5 mL da solução preparada em um tubo de ensaio. Adicionar cloreto de sódio 2 M, gota

a gota, até a redissolução do precipitado de proteínas. Esta redissolução se deve à restauração da força
iônica original.
B.4 Precipitação por salificação (salting-out)
Pipetar 2 mL da solução obtida na experiência anterior (salting-in), em tubo de ensaio.

Adicionar, a seguir, 2 mL de solução saturada de sulfato de amônio e observar a formação de
precipitado de proteínas (globulinas), o que corresponde ao fenômeno de salting-out. Juntar, a seguir, 4
a 6 mL de água destilada, a fim de recompor a força iônica anterior e como consequência redissolver o
precipitado. Interpretar.
As globulinas de clara de ovo precipitam com 50% de saturação com sulfato de amônio,
enquanto que a ovo albumina precipita com 100% de saturação com sulfato de amônio.
P á g i n a | 35
3.2.3 EXTRAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E DOSAGEM DA CASEÍNA NO LEITE
A caseína é a principal proteína encontrada no leite. Apresenta seu ponto isoelétrico no pH

(4,6―4,7). Dependendo do pH do meio, uma proteína pode apresentar carga elétrica positiva, negativa
ou nula. As variações do pH na solução influenciam as cargas dos radicais dos aminoácidos constituintes
das proteínas. Com isso a própria estrutura proteica se modifica, bem como seus fatores de
solubilidade (carga elétrica e capacidade de hidratação das moléculas).
Em solução, quando as moléculas de determinada proteína estiverem carregadas positivamente
ou negativamente, a solubilidade dessa proteína será maior, pois as moléculas se repelirão entre si,
aumentando a interação com o solvente. Existe um pH intermediário, que varia de proteína para
proteína (pois depende dos radicais R dos aminoácidos que a constituem), em que há um equilíbrio
entre as cargas positivas e negativas. Este pH é conhecido como PONTO ISOELÉTRICO da proteína – pI.
Nesse pH, a proteína apresenta solubilidade mínima, porque a carga efetiva da molécula é nula (há um
balanço entre cargas positivas e negativas), ficando diminuída a repulsão entre as moléculas e havendo
interação eletrostática das moléculas entre si. Como consequência, forma-se grumos que tendem a
precipitar.
Proteínas do leite de vaca Concentração aproximada (g%) pI

s1-Caseína 1,37 4,1
K-Caseína 0,37 3,7
-Caseína 0,62 4,5
-Caseína 0,12 5,8 – 6,0
-Lactoglobulina 0,30 5,3
-Lactoalbumina 0,07 5,1
Albumina do soro bovino 0,03 4,7
Imunoglobulina (IgG) 0,06 5,6 – 6,0
Reagentes
Leite desnatado
Ácido acético 5%
Reagente de Biureto
Etanol
Éter etílico
Na OH 2M
Extração
Em um béquer de 100 mL contendo 10 mL de leite, adicionar 40 mL de água destilada. Retirar

uma alíquota de 1 mL e realizar a reação do biureto (1 mL de amostra + 4 mL do reagente de biureto).
Analisar. Esta etapa é opcional e apenas qualitativa para demonstrar que o leite possui sim proteínas.
Na verdade esta dosagem inicial seria inviável, pois além de proteínas o leite possui gorduras e outras
substâncias que possivelmente interfeririam na dosagem (inclusive o próprio aspecto leitoso). A título
de comparação, poderíamos dosar junto uma solução de albumina em uma concentração de 10 mg/mL.
P á g i n a | 36
10 mL de leite + 40 mL de água (primeira diluição)
No pHmêtro, acrescentar ácido acético 5%, gota a

gota, até que ocorra precipitação da caseína (aproximadamente
no pH 4,6). Água, lipídeos e outras proteínas também precipitam.
Deixar em repouso por 5 minutos.
Agitar o frasco (ressuspender) e recolher uma alíquota de 10 mL

para cada equipe, em um tubo de centrífuga.
Centrifugar a 3000 rpm por 10 minutos.

Realizar a dosagem de proteínas no sobrenadante
(principalmente albumina).
Tomar 1 mL do sobrenadante e 4 mL do reativo de
biureto.
Esta dosagem pode ser feita no final, reservando o
sobrenadante.
Todo o sobrenadante deve ser retirado com cuidado
para não perder o precipitado. Assim todas as dosagens proteicas
podem ser feitas em conjunto no final do experimento.
Adicionar 2 ml de éter etílico, e a seguir,

homogeneizar com um bastão de vidro.
A adição de éter etílico tem por finalidade retirar
materiais gordurosos. Centrifugar a 3000 rpm por 2 minutos e
desprezar o sobrenadante (éter na pia).
Adicionar 2 ml de etanol absoluto e homogeneizar. A

adição de etanol tem por finalidade retirar a água de solvatação
que permaneceu junto à proteína.
Água e etanol são miscíveis. Centrifugar a 3000 rpm
por 2 minutos e desprezar o sobrenadante.
Finalmente, adicionar 2ml de hidróxido de sódio 2 M e

redissolver o precipitado, completando com água destilada para
um volume final de 5 ml. (2 mL NaOH + 3 mL água). Portanto 5 mL
é o volume no qual as proteínas foram ressuspendidas.
P á g i n a | 37
Determinar a concentração de caseína, através da curva de calibração, obtida em aula anterior.

Calcular a concentração de caseína em um litro de leite. Calcular também a concentração de proteínas
totais.
Cálculos envolvidos
1. No precipitado (caseína precipitada)

0,2 mL de amostra + 0,8 mL
[concentração] = Abs x Fc x Fd de água (Fd = 5x)
[concentração] = 0,085 x 20,8 x 5
[concentração] = 8,84 mg/mL
8,84 mg --------- 1 mL
X mg --------- 5 mL
X = 44,2 mg
44,2 mg -------- 10 mL solução de leite diluído 5 x

X mg --------- 50 mL solução de leite no béquer diluído 5x
X = 221 mg (lembrar que 221 mg estão em 10 mL de leite puro que foram diluídos 5x para 50 mL).
221 mg--------------10 mL de leite puro

X mg-----------------100 mL de leite puro
X= 2210 mg% ou 22100 mg/L ou 22,1 g/L
2. Sobrenadante (não diluído)
[concentração de proteínas]= Abs x Fc

[concentração de proteínas] = 0,088 x 20,8
[concentração de proteínas] = 1,8304 mg/mL
1,8304 mg ------- 1 mL
X mg ------- 10 mL da alíquota retirada do precipitado
X= 18,304 mg
P á g i n a | 38
18,304 mg ------- 10 mL de solução de leite diluída 5x

X mg ------- 50 mL de solução de leite diluída 5 x
X= 91,52 mg (lembrar que 91,52 mg estão em 10 mL de leite puro que foram diluídos 5x para 50 mL).
91,52 mg ------- 10 mL de leite puro

X -------- 100 mL
x= 915,2 mg% ou 9152 mg/L ou 9,152 g/L
3. Cálculos das proteínas totais
22,1 g/L caseína + 9,152 g/L outras proteínas = 31,252 g/L
31,252 -------- 1000 mL

Xg --------- 200 mL
X = 6,2504 g/ 200 mL (como consta na caixa de leite)
Exemplo
Cálculos envolvidos
Para calcular a concentração de albumina no leite:
[albumina] = Abs × Fc
[albumina] = 0.05 × 20 = 1.0 mg/mL
1 mg → 1mL
X mg → 10 mL
X = 10 mg/10 mL
- Lembrar que o leite estava diluído 5× (10 mL de leite + 40 mL de água)

- 10 mg/10 mL × 5 = 50 mg/10 mL
50 mg → 10 mL
X → 1000 mL
X = 5000 mg/L ou 5 g/L.
Para calcular a concentração de caseína no leite:
[caseína] = Abs × Fc × Fator de diluição (amostra foi diluída 5 ×, 0.2 mL amostra + 0.8 mL água)
[caseína] = 0.1 × 20 × 5 = 10 mg/mL
10 mg → 1 mL (de acordo com a curva de calibração onde a unidade era mg/mL)

X mg → 5 mL (volume no qual as proteínas foram ressuspendidas)
X = 50 mg/5mL do meio no qual as proteínas foram ressuspendidas

P á g i n a | 39
- 50 mg em 10 mL da solução de leite (por equipe). Mas esta solução foi inicialmente diluída 5 × (10 mL de
leite + 40 mL água)
- 50 mg × 5 = 250 mg caseína/10 mL leite
250 mg → 10 mL
X mg → 1000 mL
X = 25000 mg/L ou 25 g/L.
Para calcular a concentração de proteínas totais do leite:
[proteínas totais] = [caseína] + [albumina]

[proteínas totais] = 25 g/L + 5 g/L
[proteínas totais] = 30 g/L
Na caixa de leite está escrito 6,5 g de proteínas para cada 200 mL
De acordo com os valores teóricos:
Proteínas totais do leite de vaca = 3,3 g%

80% deste total correspondem a caseínas
Correlacionar os valores teóricos com os valores práticos.

Por exemplo:
80% caseína seriam 24 g (foi encontrado 25 g)

20% albumina seriam 6 g (foi encontrado 6 g)
P á g i n a | 40
4. ENZIMAS
As enzimas desempenham um papel de destaque no organismo vivo, uma vez que catalisam
reações bioquímicas imprescindíveis ao desenvolvimento e manutenção das células. Estes catalisadores
que aumentam de 106 a 1012 vezes a velocidade das reações bioquímicas, em comparação com as
reações não catalisadas. Todas as enzimas compartilham certas características estruturais e funcionais,
independentemente da reação catalisada. Todas são proteínas e contém um sítio funcional,
denominado sítio ativo, onde os reagentes são convertidos em produtos. Cada enzima exibe um alto
grau de especificidade e catalisa uma ou algumas reações. Este elevado grau de especificidade
enzimática é o fator responsável pela rede coordenada de reações químicas que ocorre nas células
vivas e cuja soma constitui o metabolismo.
A concentração de uma enzima em tecido ou fluido biológico pode ser determinada medindo-
se a velocidade da reação catalisada pela enzima. Para isso são utilizados métodos analíticos que
permitam medir a diminuição na concentração do substrato ou o aumento na concentração do produto
formado pela reação.
Muitos fatores podem afetar a atividade enzimática: concentração do substrato, temperatura,
pH, concentração de ativadores e inibidores, concentração do produto. Todas estas variáveis podem e
devem ser controladas, mas a presença de ativadores e inibidores em sistemas biológicos nem sempre
é detectada e por isso não pode ser controlada.
4.1 CINÉTICA DAS REAÇÕES ENZIMÁTICAS
O estudo da velocidade das reações catalisadas por enzimas fornece consideráveis informações
sobre os mecanismos de ação destas enzimas, bem como sobre as características da reação catalisada,
que são úteis para melhor compreensão do metabolismo.
A cinética enzimática consiste em medidas de velocidade da reação catalisada por uma enzima
sob diversas condições. Estas medidas têm basicamente duas finalidades: a caracterização da enzima e
o mecanismo da reação enzimática. Cada enzima possui um conjunto de características próprias que se
manifestam na sua atividade catalítica. A medida desta atividade catalítica permite de certa forma, um
melhor conhecimento destas características. Assim, pode-se medir a dependência da velocidade de
reação catalisada pela enzima em relação a concentração do substrato, em função da temperatura, pH
e tempo de reação, entre outros parâmetros.
Uma equação geral para velocidade, conhecida como equação de Michaelis-Menten, descreve a
reação onde ocorre interconversão reversível de um único substrato e de um único produto. Supõe-se
que a enzima E reage com o substrato S, produzindo um complexo enzima-substrato ES, que, em
seguida, libera a enzima e o produto P, da seguinte maneira:
onde k1, k-1, k2 e k-2 são, respectivamente, as constantes de velocidade das etapas da reação presumida.
Devido a importância desta equação, deduz-se, de acordo com a hipótese de Michaelis-Menten, que há
formação de um complexo enzima-substrato. Assim, a velocidade de formação do produto depende da
concentração do complexo enzima-substrato, que por sua vez, depende da concentração da enzima, da
concentração do substrato, da relação k1/k-1 e de k2.
A concentração ES aumenta com o aumento da concentração de substrato, até que toda a
enzima fique sob a forma de complexo ES. Nestas condições, a velocidade da reação é máxima (Vmax).
Quando a concentração de substrato é constante e em excesso, a velocidade de formação do produto é
diretamente proporcional à concentração da enzima. Baseando-se nisto, pode-se avaliar a quantidade
de enzima presente em líquidos biológicos, tecidos, soluções etc.
P á g i n a | 41
A velocidade de uma reação enzimática pode ser medida ou pela quantidade de substrato
transformado ou pela quantidade de produto formado por unidade de tempo. A relação entre a
concentração do substrato e a velocidade da reação enzimática pode ser mostrada graficamente,
plotando a concentração de substrato (S) na abcissa, e a velocidade de reação na ordenada. Dois
importantes parâmetros podem ser obtidos num gráfico deste tipo: a Vmax e Km. Este parâmetro,
conhecido como constante de Michaelis, representa a concentração de substrato necessária para
saturar metade da quantidade de enzima sendo característica de cada enzima. A velocidade da reação
enzimática, em qualquer tempo, é dada pela equação:
Vmax . [S]
V0 =
K m +[S]
Figura 4.1 Variação da velocidade da reação em função da concentração do substrato – Curva de

Michaelis-Menten.
O inverso desta equação corresponde à equação da reta (y = ax + b), isto é:
1 𝐾𝑚 1 1
= . +
𝑉0 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥
que é conhecida como equação de Linewevar-Burk. A representação gráfica de 1/v versus 1/[S],
chamado de gráfico de recíproca dupla, fornece uma linha reta com inclinação Km/Vmax e intercepção
das ordenadas 1/Vmax. Sendo a inclinação e o intercepto facilmente medidos no gráfico, pode-se
calcular com precisão Vmax e Km.
P á g i n a | 42
Figura 4.2 O gráfico de Lineweaver-Burke ou do duplo recíproco mostra o significado dos pontos de
intercepção entre a reta e os eixos de coordenadas, e do gradiente da velocidade.
Cinética da invertase de leveduras (Saccharomyces cerevisiae)
A invertase (E.C. 3.2.1.26) catalisa a hidrólise da sacarose (dissacarídeo formado por -D-glicose
e -D-frutose, unidas por ligação glicosídica do tipo (12). Como possui este tipo de ligação a
sacarose é um açúcar não redutor.
A ação da invertase sobre a sacarose libera como produto dois monossacarídeos e, portanto o
produto de hidrólise é redutor. Estes açúcares redutores em meio fortemente alcalino, e a quente,
formam enedióis que cedem elétrons para reduzir o 3,5-dinitrossalicilato a 3-amino-5-nitrossalicilato,
produzindo uma coloração alaranjada que será tanto mais intensa quanto maior for a concentração de
açúcar redutor presente no meio de reação.
Isolamento da invertase de leveduras
Pesar 50 gramas de fermento seco e suspender em 250 mL de bicarbonato de sódio 0,15 M.

Deixar em banho-maria a 37C durante 6 horas, com agitação ocasional para a necessária autólise.
Centrifugar por 20 minutos a 3500 rpm. Desprezar o sedimento, coletando o sobrenadante que contém
a frutofuranosidase ou invertase ativa, além das enzimas de outras vias metabólicas. Conservada em
geladeira (4C) a atividade da enzima é mantida por alguns meses. Determinar o conteúdo de proteínas
existentes no extrato obtido e usar 0,1 mg de proteínas /mL nos ensaios de cinética enzimática.
P á g i n a | 43
Curva da concentração do substrato
Reagentes
Extrato enzimático
Tampão acetato 0,05 M pH 4,7
Solução de sacarose nas seguintes concentrações: 20, 40, 80, 160 e 240 mM
Solução de ácido 3,5-dinitro-salicílico (DNS) 1%
Técnica:
Enumerar seis tubos e preparar as reações conforme a tabela:
Reagentes (µL) Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6

Tampão 0,05 M 550 550 550 550 550 550
Água destilada 500
Sacarose 20 mM 500
Sacarose 40 mM 500
Sacarose 80 mM 500
Sacarose 160 mM 500
Sacarose 240 mM 500
Cronometrar 30 segundos entre um tubo e outro e adicionar a enzima:
Extrato enzimático 200 200 200 200 200 200
Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos. Adicionar o DNS também cronometrando 30

segundos de intervalo de um tubo para o outro
3,5 dinitro-salicílico
500 500 500 500 500 500
(DNS)
Aquecer a 100°C durante 5 minutos. Retirar os tubos do aquecimento e adicionar 3,30 mL de

água destilada a cada um deles. Fazer a leitura no espectrofotômetro, em comprimento de onda de 540
nm, usando o tubo 1 como branco.
Traçar os dois gráficos: Michaelis-Menten e o Lineweaver-Burke. Para os cálculos utilizar o fator
de calibração (fc) fornecido na etiqueta do 3,5 dinitro-salicílico (DNS).
P á g i n a | 44
4.2 Extração e Caracterização da Urease da Soja
A urease foi à primeira enzima a ser purificada e cristalizada, um feito de James B. Sumner em
1926, numa altura em que a maior parte dos cientistas acreditava ser impossível cristalizar enzimas. A
urease catalisa a hidrólise de ureia em dióxido de carbono e amônia. Encontra-se principalmente em
sementes, micro-organismos e invertebrados. Nas plantas, a urease é um hexâmero (consiste em seis
cadeias idênticas) e localiza-se no citoplasma. Em bactérias, é constituída por duas ou três subunidades
diferentes. Para ser ativada, a urease precisa ligar-se a dois íons níquel por subunidade.
A ureia é fonte de nitrogênio, na forma de NH3, importante na síntese de aminoácidos e bases
nitrogenadas. Isto tem grande importância nas plantas superiores que não são capazes de assimilar ou
fixar nitrogênio a partir da atmosfera. Este não é o caso, para as bactérias e algas azuis.
A urease é uma enzima que catalisa a hidrólise da ureia em amônia e dióxido de carbono.
Em meio aquoso, ocorre:
A soma destas reações fornece:
A atividade da enzima pode ser verificada pela formação de carbonato de amônio, que é um sal
de reação básica e cuja presença pode ser revelada por meio de um indicador ácido-básico como
vermelho de fenol (pH 6,8 = cor amarela; pH 7,0 = cor laranja ; pH 7,2 = cor rósea; pH 8,0 = cor
vermelha). A urease existente em algumas bactérias e plantas como soja (Glycine max) pode ser
facilmente extraída.
4.2.1 Parte experimental
Extração da enzima
Reagentes
Sementes de soja
Glicerol 75%
[1]
P á g i n a | 45
Técnica de extração
Pesar 15 g de semente de soja e deixar de molho em água por 4 horas. Depois de escorrer a
água, triturar as sementes em um gral com auxílio de um pestilo. Em seguida, transferir a massa
triturada para um erlenmeyer de 250 mL. Adicionar 100 mL de glicerol 75%. Arrolhar o erlenmeyer e
agitar a suspensão por 15 minutos. Colocar no refrigerador, até o dia seguinte. Filtrar o extrato
glicerinado através de gaze por 3 vezes, espremendo levemente com a mão.
O extrato bruto de soja obtido deve ser conservado em refrigerador e, a partir dele, realizam-se
os testes de caracterização.
Caracterização da enzima
A. Reação do biureto
A reação do biureto, conforme visto anteriormente, é uma reação característica das proteínas.
Reagentes
Extrato bruto de soja (1:2) em tampão fosfato 0,001 M pH 7,0
Reagente de biureto
Técnica
Em um tubo identificado como A, colocar 5 gotas do extrato bruto obtido e acrescentar 2 mL de

água destilada. Agitar e adicionar 2 mL do reagente de biureto. Misturar.
Em um tubo identificado como B colocar 2 mL de água destilada e 2 mL de reagente de biureto.
Misturar. Comparar a cor nos dois tubos e interpretar os resultados.
B. Atividade da enzima
Resultados quantitativos para testar a eficiência das enzimas como catalisadores foram obtidos
para a hidrólise da uréia, catalisada pela urease isolada de sementes de soja. A constante de velocidade
aparente de primeira ordem para essa reação em meio aquoso, na ausência de enzima, é de 3 x 10 14 s-1
em pH 8,0 a 20°C. Em contraste, a constante de velocidade de primeira ordem para o desdobramento
do complexo uréia-urease, para obter-se os produtos, é de 3 x 104 s-1, nas mesmas condições
experimentais.
Neste teste, de caráter meramente qualitativo, utiliza-se, para verificar a atividade da urease, o
indicador vermelho de fenol, que passa de cor amarela, em meio ácido ou neutro, para cor vermelha
em meio básico.
Reagentes
Extrato bruto de soja

Tampão fosfato 0,001 M pH 7,0
Tampão fosfato 0,001 M pH 7,0 (contendo 1% de uréia)
Solução de vermelho de fenol: dissolver 0,1g de vermelho de fenol em 50 mL de hidróxido de
sódio 0,02 N. Completar com água destlada para um volume final de 250 mL.
Técnica
Em dois tubos de ensaio, identificados como A e B proceder da seguinte forma:

No tubo A, colocar 3 mL de tampão fosfato 0,001 M pH 7,0 (contendo 1% de uréia); 1 gota de
vermelho de fenol e 2 gotas do extrato bruto.
P á g i n a | 46
No tubo B, colocar 3 mL de tampão fosfato 0,001 M pH 7,0; 1 gota de vermelho de fenol e 2

gotas do extrato bruto. Agitar e observar se ocorre mudança de cor nos próximos 5 minutos.
Interpretar os resultados.
Guardar tubo A para comparações posteriores.
C. Desnaturação da enzima pelo calor
Conforme mencionado anteriormente, uma modificação na estrutura tridimensional nativa de

uma proteína, com conseqüente alteração de suas propriedades, é conhecida como desnaturação. Este
fenômeno envolve alterações nas estruturas quaternária, terciária e secundária de proteínas, mas não
na primária.
Entre os vários agentes desnaturantes de proteínas, o mais comum é o calor. Altas
temperaturas provocam efeito desnaturante de uma enzima com conseqüente perda de sua atividade
enzimática. Neste caso, a formação de produtos a partir de um substrato se mostra prejudicada. É o
que pode-se observar quando se aquece a urease por algum tempo.
Reagentes

Solução de vermelho de fenol
Técnica
Em um tubo de ensaio, colocar 3 mL de água destilada e 2 gotas de extrato bruto. Agitar e

ferver por 2 minutos.
Em outro tubo colocar 3 mL de tampão fosfato 0,001 M pH 7,0 (contendo 1% de uréia);
adicionar 1 gota de vermelho de fenol, e finalmente, 1 mL do extrato bruto fervido anteriormente.
Aguardar 5 minutos. Observar se houve modificação da cor em relação ao tubo A do item 2.2.
D. Inibição da enzima por sais de mercúrio
A velocidade das reações catalisadas por enzimas é diminuída por inibidores específicos, isto é,
compostos que se interagem com a enzima e impedem a combinação que ocorre normalmente entre
enzima e substrato. A toxicidade de muitas substâncias, tais como HCN e H2S, resulta de sua ação como
inibidores enzimáticos. Muitas drogas também atuam desta forma inibindo enzimas específicas. Por
conseguinte, o conhecimento dos inibidores enzimáticos é de suma importância para compreender a
ação de drogas e os agentes tóxicos. Além disso, o próprio estudo da inibição enzimática fornece
informações sobre as enzimas.
Na inibição competitiva, o inibidor pode-se combinar reversivelmente com o sítio ativo da
enzima e competir com o substrato por este sítio. Assim, enquanto o sítio ativo estiver ocupado, não
poderá efetuar a ligação do substrato. Já, na inibição não-competitiva, não existe nenhuma relação
entre o grau de inibição e a concentração do substrato. A inibição só depende da concentração do
inibidor. Em contraste com o tipo competitivo, admite-se que a formação do complexo enzima-inibidor
ocorra num local da enzima diferente do sítio onde se liga o substrato.
Reagentes

Solução de cloreto de mercúrio 0,05%.
P á g i n a | 47
Técnica
Em um tubo de ensaio, colocar 2 mL de água destilada, 1 gota de vermelho de fenol e 2 gotas

do extrato bruto. Agitar e acrescentar 5 gotas de cloreto de mercúrio 0,05%. Agitar e adicionar 3 mL de
tampão fosfato, contendo ureia. Misturar e aguardar 5 minutos. Observar se houve mudança de cor em
relação ao tubo A do item 2.2.
E. Especificidade da enzima
As enzimas diferem notavelmente dos catalisadores químicos comuns na sua especificidade

para substratos e eficiência catalítica. Especificidade é a habilidade da enzima de discriminar entre dois
substratos competidores. A maioria das enzimas só possui alguns substratos naturais, que são
convertidos em produtos simples numa velocidade muito alta. As estruturas dos sítios ativos das
enzimas são responsáveis por esta especificidade e permitem não apenas a ligação favorável de
substratos específicos como também rejeita a ligação de muitas substâncias que não são substratos.
Muitas enzimas apresentam especificidade absoluta para um único substrato. É o caso da succinato
desidrogenase e fumarase, que catalisam a conversão reversível do succinato em fumarato e deste a
malato, respectivamente. Outras enzimas possuem especificidade relativa, isto é, de maior amplitude,
como, por exemplo, a tripsina, que hidrolisa ligações peptídicas, amídicas ou ésteres formados pela
lisina ou arginina. Embora seja capaz de hidrolisar diferentes tipos de ligações, a tripsina possui
especificidade estrita para os grupos R da lisina e arginina. Para demonstrar a especificidade da urease
será utilizadas uma substância com estrutura similar a ureia: a tioureia.
Reagentes

Tampão fosfato 0,001 M pH 7,0 (contendo 1% de tiouréia)
Técnica
Em um tubo de ensaio, colocar 3 mL de tampão fosfato 0,001M pH 7,0 (contendo 1% de

tiouréia), 1 gota de vermelho de fenol e 2 gotas do extrato bruto.
Agitar e observar se há mudança de cor nos próximos 5 minutos, quando se compara com o
tubo A da atividade da enzima.
Ureia Tioureia
P á g i n a | 48
4.3 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO AMIDO
O processo de digestão consiste num conjunto de mecanismos pelos quais os

componentes dos alimentos são transformados em substâncias assimiláveis pelas células. Para que isso
se faça possível, o organismo conta com o auxílio de uma gama de enzimas, moléculas polipeptídicas
grandes que facilitam a síntese de outros tipos de moléculas biológicas.
A presença de um alimento na cavidade bucal, bem como sua visão e paladar, leva o
sistema nervoso a estimular as glândulas salivares a secretar a saliva, uma solução aquosa de
consistência viscosa que contem a enzima ptialina, ou amilase salivar, além de sais, muco e outras
substâncias. A ptialina é produzida pelas glândulas salivares parótidas e atua sobre as grandes
moléculas dos polissacarídeos amido e glicogênio do alimento, quebrando-as em fragmentos menores.
A ação dessa enzima depende de um pH ótimo, que é de aproximadamente 7,0 (neutro), e uma
temperatura ótima, de 37°C (entre 35°C e 40°C, ela ainda atua, abaixo de 35° ela se torna inativa e
acima de 40° sofre desnaturação).
Embora desempenhe um importante papel na digestão, a ptialina é a enzima de ação
menos significativa, uma vez que sua exposição ao substrato ocorre de forma muito rápida (tempo de
mastigação, que varia de acordo com os hábitos de cada indivíduo), e, ao ser deglutida juntamente com
o bolo alimentar, é inativada pelo meio fortemente ácido do estômago. Todas as moléculas de
polissacarídeos que não foram quebradas pela ptialina são sintetizadas no intestino, mais
especificamente, no duodeno (uma das três porções do intestino delgado) por outro tipo de enzima
denominada amilase pancreática. Daí a importância de se mastigar vagarosamente, pois assim, o
contato da ptialina com o polissacarídeo é prolongado e a sua ação é potencializada.
Essa enzima também é essencial ao combate natural de cáries dentárias. Os resíduos de
alimentos ricos em carboidratos que permanecem nos dentes após a mastigação propiciam o
crescimento de bactérias, que produzem ácidos capazes de corroer o esmalte dental, causando cáries.
A ptialina sintetiza os polissacarídeos desses resíduos, evitando que tais bactérias cresçam e se
multipliquem. É por isso que indivíduos que produzem um maior fluxo de saliva têm menor tendência a
desenvolver cáries dentárias.
Reagentes
Solução de amido 1%
Saliva
Solução de iodo (Lugol)
Reagente de Benedict: Sulfato de cobre .................... 17,3 g
Citrato de sódio ..................... 173 g
Carbonato de sódio ............... 100g
Água destilada q.s.p. ............. 1000 mL
Técnica
Coletar saliva em um béquer (no mínimo 2 mL). Fazer duas diluições nesta saliva, 1:2 e 1:5.
Preparar duas sequencias de 5 tubos de ensaio cada, uma para o teste de iodo e outra para o
teste de Benedict. Isso deverá ser feito para as duas diluições da saliva. No teste de iodo os 5 tubos
deverão conter: 10 mL de água destilada e 2 gotas do reagente de iodo (Lugol). Para o teste de Benedict
os tubos deverão conter 2 mL do reagente.
Preparar dois erlenmeyers de 125 mL colocando em cada um deles, 25 mL da solução de amido
1%. Acondicionar os erlenmeyers em banho-maria a 37°C por 5 minutos, para equilibrar a temperatura.
Após este tempo, fazer a primeira coleta da seguinte forma: pipetar 1 mL da amostra e colocar 0,5 mL
P á g i n a | 49
no tubo para o teste de iodo e 0,5 mL no outro tubo preparado para o teste de Benedict, este será
tempo zero. Para o teste de Benedict o tubo deverá ser aquecido em banho-maria fervente por 4
minutos para poder observar a formação do precipitado de óxido cuproso.
Em seguida adicionar 1,0 mL das duas diluições da saliva, uma em cada erlenmeyer. Após 5
minutos, proceder uma nova coleta de 1 mL da amostra, colocando 0,5 mL em um tubo para o teste do
iodo e 0,5 mL em um segundo tubo para o teste de Benedict. Repetir o procedimento nos tempos: 10,
15 e 25 minutos da adição das diluições da saliva.
Esquema operacional
Retirar uma alíquota

de 1 mL nos tempos:
0, 5, 10, 15, e 25
minutos.
0,5 mL 0,5 mL
25 mL de solução
de amido a 1%
Teste do Iodo: Teste de Benedict:
10 mL de H2O 2 mL do reagente.
+ 2 gotas de
Lugol.
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5. VITAMINAS
As vitaminas são moléculas orgânicas necessárias para o correto funcionamento do
metabolismo animal. Elas não são sintetizadas por estes organismos ou são sintetizadas em
quantidades inadequadas para atender as necessidades ideais, que são utilizadas para manter suas
funções vitais, consequentemente, as vitaminas devem ser obtidas através da dieta. Estes nutrientes
são de extrema importância para o bom funcionamento do nosso organismo, principalmente, porque
ajuda a evitar muitas doenças.
Grande parte das vitaminas funciona como coenzimas ou cofatores enzimáticos. Algumas
funcionam como hormônios (vitamina D) ou participam diretamente de catálises sem a ação de
proteínas (vitamina E).
As vitaminas são classificadas como hidrossolúveis ou lipossolúveis, de acordo com a sua
solubilidade. A carência de vitaminas provoca estados clínicos bem estabelecidos. Em muitos casos, a
ingestão excessiva destes micronutrientes também pode provocar doenças.
Vitamina C
A vitamina C, também denominada ácido ascórbico, é uma molécula utilizada na hidroxilação

de diversas reações químicas celulares, a principal delas é a hidroxilação do colágeno, proteína fibrosa
que dá resistência aos ossos, dentes, tendões e paredes dos vasos sanguíneos. É um poderoso
antioxidante, que ajuda a neutralizar radicais livres no corpo. Isto é importante porque o acúmulo de
radicais livres no organismo está associado ao envelhecimento.
Ela é hidrossolúvel, ou seja, o organismo utiliza a quantidade que necessita e elimina o
excedente; possui coloração branca e é inodora. Quando submetida a altas temperaturas, por um longo
período, é destruída.
Esta vitamina é encontrada em alimentos como frutas cítricas, morango, tomate, pimentão,
brócolis, couve-flor, batatas, batata-doce, goiaba, manga, alface, alho, rúcula, kiwi, entre outros.
Suas funções no organismo são variadas, sendo que: auxilia na resposta imunitária do
organismo; ajuda no crescimento saudável das células de ossos, dentes, gengiva, ligamentos e vasos
sanguíneos; auxilia na utilização eficiente do ferro; é importante para o funcionamento dos leucócitos
sanguíneos.
O resultado da falta prolongada de Vitamina C no organismo é a avitaminose denominada
escorbuto, no qual os sintomas apresentados pelos indivíduos acometidos são: hemorragias gengivais,
tumefação purulenta das gengivas, dores nas articulações, feridas que não cicatrizam e desestabilização
dentária.
Figura 5.1 Molécula do Ácido Ascórbico. Figura 5.2 Forma ionizada (Ascorbato)
P á g i n a | 51
Atividade Biológica
Nos valores de pH normalmente encontrados no meio intracelular, o ácido ascórbico (Fig. 5.1)
encontra-se predominantemente na sua forma ionizada, o ascorbato (Fig. 5.2). Como já foi citada, uma
das atividades mais importantes do ascorbato no organismo humano é na hidroxilação de resíduos de
prolina e colágeno. O colágeno, é uma proteína estrutural fundamental, que necessita ter resíduos de
prolina na forma de hidroxiprolina para manter uma estrutura tridimensional correta. A hidroxilação é
feita pela enzima prolil-4-hidroxilase; o ascorbato não intervém diretamente nesta hidroxilação, pelo
que se sabe é que ele é necessário para reduzir o íon Fe3+ que participa na catálise enzimática (nesta, o
íon passa do estado Fe2+ para Fe3+, sendo necessário o seu reestabelecimento para novo ciclo
catalítico). Em plantas, o ascorbato encontra-se em concentrações relativamente elevada (2 a 25 mM) e
atua na desintoxicação do peróxido de hidrogênio. A enzima ascorbato peroxidase catalisa a redução do
peróxido de hidrogênio a água, usando o ascorbato como agente redutor. Também é percursor dos íons
tartarato o oxalato.
Figura 5.3 Hidroxilação da prolina com a participação do ácido ascórbico, como redutor de ferro, na
formação do colágeno.
Quando introduzido na dieta humana em quantidades moderadas, pode:
 Favorecer a formação dos dentes e ossos;

 Ajudar a resistir às doenças;
 Prevenir gripes, fraquezas musculares e infecções. Este ponto é controverso, havendo estudos
que não mostram qualquer efeito, quando indivíduos sãos se submetem a doses aumentadas.
Contudo a ajuda a pacientes com escorbuto é indiscutível.
 Ajudar o sistema imunológico e a respiração celular, estimular as glândulas supra-renais e
proteger os vasos sanguíneos.
 Importante para o funcionamento adequado das células brancas do sangue. É eficaz contra
doenças infecciosas e um importante suplemento no caso de pacientes com câncer.
Todos estes efeitos da vitamina C são importantes para doentes onde se constata a deficiência
da mesma. Porém a vantagem para indivíduos saudáveis que comem frutas regularmente ou tomam
suplementos que contenham vitamina C, provavelmente seja mínima. A carência desta vitamina
provoca a avitaminose conhecida por escorbuto.
Necessidades Diárias
As NDRs (necessidades diárias recomendadas) de vitamina C para a maioria das pessoas com
idade igual ou superior a 15 anos, são de 60 mg por dia. Entre as pessoas que necessitam de maiores
quantidades de vitamina C estão as mulheres grávidas (70 mg), as lactantes (90 a 95 mg) e os fumantes
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(pelo menos 100 mg). Como a vitamina C não pode ser armazenada no organismo, é importante fazer a
sua reposição, ingerindo as quantidades diárias recomendadas.
Quanto mais melhor?

Algumas pessoas tomam grandes quantidades de suplementos vitamínicos porque acreditam
que podem evitar algumas doenças, como resfriados. Entretanto essas suposições não possuem
comprovações científicas. Ingerir quantidades excessivas de vitamina C (mais do que 100 mg/dia) pode
causar náuseas, cólicas estomacais, diarreias e, possivelmente, cálculos renais.
Fontes Alimentares
Morangos (uma xícara) 95 mg

Mamão (uma xícara) 85 mg
Kiwi (um, médio) 75 mg
Laranja (uma, média) 70 mg
Suco de laranja (1/2 xícara) 50 mg
Manga (uma xícara) 45 mg
Pimentão vermelho ou verde (1/2 xícara, cru ou cozido) 65-50 mg
Brócolis (1/2 xícara, cozido) 60 mg
Couve (1/2 xícara, cozida) 55 mg
Ervilhas (1/2 xícara, cozidas, frescas ou congeladas) 50-20 mg
Batata (uma média, assada) 25 mg
Dosagem de vitamina C por volumetria de óxido-redução
A titulometria de óxido redução envolve reações em que ocorre transferência de elétrons.

A análise de ácido ascórbico normalmente é realizada através de reação com um agente
oxidante, a qual deve ser realizada o mais rapidamente possível, visto que o ácido é facilmente oxidado
pelo próprio oxigênio do ar, formando ácido dihidroascórbico.
A semi-reação de oxidação do ácido ascórbico é a seguinte:
OH HO
HO O O O
O + 2H + + 2e -
O OH
HO OH OH
OH
Ácido ascórbico Ácido dehidroascórbico
Existem vários agentes oxidantes que podem ser empregados na determinação de vitamina C,
sendo que um dos mais simples é o iodo. O iodo é um agente oxidante moderado capaz de oxidar
quantitativamente apenas substâncias fortemente redutoras.
A análise volumétrica na qual o iodo é empregado como titulante chama-se iodimetria ou
titulação iodométrica direta.
A semi-reação de redução do iodo é a seguinte:
I2(s) + 2e- 2I-
No entanto, a titulação empregando solução de iodo como titulante apresenta algumas

dificuldades: perda de iodo por volatilização, necessidade de padronização da solução e realização da
P á g i n a | 53
análise o mais rapidamente possível. Uma alternativa é adicionar excesso de íons iodeto à solução de
iodo. Forma-se o triideto,
I2 + I- I3-
que também é um agente oxidante semelhante ao iodo:
I3- + 2e- 3I-
Como a titulação ocorre em meio ácido, o equilíbrio da reação de oxidação do ácido ácórbico a
dehidroascórbico é deslocado no sentido da formação da vitamina C, o que diminui a oxidação da
mesma pelo oxigênio do ar durante a titulação.
O ponto final na iodimetria é detectado utilizando-se amido como indicador. A amilose do
amido reage com o iodo, em presença de iodeto, formando um complexo azul escuro, observável em
concentrações mínimas de iodo.
amilose + I3- complexo azul escuro
A ação redutora do ácido ascórbico serve de base para a determinação química do composto.
Na maioria dos tecidos animais e vegetais, esta é a única substância que apresenta ação redutora em
solução ácida.
5.1 Parte Experimental
Reagentes
Solução padrão de ácido ascórbico 100 mg%

Solução de amido 1 g%
Solução de ácido sulfúrico 10%
Solução de iodo 0,1 M
Redoxon gotas (200 mg/mL)
Sucos vegetais
Técnica
Titulação do padrão
Com o uso de uma proveta, transferir 25 mL de uma solução de ácido ascórbico 100 mg% para
um erlenmeyer de 125 mL. Adicionar 10 mL de ácido sulfúrico 10% e 0,5 mL de uma solução de amido
1%. Titular com uma solução de iodo 0,1 M.
Titulação do Redoxon
Transferir 25 mL da solução de Redoxon (diluída 100 vezes) para um erlenmeyer de 125 mL.
Adicionar 10 mL de ácido sulfúrico 10%. Titular com iodo 0,1 M usando 0,5 mL da solução de amido 1%
como indicador. Titular com uma solução de iodo 0,1 M.
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Titulação das Amostras
Transferir 25 mL de cada amostra para um erlenmeyer de 125 mL. Adicionar 10 mL de ácido

sulfúrico 10%. Titular com iodo 0,1 M usando 0,5 mL da solução de amido 1% como indicador. Titular
com uma solução de iodo 0,1 M.
Observação
Necessidade diária = 30-100 mg

Deficiência: escorbuto
1 mL de iodo 0,1 N equivale a 8,806 mg de ácido ascórbico.
O peso molecular do ácido ascórbico é 176,13 g.
Cálculos
1 mL de iodo 0,1 M equivale a 8,806 mg de ácido ascórbico

X mL de iodo 0,1 M ........................ mg de ácido ascórbico
A relação acima foi encontrada pelo volume de iodo gasto na titulação.

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6. CARBOIDRATOS
Os carboidratos também podem ser chamados de glicídios, glucídios, hidratos de carbono ou
açúcares. São formados fundamentalmente por moléculas de carbono (C), hidrogênio (H) e oxigênio
(O), por isso recém a denominação de hidratos de carbono. Alguns carboidratos podem possuir outros
tipos de átomos em suas moléculas, como é o caso da quitina, que possui átomos de nitrogênio em sua
fórmula. Estão relacionados com o fornecimento de energia imediata para a célula e estão presentes
em diversos tipos de alimentos. Os carboidratos são também, os principais produtos da fotossíntese.
Além de função energética, também possuem uma função estrutural, atuando como o
esqueleto de alguns tipos de células, como por exemplo, a celulose e a quitina, que fazem parte do
esqueleto vegetal e animal, respectivamente. Os carboidratos participam das estruturas dos ácidos
nucléicos (RNA e DNA), sob a forma de ribose e desoxirribose, que são monossacarídeos com 5 átomos
de carbono em sua fórmula.
O amido, um tipo de polissacarídeo energético, é a principal substância de reserva energética
em plantas e fungos. Os seres humanos também possuem uma substância de reserva energética, que é
um polissacarídeo chamado glicogênio. Ele fica armazenado no fígado e nos músculos e quando o corpo
necessita de energia, esse glicogênio é hidrolisado em moléculas de glicose, que são carboidratos mais
simples, com apenas 6 átomos de carbono.
O glicogênio é resultado da união de milhares de moléculas de glicose, assim como a celulose.
Os carboidratos são substâncias extremamente importantes para a vida, e sua principal fonte são os
vegetais, que os produzem pelo processo da fotossíntese. Os vegetais absorvem a energia solar e a
transforma em energia química, produzindo glicídios. E é desses glicídios que todos os outros seres
vivos dependem para sobreviver. Essa energia é passada para os níveis tróficos seguintes. Os herbívoros
obtêm essa energia se alimentado de vegetais. Essa energia é passada para o nível seguinte, pois os
carnívoros se alimentam dos herbívoros e assim por diante.
Classificação dos carboidratos
Uma classificação simplificada dos carboidratos, ou glicídios, consiste em dividi-los e três

categorias principais: monossacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos.
Os monossacarídeos são carboidratos simples, de formula molecular (CH2O)n, onde n é no
mínimo 3 e no máximo 8. São os verdadeiros açucares solúveis em água e, de modo geral, de sabor
adocicado. Os de menor número de átomos de carbono são as trioses (contêm três átomos de
carbono). Os biologicamente mais conhecidos são os formados por cinco átomos de carbonos
(chamados de pentoses) e os formados por seis átomos de carbono (hexoses).
Oligossacarídeos são açucares, formados pela união de dois a seis monossacarídeos,
geralmente hexoses. O prefixo oligo deriva do grego e quer dizer pouco. Os oligossacarídeos mais
importantes são os dissacarídeos.
Os polissacarídeos como o nome sugere (poli é um termo derivado do grego e quer dizer
muitos), são compostos macromoleculares (moléculas gigantes), formadas pela união de muitos
(centenas) monossacarídeos. Os três polissacarídeos mais conhecidos dos seres vivos são amido,
glicogênio e celulose.
P á g i n a | 56
6.1 REAÇÕES QUALITATIVAS PARA CARACTERIZAÇÃO DE CARBOIDRATOS
6.1.1 Reação de Molisch
Os carboidratos mais importantes são os formados por cinco ou seis átomos de carbono
(pentoses e hexoses, respectivamente). Por serem moléculas muito ricas em grupamentos hidroxila
(OH-), os monossacarídeos podem ser facilmente desidratados por ação de ácidos fortes concentrados,
como ácido sulfúrico (H2SO4). O ácido rompe as ligações glicosídicas presentes em moléculas de
polissacarídeos, quebrando-os, fornecendo seus monossacarídeos e esses, por sua vez, são
desidratados.
A desidratação de monossacarídeos causada pelos ácidos concentrados, levando a formação de
pentoses que gera como produto final o furfural, e as hexoses o hidroximetilfurfural (HMF). Tanto o
furfural quanto o HMF são substâncias incolores, impedindo que a reação seja visualizada. Para resolver
esse problema, adiciona-se um composto fenólico ao meio (α-naftol, conhecido como reativo de
Molisch). O fenol reage como os produtos incolores, e provoca o aparecimento de um anel de
coloração lilás.
Se um oligossacarídeo ou polissacarídeo estiver presente, ele é primeiro hidrolisado em seus
monossacarídeos constituintes, para só então serem desidratados.
Essa reação é considerada geral para todos os carboidratos, e não é específica, pois se processa
com outras substâncias. A reação negativa indica ausência de carboidratos.
Reagentes
Reagente de Molisch: alfa-naftol .................... 5 g

Alcool etílico ................ 100 mL
Ácido sulfúrico concentrado
Soluções de carboidratos.
Técnica
Em 4 tubos de ensaio identificados, colocar:

Tubo 1: 2 mL de solução de glicose 1%
Tubo 2: 2 mL de solução de sacarose 1%
Tubo 3: 2 mL de solução de amido 1%
Tubo 4: 2 mL de solução de água
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A cada tubo, adicionar 2 gotas do reagente de Molisch. Misturar. Inclinar o tubo e deixar
escorrer lentamente, pela parede, 2 mL de ácido sulfúrico (de boa qualidade). Caso a reação seja
positiva, na interface da solução haverá a formação de um anel púrpura, resultante da condensação do
furfural ou do hidroximetil furfural com -naftol.
6.1.2 Reação de Seliwanoff
Essa prática segue os mesmos princípios teóricos que embasam a reação de Molisch, onde há
formação de furfural e hidroximetilfurfural (HMF). Como vimos esses dois produtos, isoladamente, são
incolores. Assim, adiciona-se um composto fenólico ao meio para que seja desenvolvida coloração
visível (nesse caso, vermelha). A reação de Seliwanoff só diferencia-se da reação de Molisch nos
reagentes utilizados: o ácido que causará a desidratação do carboidrato é o ácido clorídrico (HCl) e o
fenol que reage como o furfural e HMF é o resorcinol.
Esse teste permite diferenciar aldoses de cetoses porque a reação com a cetose é mais rápida e
mais intensa. Isso porque a formação do furfural é mais fácil que a formação do hidroximetilfurfural,
portamto, distingue cetoses de aldoses. As cetoses são desidratadas mais rapidamente que as aldoses
dando furfural e seus derivados, os quais se condensam com resorcinol formando um complexo de cor
avermelhada.
Reagentes
Solução de frutose 1%
Solução de glicose 1%
Ácido clorídrico 8 N
Reagente de Seliwanoff: 0,5 g de resorcinol em 100 mL de etanol.
Técnica

Tubo 1: 1 mL de solução de frutose 1%
A cada tubo, adicionar 3 mL de ácido clorídrico 8 N e 1 mL do reagente de Selivanoff. Aquecer

os tubos em banho-maria fervente por 1 minuto. Caso a reação seja positiva, será observada cor
vermelha.
6.1.3 Reação de Bial
O teste de Bial é uma reação de identificação para carboidratos que contenham pentoses.
Pentoses, quando aquecidas com ácido clorídrico concentrado, produzem furfural. Este se condensa
com o orcinol resultando em um complexo de cor verde. A reação não é específica para pentoses já que
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o aquecimento prolongado de algumas hexoses, com estes reagentes, resulta também em produtos
coloridos. Porém, o tempo de aquecimento ajuda a distinguir pentoses de hexoses.
Reagentes
Ácido clorídrico concentrado
Solução de xilose 1%
Solução de glicose 1%
Reagente de Bial: orcinol ................................ 1,0 g
HCl concentrado ............... 500 mL
Cloreto férrico 10% ........... 3 mL
Técnica

Tubo 2: 1 mL de solução de xilose 1%
A cada tubo acrescentar 10 gotas de reagente de Bial e 1 mL de ácido clorídrico

concentrado. Misturar. Aquecer em banho-maria fervente por 2 minutos e observar o aparecimento de
cor verde, caso a reação seja positiva.
6.1.4 Reação com o Iodo
Polissacarídeos são moléculas de elevado peso molecular, cuja unidade fundamental são
os monossacarídeos, principalmente a glicose. Como exemplos de polissacarídeos importantes na
natureza podemos destacar o glicogênio, a celulose e o amido.
O amido, polissacarídeo de extrema importância em alimentos, é produzido em
grande quantidade nas folhas dos vegetais como forma de armazenamento dos produtos da
fotossíntese, e é constituído por dois outros polissacarídeos estruturalmente diferentes: amilose e
amilopectina.
Figura 6.1 Fórmula estrutural da amilose Figura 6.2 Conformação espacial da amilose
P á g i n a | 59
A molécula da amilose não apresenta ramificações e, no espaço, assume conformação

helicoidal (forma de hélice). A ligação entre os átomos de carbono das unidades de glicose são do tipo
alfa 1-4.
A amilopectina apresenta estrutura ramificada, sendo que os "ramos" aparecem a cada 24-30
moléculas de glicose. A ligação entre as unidades de glicose também é do tipo alfa 1-4 na mesma
cadeia. Porém, unindo duas cadeias aparecem ligações do tipo a 1-6. Observe a figura:
Figura 6.3 Fómula estrutural da amilopctina.
Moléculas de alto peso molecular (como a amilose e a amilopectina) podem sofrer reações de
complexação, com formação de compostos coloridos. Um exemplo importante é a complexação da
amilose e da amilopectina com o iodo, resultando em complexo azul e vermelho-violáceo,
respectivamente. A figura abaixo esquematiza a interação do iodo com a estrutura do amido:
Figura 6.4 Esquema do complexo formado: Iodo/Amilose/Amilopectina.
O complexo esquematizado ao lado apresenta coloração azul intensa, desenvolvida pela

oclusão (aprisionamento) do iodo nas cadeias lineares da amilose. Este aprisionamento do iodo
acontece no interior da hélice formada pela amilose. Como a amilopectina não apresenta estrutura
helicoidal, devido à presença das ramificações, a interação com o iodo será menor, e a coloração menos
intensa.
IMPORTANTE - nem todos os polissacarídeos, apesar de serem moléculas grandes, dão complexo
colorido com o iodo. Isso porque é necessário que a molécula apresente uma conformação que propicie
o "encaixe" do iodo. A celulose é um exemplo de polissacarídeo que não dá reação colorida com o iodo.
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Reagentes
Solução de lugol: Iodo ................................ 0, 5 g
Iodeto de potássio ......... 1,0 g
Água destilada q.s.p ....... 100 mL
Técnica

Tubo 2: 2 mL de água destilada
A cada tubo adicionar 2 gotas de lugol e observar o aparecimento de cor. Aquecer em bico de
Bunsen o tubo 1. Observar. Resfriar os tubos em água corrente. Observar o resultado.
6.1.5 Reação de Fehling
Se observarmos com mais atenção as moléculas dos carboidratos, veremos que alguns possuem
um grupamento -OH (hidroxila) livre no carbono 1 de suas moléculas, enquanto outros não.
Os açúcares que apresentam a hidroxila livre no C-1 são bons agentes redutores. Por esse
motivo a extremidade que contém o -OH passa a ser chamada extremidade redutora e o açúcar, de
AÇÚCAR REDUTOR. Essa capacidade que alguns carboidratos apresentam de reduzir íons metálicos (Cu,
Bi, Hg, Fe, Ag), quando em soluções alcalinas é um bom método de identificação desses compostos.
O Reativo de Fehling é constituído de solução de sulfato de cobre (Solução de Fehling A) e
tartarato duplo de sódio e potássio em meio fortemente alcalino (Solução de Fehling B). O sulfato de
cobre, em meio alcalino, forma hidróxido cúprico. O tartarato duplo de sódio e potássio complexa-se
com os íons Cu++ , não ocorrendo a precipitação do hidróxido cúprico. O carboidrato redutor, na
presença do reativo de Fehling, é oxidado a ácido do carboidrato e o cobre é reduzido a óxido cuproso,
que pode ser evidenciado pela presença de um precipitado vermelho tijolo. O ácido é, em seguida,
salificado pela base alcalina.
A quantidade de Cu++ reduzido a Cu+ é proporcional à quantidade de carboidrato redutor
presente na amostra.
Reagente de Fehling
Solução A: Sulfato de cobre cristalizado ......... 35 g

água destilada ................................ 1000 mL
Solução B: tartarato duplo de Na e K .............. 173 g

hidróxido de potássio .................... 120 g
água destilada ................................ 1000 mL
No momento do uso, misturar partes iguais das duas soluções. Proceder uma ebulição
prévia para verificar se há ou não redução do próprio reagente.
Técnica
Tubo 2: 2 mL de solução de lactose 1%
Tubo 3: 2 mL de solução de sacarose 1%
P á g i n a | 61
A cada tubo, adicionar 1 mL do reagente de Fehling A e 1 mL do reagente de Fehling B.

Misturar e aquecer em banho-maria por 1 minuto. A reação é positiva quando ocorre a formação de um
precipitado avermelhado de óxido cuproso.
6.1.6 Reação de Barfoed
O reagente de Barfoed é uma solução fracamente ácida de CuSO4 e permite distinguir

qualitativamente monossacarídeos de dissacarídeos redutores, pela velocidade com que se forma óxido
cuproso a partir da reação entre o acetato cúprico e o carboidrato. Os dissacarídeos com um grupo
aldeídico livre darão redução somente depois de prolongado aquecimento com o reagente, enquanto
que os monossacarídeos reagem quase que instantaneamente.
Reagentes
Soluções de carboidratos (glicose, frutose, lactose e sacarose) 1%.

Reagente de Barfoed: Acetato de cobre ............... 13,3 g
Ácido acético glacial ......... 1,8 mL
Água destilada .................. 200 mL
Técnica

Tubo 2: 2 mL de solução de frutose 1%
Tubo 3: 2 mL de solução de lactose 1%
Tubo 4: 2 mL de solução de sacarose 1%.
A cada tubo adicionar, 2 mL de reagente de Barfoed. Aquecer em banho-maria por 2

minutos. Sob estas condições, somente os monossacarídeos darão reação positiva com formação de
óxido cuproso.
P á g i n a | 62
6.1.7 MARCHA ANALÍTICA PARA A IDENTIFICAÇÃO DE CARBOIDRATOS
Caracterização de pentoses e hexoses em uma solução desconhecida
A análise de carboidratos em uma solução desconhecida pode ser levada a efeito pela
combinação e pela interpretação dos testes aplicados anteriormente.
Serão utilizados, nesta etapa, os desconhecidos A e B sendo que o objetivo proposto será o de
identificar os possíveis açúcares presentes nas amostras.
Reação de Molisch
Em um tubo de ensaio, colocar 2 mL da amostra e 2 gotas do reagente de Molisch. Inclinando o

tubo, escorrer lentamente, pela parede, 2 mL de ácido sulfúrico concentrado. A presença de um anel
colorido indica que a amostra contém carboidratos.
Reação com o Iodo
Em um tubo de ensaio, pipetar 2 mL da amostra e adicionar 2 gotas da solução de iodo.

Observar o aparecimento ou não de cor. Caso a reação seja negativa, realizar teste para caracterizar
açúcares redutores.
Reação de Fehling
Em um tubo de ensaio, pipetar 2 mL da amostra e 2 mL do reagente de Fehling (1 mL de A + 1

mL de B). Misturar e aquecer em banho-maria fervente por 1 minuto. Observar se ocorre ou não a
formação de óxido cuproso. Caso a reação seja positiva, diferenciar monossacarídeos de dissacarídeos.
Reação de Barfoed
Em um tubo de ensaio pipetar 2 mL de amostra e adicionar 2 mL do reagente de Barfoed.

Aquecer em banho-maria fervente por 2 minutos e observar o aparecimento de óxido cuproso. Caso
isso ocorra, realizar teste para verificar a presença de frutose na solução.
Reação de Selivanoff
Em um tubo de ensaio pipetar 1 mL da amostra, 3 mL de ácido clorídrico 8 N e 1 mL do

reagente de Selivanoff. Aquecer em banho-maria fervente por 1 minuto. O aparecimento de cor
vermelha indica a presença de cetoses. Caso a reação seja negativa, realizar teste de caracterização de
pentoses em geral.
Reação de Bial
Em um tubo de ensaio pipetar 1 mL da amostra, juntando a seguir 10 gotas do reagente de Bial

e 1 mL de ácido clorídrico concentrado. Aquecer em banho-maria fervente por 2 minutos. O
aparecimento de cor verde indica reação positiva para pentoses.
P á g i n a | 63
Esquema operacional completo para identificação de carboidratos:
Amostra
Ausência de (-) (+)

carboidratos
Iodo
Incolor Cor Polissacarídeo
Fehling
(+) (-) Açúcar não redutor
Barfoed
(+) (-) Ausência de

monossacarídeo
Seliwanoff
(-) (+) Cetose
Bial
(+) (-) Hexose
Pentose
P á g i n a | 64
6.2 HIDRÓLISE ÁCIDA DO AMIDO
Quando uma solução de amido, em presença de ácido clorídrico, é aquecida ocorre o

rompimento das ligações glicosídicas com a conseqüente liberação de fragmentos de polissacarídeos. A
extensão da hidrólise é função da concentração do ácido, do tempo e da temperatura. Durante a
hidrólise ocorre a formação de dextrinas, oligossacarídeos e glicose livre.
A reação de hidrólise pode ser acompanhada pelo desaparecimento do amido, através da
reação do iodo ou pela produção de açúcares redutores, através da reação de Benedict. O reagente de
Benedict, fortemente alcalino, possibilita a formação de um complexo íon cúprico-citrato. Nestas
condições, o cobre é reduzido por ação de açúcares redutores, formando-se óxido cuproso.
Dependendo da quantidade de açúcares redutores no meio de reação, a cor resultante pode variar do
verde-amarelado ao marron-avermelhado. Esta reação segue o mesmo princípio da reação de Fehling.
Reagentes
Solução de lugol
Reagente de Benedict: Sulfato de cobre .............. 17,3 g
Citrato de sódio .............. 173 g
Carbonato de sódio ......... 100 g
Água destilada q.s.p ........ 1000 mL
Técnica
Em um erlenmeyer de 125 mL pipetar 25 mL da solução de amido 1%. Acondicionar o

erlenmeyer em banho-maria fervente por 5 minutos, para equilibrar a temperatura. Após este tempo,
fazer a coleta do tempo zero da seguinte maneira: coletar 1 mL da amostra que está no erlenmeyer,
colocando 0,5 mL em um tubo para o teste do iodo e 0,5 mL em um segundo tubo para o teste de
Benedict. Em seguida adicionar 1,0 mL de ácido clorídrico concentrado. Após 5 minutos, proceder nova
coleta seguindo o mesmo procedimento do tempo zero. Repetir o procedimento nos tempos: 10, 15 e
25 minutos da adição do ácido clorídrico.
Teste do Iodo
A 0,5 mL da amostra, acrescentar 2 gotas de lugol e 10 mL de água destilada. Observar.
Teste de Benedict
A 0,5 mL da amostra, acrescentar 2 mL do reagente de Benedict e aquecer em banho-maria

fervente por 4 minutos Observar a formação de precipitado de óxido cuproso.
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Esquema Operacional
Retirar uma alíquota
de 1 mL nos tempos:
0, 5, 10, 15, e 25
minutos.
0,5 mL 0,5 mL
25 mL de solução de
amido a 1% + 1 mL
de HCl
Teste do Iodo: Teste de Benedict:
10 mL de H2O 2 mL do reagente.
+ 2 gotas de
Lugol.
P á g i n a | 66
6.3 DIÁLISE
A diálise é uma técnica usada para a separação tanto de moléculas grandes como de moléculas
pequenas, e depende do fato de que moléculas pequenas (peso molecular até 15.000) passam
livremente através de uma membrana, enquanto que as moléculas grandes (de peso molecular mais
elevado) ficam retidas. Cientificamente, esta ponderação é muito simplificada, porque tanto grupos
específicos como cargas existentes nas moléculas afetam a velocidade de difusão, particularmente com
moléculas de tamanho intermediário.
A velocidade da diálise também sofre influência pela temperatura, de tal forma que quanto
mais elevada for a temperatura, maior será a velocidade da diálise. Em temperaturas elevadas, a
viscosidade do solvente é menor e a velocidade de difusão é aumentada. Por outro lado, muitas
moléculas são sensíveis à temperatura. Desta forma, a diálise de enzimas é geralmente executada em
geladeiras.
O solvente afeta a velocidade de diálise de diversas formas, necessitando, portanto, de escolha
cuidadosa. Em geral, a velocidade de diálise é maior usando água como solvente, mas um controle
cuidadoso da força iônica e pH são freqüentemente necessários para estabilizar as moléculas sob
investigação.
A presença de sais reduz a velocidade de diálise, provavelmente, por alterar a forma e a carga
da molécula.
Qualquer reagente no solvente que possa desnaturar as moléculas também pode reduzir
consideravelmente a velocidade de diálise. As membranas mais primitivas usadas para diálise são as
tripas de porco ou o colódio. Atualmente também são usadas membranas de celofane.
Os tubos (sacos ou membranas), recomendados para o experimento a seguir, são feitos pela
Union Carbide e fornecidos em diferentes tamanhos e texturas. Um tubo de comprimento considerado
suficiente é cortado e embebido em água sendo que uma das extremidades é amarrada com um nó. O
material a ser dialisado é colocado no interior do saco e a sua extremidade superior é amarrada ou
presa por grampo ou pinça. A seguir, o material é submetido a diálise. Após ter sido usado, o saco de
diálise pode ser reutilizado sendo, no entanto, susceptível ao ataque de microorganismos. Deste modo,
deve ser conservado em água contendo traços de ácido benzóico.
Existem inúmeros exemplos de procedimento para isolamento bioquímico onde a concentração
de sais ou outros materiais de baixo peso molecular devem ser retidos ou diminuídos antes de executar
novo estágio da separação. Em tais casos a diálise é o método mais conveniente.
O saco de diálise contendo a mistura é colocado em um grande recipiente (béquer, cuba etc.),
contendo água ou solução tampão, e submetido à agitação magnética. No caso de proteínas, ou outras
moléculas sensíveis, o sistema todo é colocado em geladeira ou câmara fria.
O saco de diálise deve estar completamente cheio, caso contrário, a água penetra para o seu
interior, por osmose, causando aumento do volume. Isto é, em geral, indesejável e deve ser evitado.
O amido é constituído por amilose e amilopectina, cujos pesos moleculares são de até 500.000
e 1000.000, respectivamente. Devido aos seus altos pesos moleculares estes compostos não passam
através da membrana do saco de diálise.
As amilases são enzimas que ocorrem na saliva e no pâncreas. Hidrolisam ligações glicosídicas
do tipo (14). Atuam no meio da macromolécula, produzindo, na clivagem inicial, oligossacarídeos de
seis ou sete unidades de glicose, que posteriormente são degradados à maltotriose e maltose. A ação
prolongada da -amilase salivar sobre a maltotriose produz maltose e glicose livre.
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Maltotriose
Amilose e/ou α-amilase salivar
+
Oligossacarídeos + Maltose
Amilopectina
37° C +
Glicose
O curso da reação pode ser acompanhado pela degradação dos polissacarídeos (reação com o
iodo) ou pelo aumento do poder redutor (reações com a antrona ou reagente de Benedict).
O reagente da Antrona contém antranol em meio de H2SO4 concentrado. O calor liberado pela
diluição do H2SO4 é suficiente para que ocorra a reação. No caso de oligo e polissacarídeo, o H2SO4 atua
como catalisador de hidrólise convertendo-os a monossacarídeos (hexoses e pentoses) e também atua
como agente desidratante levando à formação de hidroximetilfurfural e furfural que, em presença de
Antranol, dão produtos de condensação coloridos.
Reagentes
Cloreto de sódio 0,1%, tamponado com tampão fosfato 0,02 M pH 6,8
Amido solúvel 2%
Saliva
Solução de iodo 0,05 N em 3% KI, contendo ácido tricloroacético 5%
Reagente de antrona: solução de antrona 0,2% em ácido sulfúrico concentrado (conservar
na geladeira)
Técnica
- Preparar 7 tubos de ensaio contendo 4 gotas de iodo e 3 mL de água, para efetuar o teste
com o iodo. Para o teste com antrona preparar 7 tubos de ensaio contendo 2 mL de reagente de
antrona em cada um deles.
- Preparar dois cálices contendo 50 mL de solução tampão em cada um. Preparar dois
sacos de diálise, contendo 5 mL de solução de amido e 4 mL de solução tampão e colocá-los em cada
um dos respectivos cálices. Identificá-los como controle (C) e amostra (A).
P á g i n a | 68
- A seguir adicionar 1 mL de água no controle (C) e 1 mL de saliva na amostra (A).

Homogeneizar e imediatamente retirar 1 mL de dentro do saco de diálise, para o teste do iodo e 1 mL
de fora, tanto no controle como na amostra. Este é o tempo zero. Fechar os sacos com prendedores e
colocá-los nos respectivos cálices. A partir daí, nos tempos 5, 10 e 15 minutos, retirar 1 mL de dentro do
saco de diálise para o teste do iodo e 1 mL de fora (dialisado) para o teste de antrona apenas no cálice
referente à amostra (A). Decorridos 20 minutos, repetir o procedimento anterior, inclusive no cálice
referente ao controle (C).
Analisar os resultados obtidos.
3. Esquema operacional
TEMPO CONTOLE (C) AMOSTRA (A)

(minutos)
TESTE DO IODO TESTE DE ANTRONA TESTE DO TESTE DE
IODO ANTRONA
0    
5  
10  
15  
20    
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7. LIPÍDEOS
Lipídeos e substâncias com eles relacionadas, bem como as lipoproteínas, incluem uma
variedade de compostos de significado bioquímico. Constituem diversas substâncias cujas
características comuns são a sua insolubilidade em água e solubilidade em solventes orgânicos tais
como: clorofórmio, benzeno, éter e acetona e ainda o fato de, em muitos casos, possuírem um ou mais
ácidos graxos na molécula.
A grande maioria dos lipídeos apresenta ácidos graxos esterificados em sua estrutura,
abrangendo os acilgliceróis ou glicerídeos, os cerídeos, os fosfolipídeos, esfingolipídeos e os
glicolipídeos. Assim, os lipídeos podem ser classificados de várias maneiras. A classificação mais
satisfatória baseia-se, portanto, nas estruturas de seus esqueletos.
Pode-se considerar 3 classes de lipídeos: lipídeos de reserva, lipídeos estruturais e lipídeos com
atividades biológicas essenciais e específicas. É o caso dos terpenos e esteróides que ocorrem em
quantidades muito menores que os demais, nas células e tecidos, mas incluem substâncias importantes
biologicamente como hormônios e vitaminas. Lipídeos de membrana representam 5 a 10% da massa
seca da maioria das células, e lipídeos de reserva mais de 50% da massa de um adipócito.
Ácidos Graxos
Os ácidos graxos de gorduras naturais, (animal ou vegetal) possuem uma cadeia carbônica com
um grupo terminal carboxila, podendo ter de quatro a vinte e quatro átomos de carbono, sendo a
quase totalidade de número par e os mais amplamente distribuídos com 16 e 18 átomos. Podem ser
saturados, monoinsaturados ou poliinsaturados. Ácidos graxos saturados possuem todos os carbonos
da cadeia ligados entre si por ligações simples. Os monoinsaturados possuem uma dupla ligação, e os
poli-insaturados podem ter de duas a seis duplas ligações.
São chamados de ácidos graxos, ácidos carboxílicos que possuem cadeia carbônica longa. Além disso, a
grande maioria dos ácidos graxos naturais não apresentam ramificações e contêm um número par de
carbonos devido à rota bioquímica de síntese. Os ácidos graxos diferem entre si pelo número de
carbonos e também pelo número de insaturações.
(a) (b)
Figura 7.1 Estrutura molecular de ácidos graxos Saturados (a) e insaturados (b).
P á g i n a | 70
Tabela 7.1 Composição de alguns óleos vegetais quantos aos ácidos graxos.
Óleo (% de ácido graxo)
Ácido graxo
(N° de Carbono e Soja Oliva Milho Girassol Canola
de insaturação)
C < 14 <0,1 - <0,3 <0,4 -
C 14:0 Mirístico <0,5 0,05 <0,1 <0,5 <0,2
C 16:0 Palmítico 7,0 – 14,0 4,5 – 20,0 9,0 – 14,0 3,0 – 10,0 2,6 – 6,0
C 16:1 Palmitoléico <0,5 0,3 – 3,5 <0,5 <1,0 <0,6
C 18:0 Esteárico 1,4 – 5,5 0,5 – 5,0 0,5 – 4,0 1,0 – 10,0 0,5 – 3,0
C 18:1 Oléico 19,0 – 30,0 55,0 – 83,0 24,0 – 42,0 14,0 – 35,0 53,0 – 70,0
C 18:2 Linoleico 44,0 – 62,0 3,5 – 21,0 34,0 – 62,0 55,0 – 75,0 15,0 – 30,0
C 18:3 Linolênico 4,0 – 11,0 0,9 <2,0 <0,3 5,0 – 13,0
C 20:0 Araquídico <1,0 0,6 <1,0 <1,5 0,1 – 1,2
C 20:1 Eicosenóico <1,0 0,4 <0,5 <0,5 0,1 – 4,3
C 22:0 Behênico <0,5 0,2 <0,5 <1,0 <0,6
C 24:0 Lignocérico - 0,2 <0,5 <0,5 -
*Fonte: Anvisa
ÍNDICES DE SAPONIFICAÇÃO E DE IODO
7.1 ÍNDICE DE SAPONIFICAÇÃO
O índice de saponificação de uma gordura é definido como o número que representa

miligramas de KOH necessários para converter os ácidos graxos de 1g de gordura em sabão. Assim,
procedendo-se a saponificação de uma quantidade conhecida de uma gordura ou óleo com um excesso
conhecido de solução padrão de KOH, e medindo-se (por titulação) o quanto de base não foi utilizado,
conseguindo-se calcular o quanto foi gasto na formação do sabão.
O índice de saponificação fornece a indicação do comprimento médio de resíduos de ácidos
graxos. Portanto, se este índice é baixo, o comprimento médio da cadeia e o peso molecular dos ácidos
graxos presentes devem ser elevados. Por outro lado, se o índice é alto, muitas moléculas de sabão
devem ter sido produzidas a partir de 1 grama de gordura ou óleo, e o comprimento médio e o peso
molecular dos ácidos graxos presentes devem ser baixos. Comparando-se o índice de saponificação da
triestearina (p.m. = 891) com o da tributirina (p.m. = 302), tem-se que será maior no triglicerídeo de
menor peso molecular. A propósito, este índice, para a tributirina, é cerca de 3 vezes maior (= 557 mg
de KOH) que o da triestearina (= 198 mg de KOH).
100°C
Figura 7.2 Reação de saponificação.

P á g i n a | 71
Reagentes
Solução alcoólica de KOH 0,3 M

Ácido clorídrico 0,5 N (rigorosamente titulado)
Solução alcoólica de fenolftaleína 1%.
Óleo vegetal.
Técnica
Colocar em um erlenmeyer de 25 mL, 200 mg de óleo e 5 mL de potassa alcoólica. Usar um

pedaço de papel alumínio para tampar a boca do erlenmeyer e colocar em banho-maria fervente por 15
minutos. Se o álcool evaporar, adicionar mais etanol puro. Retirar do banho-maria, resfriar e titular com
ácido clorídrico 0,5 N usando 2 gotas de fenolftaleína como indicador (Va).
Paralelamente, realizar uma prova em branco (5 mL de KOH) e titular da mesma maneira (Vb).
Cálculo do índice de saponificação
Para obter-se o índice de saponificação, considerar que 1 mL de ácido clorídrico 0,5 N é

equivalente a 28,05 mg de KOH.
Va – Volume de ácido clorídrico gastos para titular a amostra.

Vb – Volume de ácido clorídrico gastos para titular o branco.
Vf – Volume final de HCl.
Vf (HCl) = Vb - Va
Vf (HCl) x 28,05 mg de KOH = __________ x 5 = __________
IS = ____________ mg de KOH/g de óleo

P á g i n a | 72
7.2 ÍNDICE DE IODO
O índice de iodo é a medida de insaturações que se baseia no fato de que o iodo e outros
halogênios se adicionam numa dupla ligação da cadeia instaurada dos ácidos graxos. É expresso pelo
número de gramas de iodo absorvido por 100 gramas da amostra.
Assim, chama-se índice de iodo o número de gramas de iodo absorvidos pelos ácidos graxos
não saturados presentes em 100 gramas de gordura analisada, este número classifica a molécula como
sendo óleo ou gordura. Este índice também é utilizado como controle de alguns processamentos.
Reagentes
Solução iodo-bromada de Hanus: dissolver 13,2 g de iodo metálico em 1 litro de ácido acético
glacial. Adicionar, a seguir, 3 mL de bromo.
Solução aquosa de iodeto de potássio 15%
Solução padrão de tiossulfato de sódio 0,1 M (24,81 g / 1000 mL)
Solução de acetato de mercúrio 2,5% em ácido acético glacial.
Solução clorofórmica dos óleos (20 mg de óleo por mL de clorofórmio)
Técnica
Em erlenmeyer de 125 mL, colocar 2,5 mL da solução clorofórmica do óleo (20 mg/mL) em
estudo (50 mg). Juntar, a seguir, exatamente 6,5 mL de solução de Hanus, utilizando-se de uma bureta.
Acrescentar 1,3 mL de acetato de mercúrio, que funciona como catalisador, reduzindo o tempo de
incubação. Esperar 10 minutos. Adicionar a seguir 5 mL de iodeto de potássio. Titular com tiossulfato de
sódio, usando 0,5 mL de amido como indicador, até o descoramento da solução. Paralelamente,
executar uma prova em branco, contendo 2,5 mL de clorofórmio puro e os demais reagentes, como
descritos acima. Titular com tiossulfato de sódio.
Mecanismo
Os halogênios ligam-se às duplas ligações dos ácidos graxos insaturados para formar um
composto de adição. O iodo da solução de Hanus reage com as duplas ligações dos ácidos graxos e a
quantidade de iodo consumida é, então, determinada pela titulação do iodo restante com o tiossulfato
padrão, e comparado com um branco, no qual não foi colocado ácido graxo.
P á g i n a | 73
Cálculo do índice de iodo
Para obter o índice de iodo, deve-se considerar que 1 mL de tiossulfato de sódio 0,1 N equivale
a 0,012692 g de iodo.
Va – Volume de Tiossulfato de Sódio (Na2S2O3) gastos para titular a amostra.

Vb – Volume de Tiossulfato de sódio gastos para titular o branco.
Vf – Volume final de Tiossulfato de Sódio.
Vf (Na2S2O3) = Vb - Va
Vf (Na2S2O3) x 0,012692 g iodo = __________ x 2000 = __________
II = ____________ g de iodo/100 g de óleo
Tabela 7.2 Índice de saponificação (mg KOH/g da amostra) e Índice de Iodo (g de iodo/100 g da
amostra), segundo a ANVISA.
Gordura Índice de Iodo Índice de Saponificação
Literatura Experimental Literatura Experimental
Manteiga 50-55 190-196
Manteiga de cacau 35 – 49 188 - 200
Óleo de algodão 99 – 119 189 - 198
Óleo de oliva 75 – 94 184 – 196
Óleo de soja 120 – 143 189 – 195
Óleo de linhaça 170 - 202 190 - 196
Óleo de amendoim 80 – 106 187 – 196
Óleo de milho 103 – 128 187 – 195
Margarina 99 - 108 181 - 189
Girassol 110 – 143 188 – 194
Arroz 99 – 108 181 – 189
Canola 110 – 126 182 – 193
Uva 130 – 138 188 – 194
Gordura de coco 6 – 11 248 – 256
Gergelim 104 – 120 187 - 195
IMPORTANTE: Os dados teóricos para o índice de iodo foram obtidos pelo método Wijs, onde o
halogênio utilizado é o Cloro (Cl), e não o Bromo como é o caso do método Hanus usado para esta aula.
P á g i n a | 74
8. METABOLISMO
As características dos organismos vivos, com sua organização complexa e sua capacidade de
crescimento e reprodução, são resultantes de processos bioquímicos coordenados. O metabolismo é a
soma de todas as transformações químicas que ocorrem nos organismos vivos. São milhares de reações
bioquímicas catalisadas por enzimas. As funções básicas do metabolismo celular são:
 Obtenção e utilização de energia;
 Síntese de moléculas estruturais e funcionais;
 Crescimento e desenvolvimento celular e
 Remoção de produtos de excreção.
Conforme os princípios termodinâmicos, o metabolismo é dividido em duas partes:
1. Anabolismo – processos biossintéticos a partir de moléculas precursoras simples e
pequenas. As vias anabólicas são processos endergônicos e redutivos que necessitam de
fornecimento de energia.
2. Catabolismo – processos de degradação das moléculas orgânicas e dos nutrientes celulares
que são convertidos em produtos mais simples com a liberação de energia. As vias
catabólicas são processos exergônicos e oxidativos.
Figura 8.1 Esquema de produção e consumo de energia pelo catabolismo e anabolismo.
A energia livre liberada nas reações catabólicas (exergônicas) é utilizada para realizar processos
anabólicos (endergônicos) (Figura 8.1). O catabolismo e o anabolismo estão frequentemente acoplados
por meio do ATP (trifosfato adenosina) e o NADPH (nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato, forma
reduzida). O ATP é o doador de energia livre para os processos endergônicos. O NADPH é o principal
doador de elétrons nas biossínteses redutoras.
Figura 8.2 Relação entre a produção e a utilização de energia. ATP e NADPH.

P á g i n a | 75
O esquema a baixo dá uma visão geral do catabolismo. Aminoácidos, hexoses e ácidos graxos
são formados pela hidrólise enzimática de seus respectivos polímeros (proteínas, carboidratos e
lipídeos). Os monômeros são desdobrados em intermediários de dois e três carbonos, como o acetil-
CoA e o piruvato também são precursores de outros compostos biológicos. A completa degradação
dessas moléculas produzem NH3, CO2 e H2O.
P á g i n a | 76
Em humanos, as vias metabólicas mais importantes são:

 Glicólise – oxidação da glicose a fim de obter ATP.
 Ciclo de Krebs – oxidação di acetil-CoA a fim de obter energia.
 Fosforilação oxidatva – eliminação dos elétrons da glicose e do acetil-CoA. Grande
parte da energia liberada neste processo pode ser armazenada na célula sob a forma de
ATP.
 Via das pentoses-fosfato – síntese de pentoses e obtenção de poder redutor para
reações anabólicas.
 Ciclo da Uréia – eliminação de NH4+ sob formas menos tóxicas.
 β-oxidação dos ácidos graxos – transformação de ácidos graxos em Acetil-CoA, para
posterior utilização pelo ciclo de Krebs.
 Neoglicogênese – síntese de glicose a partir de moléculas não glicolíticas, para
posterior utilização pelos orgãos glicodependentes, como o cérebro, miocárdio e
glóbulos vermelhos.
P á g i n a | 77
8.1 CONSUMO DE GLICOSE EM LEVEDURAS - AÇÃO DO FLUORETO
A obtenção de energia é um problema essencial para qualquer célula. Para as células que não
podem utilizar a energia luminosa, a alternativa mais prática é a oxidação de substâncias orgânicas com
o ar. Nem todas fazem isto, e estas células são relativamente raras, pois representam um estágio na
evolução que é tido como superado.
A fermentação é um destes processos, onde a de liberação de energia que ocorre sem a
participação do oxigênio (processo anaeróbio). Este processo compreende um conjunto de reações
enzimaticamente controladas, através das quais uma molécula orgânica é degradada em compostos
mais simples, liberando energia. A glicose é uma das substâncias mais empregadas pelos
microorganismos como ponto de partida na fermentação. É importante perceber que as reações
químicas da fermentação são equivalentes às da glicólise. A desmontagem da glicose é parcial, são
produzidos resíduos de tamanho molecular maior que os produzidos na respiração e o rendimento em
ATP é pequeno.
A glicose é um substrato básico para obtenção de energia em quase todas as células. Sob
condições aeróbicas, a glicose é oxidada a dióxido de carbono e água com liberação de 686 Kcal/mol.
Isto ocorre em dois estágios: primeiramente, com a oxidação da glicose a piruvato, na fase solúvel da
célula, e posteriormente, com a oxidação do piruvato a dióxido de carbono e água, na mitocôndria.
Porém na Glicólise, que é como é conhecida a primeira fase da fermentação, cada molécula de glicose é
desdobrada em duas moléculas de piruvato (ácido pirúvico), com liberação de hidrogênio e energia, por
meio de várias reações químicas. O hidrogênio combina-se com moléculas transportadores de
hidrogênio (NAD), formando NADH + H+, ou seja, NADH2.
A fermentação é um processo utilizado na fabricação de bebidas alcoólicas, pães e outros

alimentos. Hoje sabemos que os processos fermentativos resultam da atividade de microorganismos,
como as leveduras e certas bactérias.
Diferentes organismos podem provocar a fermentação de diferentes substâncias. O gosto
rançoso da manteiga, por exemplo, se deve a formação de ácido butírico causado pelas bactérias que
fermentam gorduras. Já as leveduras fermentam a glicose e as bactérias que azedam o leite fermentam
a lactose.
Fermentação Alcoólica
As leveduras e algumas bactérias fermentam açucares, produzindo álcool etílico e gás carbônico
(CO2), processo denominado fermentação alcoólica. Na fermentação alcoólica, as duas moléculas de
ácido pirúvico produzidas são convertidas em álcool etílico (também chamado de etanol), com a
liberação de duas moléculas de CO2 e a formação de duas moléculas de ATP.
Esse tipo de fermentação é realizado por diversos microrganismos, destacando-se os chamados
“fungos de cerveja”, da espécie Saccharomyces cerevisiae. O homem utiliza os dois produtos dessa
fermentação: o álcool etílico empregado há milênios na fabricação de bebidas alcoólicas (vinhos,
cervejas, cachaças etc.), e o gás carbônico importante na fabricação do pão, um dos mais tradicionais
alimentos da humanidade. Mais recentemente tem-se utilizado esses fungos para a produção industrial
de álcool combustível.
P á g i n a | 78
Os fungos que fermentam também são capazes de respirar aerobicamente, no caso de haver
oxigênio no meio de vida. Com isso, a glicose por eles utilizada é mais profundamente transformada e o
saldo em energia é maior, 38 ATP, do que os 2 ATP obtidos na fermentação.
Figura 8.1 Sequencia das reações enzimáticas pela fermentação alcoólica de carboidratos endógenos (glicogênio e
a trealose) ou exógenos (sacarose e maltose), conduzida por Saccharomyces.
Já foi dito que a utilização da glicose pelas células, de um modo geral, e em particular pelos
microrganismos, através da via glicolítica, assegura a energia necessária à manutenção destas
estruturas dentre os diversos eventos bioquímicos relacionados a este carboidrato. Por outro lado, este
consumo de glicose pode ser bloqueado mediante a ação de inibidores da via glicolítica, a exemplo de
conservantes alimentares como o ácido benzoico e o ácido ascórbico. Dentre estes destacamos o íon
fluoreto, ao qual a enolase é bastante sensível. A Enolase, uma enzima da via glicolítica, que transforma
o gliceraldeído em piruvato, e para funcionar, ela precisa de Magnésio (Mg), presente nesta via. O flúor
entra com o hidrogênio e rouba o magnésio necessário para a enzima funcionar, inibindo assim a
síntese de ATP.
P á g i n a | 79
8.1.1.1 Curva padrão da glicose pelo método do ácido dinitro-salicílico (DNS)
Reagentes
Ácido dinitro-salicílico (DNS) 1%: em um recipiente, misturar 1 g de DNS em 30 mL de água

destilada. Num outro recipiente dissolver 30 g de tartarato de sódio e potássio em 20 mL de hidróxido
de sódio 2 M. Colocar os dois recipientes em banho-maria à 56°C, até completa dissolução. Misturar
ambas soluções e completar o volume para 100 mL com água destilada.
Glicose 2,5 mM
Curva de calibração
Preparar uma curva de calibração considerando que o volume final, de cada tubo, é de 1,0 mL e
a concentração do padrão de glicose é de 2,5 mM. Em cada tubo acrescentar 0,5 mL da solução de DNS.
Colocar em banho-maria fervente por 5 minutos. Adicionar 5,0 mL de água destilada em cada tubo. Ler
no espectrofotômetro em  = 540 nm, contra o tubo branco. Traçar um gráfico de absorbância versus
concentração. Calcular o fator de calibração.
Tubo Glicose 2,5 Água Concentração DNS

Absorbância
mM - (mL) (mL) (mM) (mL)
1 0,1 0,9 0,25 0,5
2 0,2 0,8 0,50 0,5
3 0,3 0,7 0,75 0,5
4 0,4 0,6 1,00 0,5
5 0,5 0,5 1,25 0,5
6 0,6 0,4 1,50 0,5
7 0,7 0,3 1,75 0,5
8 0,8 0,2 2,00 0,5
9 0,9 0,1 2,25 0,5
10 1,0 ----- 2,50 0,5
BR ---- 1,0 ------ 0,5
8.1.2 Acompanhamento do consumo de glicose
Reagentes
Tampão fosfato 0,1 M, pH 7,0

Leveduras 1,5% (em tampão fosfato 0,1 M pH 7,0)
Glicose 24 mM
Fluoreto de sódio 1 M
Técnica
Ação do fluoreto: em um erlenmeyer de 50 mL, colocar 10 mL de leveduras 1,5%, 4 mL de

fluoreto de sódio 1 M e 10 mL da solução de glicose 24 mM.
Controle: em um segundo erlenmeyer, colocar 10 mL de leveduras 1,5%, 4 mL de água
destilada e 10 mL de glicose 24 mM.
P á g i n a | 80
Incubar, a 37°C, sob agitação manual esporádica. Retirar alíquotas de 0,1 mL dos dois
erlenmeyers, nos tempos 0, 20, 40 e 60 minutos e colocá-las em tubos de ensaio. Acrescentar, em cada
tubo, 0,9 mL de água destilada e 0,5 mL de DNS. Colocar em banho-maria fervente por 5 minutos.
Acrescentar 5,0 mL de água destilada em cada tubo e transferir o conteúdo dos mesmos para tubos de
centrífuga. Centrifugar por 5 minutos a 3.000 rpm. Cuidadosamente, transferir parte do sobrenadante
para cubeta e proceder a leitura em 540 nm.
Branco: preparar um tubo branco contendo 1,0 mL de leveduras 1,5%, 1,0 mL de tampão
fosfato 0,1 M pH 7,0 e 0,4 mL de água. A partir desta mistura, retirar uma alíquota de 0,1 mL e
transferir para outro tubo de ensaio. Acrescentar 0,9 mL de água destilada e 0,5 mL de DNS. Colocá-lo
em banho-maria fervente por 5 minutos. Acrescentar 5,0 mL de água destilada e proceder a leitura em
540 nm.
Determinar a concentração de glicose a partir do fator de calibração (FC).
Construir gráficos de concentração de glicose em função do tempo para as condições
experimentais.
Interpretar os resultados.
P á g i n a | 81
8.2 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA SUCCINATO DESIDROGENASE NO TECIDO

HEPÁTICO
Os seres vivos obtêm sua energia a partir de processos oxidativos. A reação oxidativa que será
estudada no presente experimento é a conversão do succinato a fumarato. A reação é catalisada pela
desidrogenase succínica, uma flavoproteína exclusivamente mitocondrial. Esta enzima é encontrada na
membrana interna das mitocôndrias de células eucarióticas e na membrana plasmática de procariotos e
participa de uma das etapas do ciclo de Krebs, catalisando a conversão de succinato a fumarato. A
reação faz parte do ciclo dos ácidos tricarboxílicos. Os dois elétrons e dois átomos de hidrogênio
provenientes da oxidação do succinato vão se combinar com o oxigênio, passando pela cadeia
respiratória.
Figura 8.2 Reação catalisada pela desidrogenase succínica.
Esta reação é importante, pois faz parte de um grupo de reações canalizadoras de energia para
a síntese de ATP. Nesta enzima estão presente uma molécula de FAD e três diferentes grupos de ferro-
enxofre, por onde passam os elétrons originários do succinato, combinando-se a seguir com o oxigênio,
gerando água. A desidrogenase succínica é inibida competitivamente pelo malonato, um análogo do
succinato.
Malonato Succinato
Figura 8.3 Estrutura molecular do Malonato e Succinato.
Para a medida da atividade da desidrogenase succínica pode ser utilizado um aceptor artificial
de elétrons como um oxidante final, desde que possua um potencial de óxido-redução capaz de
reoxidar as flavoproteínas, contornando toda a seqüência natural de transporte de életrons dos
P á g i n a | 82
citocromos. O 2,3,5-trifeniltetrazólio é um aceptor final de elétrons que em solução aquosa é

AMARELO-PÁLIDO e se torna VERMELHO quando reduzido a formazana. A alteração molecular do
aceptor artificial de elétrons, devido à redução, é a seguinte:
Reagentes
Meio de extração: sacarose 0,32 M em tampão fosfato 0,02 M pH 7,3 com 0,01 M de EDTA
Cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio 0,5%
Succinato de sódio 1% (neutralizar com NaOH)
Malonato de sódio 1% (neutralizar com NaOH)
Tampão fosfato 0,02 M pH 7,3
Suspensão de mitocôndrias
Técnica
Pesar 15 gramas de fígado de galinha. Com auxílio de uma tesoura cortar o fígado em pequenos
pedaços. Colocar em proveta, 30 mL de meio de extração. Adicionar um volume mínimo no tecido
hepático a ser triturado, homogeneizar por completo e então adicionar o restante do meio de extração.
Filtrar através de gaze. Dividir o filtrado, acondicionando-o em tubos de centrífuga. Centrifugar a 3.000
rpm, por 10 minutos. Cuidadosamente, desprezar o sobrenadante. As mitocôndrias, na sua maioria,
estarão na fase superior do precipitado. Com 3 mL do meio de extração, ressuspender esse precipitado
de maneira que não seja removida a camada inferior do mesmo (hemácias e restos celulares). Esta
suspensão será utilizada como fonte de enzima para o experimento.
A determinação da atividade da desidrogenase succínica, bem como a sua inibição pelo

malonato será feito segundo a tabela abaixo:
Tubo 1 2 3 4 5 6 7
tampão fosfato
0,02 M pH 7,3 (mL) 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50
tetrazólio 0,5% (mL) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
malonato 1% (mL) 0,50 0,50
mitocôndria
fervida por 3' (mL) 0,50
suspensão
mitocondrial (mL) 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50
succinato 1% (mL) 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50
P á g i n a | 83
Observações
Ao preparar os tubos, obedecer a ordem de adição dos reagentes.

Para desnaturar a enzima, ferver, por 3 minutos, 0,5 mL de suspensão mitocondrial em 1 mL de
meio de extração.
Os tubos devem ser pré-incubados por 3-5 minutos antes da adição de succinato.
Incubar todos os tubos ao mesmo tempo, em banho-maria a 37°C. Observar a mudança de cor
em intervalos de 5 a 20 minutos. Após este tempo adicionar aproximadamente 2 mL de succinato 10%
no tubo 2. A reversão da inibição pelo malonato se dá após uma hora.
P á g i n a | 84
8.3 REAÇÃO DE HILL – Fotólise da água
Aspectos Gerais
A fotossíntese é um processo de conversão de energia luminosa em energia química. Os seres

fotoautotróficos utilizam a energia luminosa para produzir compostos orgânicos, como a glicose,
usando como fonte de carbono o dióxido de carbono e como fonte de íon hidrogénio a água. A
fotossíntese pode ser expressa globalmente pela seguinte equação:
6CO2 (g) + 12H2O(l) C6H12O6(aq) + 6O2(g) + 6 H2O(l)
A produção de oxigénio pelos organismos fotossintéticos é extremamente importante como

fonte de oxigénio atmosférico utilizado pela maioria dos organismos – incluindo os fotossintéticos –
para completarem as suas cadeias respiratórias e obterem daí energia.
A fotossíntese poderá ser compartimentada em duas fases: uma que depende diretamente da
luz – fase fotoquímica e outra que não depende – fase química. A primeira produz ATP e um
transportador de elétrons reduzido (NADPH, H+), a segunda usa o ATP, NADPH, H+ e CO2 para produzir
glicose.
Na fotoquímica, a clorofila presente nos vegetais absorve a radiação luminosa proveniente do
sol e transforma essa forma de energia em energia química. A energia luminosa é utilizada para
produzir ATP a partir de ADP + Pi. Esse processo permite o crescimento das plantas, seu florescimento e
a produção de frutos, mas não é um benefício só para os vegetais, é também para o homem. Ao ingerir
o alimento proveniente das plantas, parte das substâncias entra na constituição celular e outra parte
fornece a energia necessária às atividades como o crescimento, a reprodução, etc. Os dois processos
básicos da fotoquímica são a fotólise da água e a fotofosforilação.
Na fotólise da Água ocorre a transferência dos átomos de hidrogênio para os transportadores
de hidrogênio e a liberação do oxigênio para a atmosfera. A substância receptora de hidrogênio é o
NADP (nicotinamida-adenina-dinucleotídeo+ácido fosfórico).
Na fotofosforilação: é a adição de fosfato em presença da luz, a substância que participa desta
etapa é o ADP, formando ATP. É nesse processo que as plantas produzem e armazenam energia para a
etapa química da fotossíntese.
Luz
NADPH + ADP + Pi + H2O NADPH + H+ + ATP + ½ H2O
Cloroplastos
Na fase química, que não depende diretamente da luz, os produtos da fotofosforilação não
cíclica – NADPH e ATP – e o CO2 são usados para produzir glicose. Apesar de se denominar também fase
escura, não é totalmente independente da luz, uma vez que para a enzima responsável pela fixação do
CO2, requer luz para ser reduzida e estar no seu estado ativo.
Escuro
+
NADPH + H + ATP + CO2 NADP+ + ADP + Pi + (CH2O)
Cloroplastos
Ambas as fases da fotossíntese decorrem no cloroplasto, mas em locais diferentes deste

organelo.
P á g i n a | 85
Reação de Hill
Em 1937, Hill já dispunha de condições técnicas para o isolamento dos cloroplastos a partir de
homogeneizados de tecido vegetal. Sua preparação, mesmo em presença de luz, mostrava-se incapaz
de liberar O2 (provavelmente devido a danos ocorridos durante o isolamento). Entretanto, ao adicionar
a esta preparação uma solução de ferricianeto de potássio, iluminando o sistema, verificou a liberação
do O2 e redução do ferricianeto. A reação pode ser representada por:
Luz
-3
2 H2O + 4(Fe(CN)6) O2 + 4(Fe(CN)6)-4 + 4H+
Ferricianeto Clorofila Ferrocianeto
e é conhecida como reação de Hill; o ferricianeto atua como um aceptor artificial de elétrons e é
chamado reagente de Hill.
Hoje, sabe-se que há uma série de substâncias que podem funcionar como reagente de Hill, isto
é, que podem desempenhar o mesmo papel que o ferricianeto.
Na célula, contudo, este aceptor de elétrons, às vezes chamado o reagente de Hill fisiológico, é o
NADP+. Assim, a equação que resume as etapas que ocorrem na chamada fase luminosa de
fotossíntese em plantas e algas é:
Luz
2 NADP+ + 2H2O 2NADPH + H+ + O2
Clorofila
A preparação de cloroplastos utilizada por Hill, embora conseguisse em presença de um aceptor

artificial de elétrons liberar O2, não era capaz de reduzir o CO2.
Hoje, os conhecimentos e recursos técnicos disponíveis, permitem a obtenção de cloroplastos
capazes de reduzir o CO2 com velocidade de cerca de 90% daquela que ocorre na folha verde.
A manutenção da maior integridade possível da organela é um requisito fundamental para se
obter preparações que reproduzam o fenômeno que ocorre na natureza. Isto exige que o rompimento
do tecido e isolamento dos cloroplastos sejam feitos em condições especiais.
• Tempo curto e temperatura baixa - o que evita a atuação de certas enzimas que
comprometem a integridade da membrana.
• Meio tamponado e isotonicidade - o que requer a presença, no meio em concentrações
apropriadas, de substâncias como sacarose, sorbitol e NaCl, além de íons como o Mg+2.
A reação de Hill tem uma importância histórica já que foi a primeira a mostrar que o O2 podia ser
liberado independentemente da redução de CO2. Por outro lado, a exigência da presença de um
aceptor para que houvesse produção de O2, indicava a necessidade da participação de um sistema de
transporte de elétrons.
Posteriormente, outro grupo de pesquisadores trabalhando com o isótopo 18O demonstrou que
o O2 liberado era proveniente de H2O e não do CO2.
2,6-diclorofenolindofenol (um reagente de Hill)
Quando o extrato de folhas contendo cloroplastos é iluminado, em presença do corante, o

corante azul se torna incolor e O2 é produzido.
Luz
2 H2O + 2A 2AH2 + O2
P á g i n a | 86
No escuro não ocorre nem produção de O2 nem redução do corante.

No presente experimento, será utilizado o 2,6 diclorofenolindofenol, como aceptor de elétrons,
agindo assim como indicador de óxido-redução (reagente de Hill). Este reagente tem a cor azul na sua
forma oxidada (com λ máximo ao redor de 540 nm) e incolor na sua forma reduzida, permitindo assim o
acompanhamento da reação fotoquímica mediada por cloroplastos isolados do espinafre.
Reagentes
Sacarose 0,35M
Tampão Fosfato 0,05M (pH 6,5) contendo 0,35M de sacarose
2,6 diclorofenolindofenol 16 mg/100 mL
Ácido Ascórbico (cristais)
Ditionito de sódio
Técnica
Pesar e picar 10 g de folhas frescas de espinafre. Recortar as nervuras e trituras as folhas em

um graal. Usar para este procedimento 10 mL de sacarose 0,35M, que deverá ser adicionado aos
poucos. Este será o meio extrator.
Filtrar o homogeneizado em gaze.
Centrifugar por 2 minutos a 1000 rpm, desprezar o precipitado e centrifugar novamente o
sobrenadante por 7 minutos a 3000 rpm.
Desprezar cuidadosamente o sobrenadante.
Ressuspender os cloroplastos obtidos em 10 mL de tampão fosfato contendo sacarose.
Preparar 4 tubos conforme abaixo:
P á g i n a | 87
Suspensão de Tampão
Tubos 2,6 DCF (mL) Observações
Cloroplastos fosfato (mL)
1 1,5 3 0,5 Expor a luz
2 1,5 3 0,5 Colocar no escuro
3 1,5 + Ác. Ascórbico 3 0,5
4 1,5 + Ditionito 3 0,5
P á g i n a | 88
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Ferrarese-Filho, O.; Ferrarese. M. L. L. Aulas Práticas de Bioquímica. Apostila utilizada no

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Koogan, Rio de Janeiro,1973.

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE

ROTEIRO PARA AULAS

Universidade Estadual de Maringá

1.1 RECOMENDAÇÕES GERAIS 4

1. AVALIAÇÃO DO PH DE SOLUÇÕES E SISTEMA TAMPÃO 6

4.1 CINÉTICA DAS REAÇÕES ENZIMÁTICAS 40

5.1 PARTE EXPERIMENTAL 53

6.1 REAÇÕES QUALITATIVAS PARA CARACTERIZAÇÃO DE CARBOIDRATOS 56

6.1.3 REAÇÃO DE BIAL 57

7.1 ÍNDICE DE SAPONIFICAÇÃO 70

8.1 CONSUMO DE GLICOSE EM LEVEDURAS - AÇÃO DO FLUORETO 77

1.1 Recomendações Gerais

1. Tendo qualquer dúvida solicite aos professores os devidos esclarecimentos.

1.2 Antes do Experimento

1.3 Durante o Experimento

1. Não troque os reagentes de uma bancada para outra.

- Antes de introduzir pipetas nas soluções, certifique-se de que estão limpas.

1.4 Depois do Experimento

- Descartar os reagentes conforme recomendado em cada aula.

1. AVALIAÇÃO DO pH DE SOLUÇÕES E SISTEMA TAMPÃO

O pH é símbolo para uma medida físico-química potencial hidrogeniônico ou potencial de

Tabela 2.1 Alguns indicadores de pH

2.1.1.2 Papel Indicador

2.1.1.3 Medidor de pH (pHmetro)

O pHmetro é um aparelho usado para medição de pH, constituído basicamente por um

Haste de prata recoberta com

Figura 1.1 Medidor de pH (pHmetro). Figura 1.2 Ilustração esquemática de um eletrodo de

E = Evidro + EAg/AgCl + Eref

Cada potencial é calculado pela Equação de Nerst:

R = Constante universal dos gases

2.1.2 Parte Experimental

Vinagre Caseiro (ácido acético).

Béquer 1 Béquer 2 Béquer 3

1. Por que o pH da água pura ficou ácido com a adição do vinagre?

2.2 SISTEMAS TAMPÃO

H+(aq) + X-(aq) HX(aq)

OH-(aq) + HX(aq) H2O(l)+ X-(aq)

As quantidades de HX e X- no tampão são grandes comparadas com a quantidades de H+ e OH-

2.2.1 Parte Experimental

Tampão fosfato 0,1 M (pH 7,0)

Usar 3 béqueres de 100 mL. No primeiro adicionar 5 mL de água destilada, no segundo 50 mL

Os α-aminoácidos possuem um átomo de carbono central (α) onde estão ligados

Figura 3.1 Estrutura de um α-aminoácido na forma de íon dipolar (“zwitterions”).

As proteínas são polímeros de aminoácidos unidos por ligações, denominadas ligações

Figura 3.2 Reação geral da formação de uma ligação peptídica

3.1.1 Reações para aminoácidos (Reação da Ninhidrina)

As reações orgânicas características dos aminoácidos são aquelas de seus grupamentos

Figura 3.3 Reação da Ninhidrina.

3.1.1.1 Parte Experimental

3.1.2 Curva de titulação de aminoácidos

(Forma A) (Forma B) (Forma C)

Desta maneira, pode-se calcular as relações entre as espécies iônicas de um aminoácido em

Figura 3.4 Curva de titulação de alanina 0,1 N.

3.1.2.1 Parte experimental

Pipetar 25 mL da solução de alanina 0,05 M, em um béquer de 50 mL. Padronizar o pHmetro e

Volume (µL) HCl 0,5 M (pH) NaOH 0,5M (pH) Nº de mols

3.1.3 CROMATOGRAFIA DE AMINOÁCIDOS

Na atualidade, utiliza-se o termo cromatografia para descrever qualquer método de separação

Os critérios mais comuns para classificação das diferentes modalidades são:

Cromatografia de troca iônica

3.1.3.1 Parte experimental

Distância percorrida por uma substância