UNIVERSIDAD TÉCNICA DE MANABÍ

FACULTAD DE CIENCIAS MATEMÁTICAS, FÍSICAS Y

QUÍMICAS
CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA

DOCENTE:

ING. VIRGINIA SÁNCHEZ.

INFORME

PRÁCTICA 4.

DETERMINACIÓN DE COLIFORMES FECALES Y COLIFORMES

TOTALES

ELABORADO POR:

BELTRÓN VINCES IRENE CAROLINA

FECHA DE INICIO: 30/07/2018

FECHA DE TÉRMINO: 01/08/2018

CURSO:

SÉPTIMO SEMESTRE “B”

ABRIL-AGOSTO 2018
 1. OBJETIVOS

1.1 OBJETIVO GENERAL:

Determinar la presencia de coliformes fecales y totales en muestras diluidas mediante el
método del número más probable (NMP).

1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

 Identificar la presencia o ausencia de coliformes fecales y totales en muestras

cárnicas, lácteas, producto alimenticio, agua potable, purificada y residual mediante
la técnica del NMP.
 Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua o alimentos mediante la búsqueda de
este tipo de microorganismos.
 Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos coliformes
fecales e interpretar los resultados obtenidos.

1
 2. MARCO TEÓRICO
2.1 COLIFORMES
Debido a que un gran número de enfermedades son transmitidas por vía fecal-oral
utilizando como vehículo los alimentos y el agua, es necesario contar con
microorganismos que funcionen como indicador de contaminación fecal. (Anónimo, 2015)
La denominación de Coliformes se le otorga a todo aquel grupo de bacterias que tienen
ciertas características bioquímicas en común y son de mucha importancia como
indicadores de contaminación del agua y de los alimentos. (Mossel, Moreno , & Struijak, 2008)
El grupo coliforme constituyen un grupo heterogéneo con hábitat primordialmente
intestinal para la mayoría de las especies que involucra, es constante, abundante y casi
exclusivo de la materia fecal, su capacidad de sobrevivencia y multiplicación fuera del
intestino también se observan en aguas potables, por lo que este grupo se utiliza como
indicador de contaminación fecal en agua; encontrándose que mientras mayor sea el
número de coliformes en agua, mayor será la probabilidad de estar frente a una
contaminación reciente. (Anónimo, 2015)
Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no sólo sobreviven, sino que se multiplican,
por lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado distinto al que
recibe en el agua. Cuando los productos alimenticios han recibido un tratamiento térmico
(pasteurización, horneado, cocción, etc.), estos microorganismos se utilizan como
indicadores de malas prácticas sanitarias. (Anónimo, 2015)
El término Coliformes proviene de Coli de la bacteria principal de este grupo, el cual es
la Escherichia Coli. Como ya se sabe la bacteria E. Coli es de origen fecal; para distinguir
a las demás que no son de origen fecal se utiliza el término de Coliformes Totales y a los
de origen intestinal o fecal Coliformes Fecales. Estos términos ayudan mucho para la
diferenciación, ya que otorga más veracidad y un alto grado de certeza si la contaminación
que presenta el agua es de origen fecal. (Mossel, Moreno , & Struijak, 2008)
Los coliformes fecales están estrechamente relacionados con la probabilidad de encontrar
patógenos excretados, mientras que los miembros del grupo coliformes totales están
ampliamente distribuidos en la naturaleza, en comparación con su presencia en el
intestino humano y en el de animales de sangre caliente. (Jiménez, 2001)

2.1.1 COLIFORMES TOTALES

Los coliformes totales son las Enterobacteriaceae lactosa-positivas y constituyen un
grupo de bacterias que se definen más por las pruebas usadas para su aislamiento que por

2
criterios taxonómicos. Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y se caracterizan por su
capacidad para fermentar la lactosa con producción de ácido y gas, más o menos
rápidamente, en un periodo de 48 horas y con una temperatura de incubación
comprendida entre 30-37ºC. (Laboratorio de Tecnología Educativa., 2012)
Son bacilos gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados. Del grupo
coliforme forman parte varios géneros: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella,
Citrobacter, etc. Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, pero también
en otros ambientes: agua, suelo, plantas, cáscara de huevo, etc. (Laboratorio de
Tecnología Educativa., 2012)

2.1.1.1 COLIFORMES FECALES

Dentro del grupo de los coliformes totales existe un subgrupo que es el de los Coliformes
fecales. Los coliformes fecales son coliformes totales que además fermentan la lactosa
con producción de ácido y gas en 24-48 horas a temperaturas comprendidas entre 44 y
45ºC en presencia de sales biliares. Los coliformes fecales comprenden principalmente
Escherichia coli y algunas cepas de Enterobacter y Klebsiella. (Laboratorio de Tecnología
Educativa., 2012)

Su origen es principalmente fecal y por esos se consideran índices de contaminación fecal.

Pero el verdadero índice de contaminación fecal es Escherichia coli tipo I ya que su origen
fecal es seguro. Desde el punto de vista metodológico Escherichia coli es el Coliforme
más positivo a la prueba del Indol. (Laboratorio de Tecnología Educativa., 2012)

2.2 MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE PARA DETERMINACIÓN DE

COLIFORMES TOTALES Y FECALES

La determinación de microorganismos coliformes totales por el método del Número más

Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar
la lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a 35°C  1C durante 48 h.,
utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinación consta de
dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa. (Mossel, Moreno , & Struijak, 2008)
En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio
el cual permite la recuperación de los microorganismos dañados que se encuentren
presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono.
Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde

3
brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos
capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante. (Mossel, Moreno , &
Struijak, 2008)
La determinación del número más probable de microorganismos coliformes fecales se
realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la
capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados
a una temperatura de 44.5  0.1C por un periodo de 24 a 48 h. (Mossel, Moreno , &
Struijak, 2008)

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 MATERIALES EQUIPOS REACTIVOS

 Matraz erlenmeyer Autoclave Producto cárnico
 Pipetas de 1ml y 10 ml
Incubadora Producto lácteo (Queso)
 Tubos de ensayo
 Campanas de Durham Cabina de flujo laminar Producto alimenticio
 Mortero y pistilo (balanceado de maíz)
 Mechero
Agua purificada
 Balanza
 Algodón Agua residual
 Gasa estéril
Agua potable
 Papel Aluminio
 Cinta masking Agua peptonada
 Piola de hilo
 Papel kraft y bond Alcohol

3.2 MÉTODO

1. Antes de realizar la práctica el agua peptonada, los caldos EC, lactosa, Lauril
Sulfato y bilis verde brillante, así como los materiales a emplear deben de estar
previamente preparados y esterilizados. Esto es ejecutado en la autoclave.
2. Enfriar y almacenar.

Se debe de tener en cuenta que los tubos de ensayo contienen 10ml cada uno de los
diversos caldos sumergiendo en ellos una campana de Durham, éstos deben estar bien
tapados y sin formación de burbujas antes de esterilizarlos.

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 3. El área en el que se trabajará deberá así mismo ser esterilizado. Para la cabina de
flujo laminar se encenderá la luz ultravioleta media hora antes de iniciar la
práctica.

METODOLOGÍA 1: COLIFORMES TOTALES

Agua purificada

1. Se coloca la muestra con un volumen de 10, 1 y 0.1ml en 10ml de caldo Lauril

sulfato en 3 series de 3 tubos.

Agua potable

1. Se realizan 3 series de 5 tubos a 10, 1 y 0.1ml de muestra con caldo lactosa.

Producto lácteo

1. Se tritura la muestra en el mortero con el pistilo y se procede a pesar 10g.

2. Se mezcla la muestra con 90ml de agua peptonada para preparar la solución
madre.
3. Se procede a realizar 3 series de 3 tubos en caldo lauril sulfato.

Producto alimenticio

1. Se realizan 3 series de 5 tubos en caldo lactosa.

Nota: Todas las muestras se proceden a incubar a una temperatura de entre 35-37°C.

METODOLODÍA 2: COLIFORMES FECALES

Producto cárnico (carne de res)

1. Se tritura la muestra en el mortero con el pistilo y se procede a pesar 10g.

2. Se mezcla la muestra con 90ml de agua peptonada para preparar la solución
madre.
3. Se realizan 3 series de 3 tubos en caldo EC.

Producto lácteo (queso)

1. Se tritura la muestra en el mortero con el pistilo y se procede a pesar 10g.

2. Se mezcla la muestra con 90ml de agua peptonada para preparar la solución
madre.
3. Se realizan 3 series de 3 tubos en caldo EC.

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Agua residual

1. En los tubos de ensayo que contienen caldo EC se realizan 3 series de 3 tubos con
volumen de muestra 0.1ml, 0.01ml, 0.001mL. Esto se realiza de la misma manera
que en disoluciones en serie.

Producto alimenticio (balanceado)

1. Se tritura la muestra en el mortero con el pistilo y se procede a pesar 10g.

2. Se mezcla la muestra con 90ml de agua peptonada para preparar la solución
madre.
3. Se procede a realizar 3 series de 3 tubos en caldo bilis verde brillante.

Nota: Todas las muestras se proceden a incubar a una temperatura de 44°C.

METODOLOGÍA 3: APLICACIÓN DEL MÉTODO DEL NÚMERO MÁS

PROBABLE.

Prueba presuntiva

1. Incubar los tubos a las temperaturas antes indicadas.

2. La formación de gas en cantidades mayores del 10% de la rama cerrada del tubo
al cabo de las 24h constituye una prueba presuntiva positiva.
Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales y fecales
1. Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez
(crecimiento) y producción de gas después de un período de incubación de 24 a
48 horas.
2. Consultar la tabla 1 o 2 de NMP para conocer el número más probable de
organismos coliformes totales/100 mL.
3. Consultar la tabla 1 o 2 de NMP para conocer el número más probable de
organismos coliformes fecales/ 100 mL.

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 4. RESULTADOS
4.1 PRUEBA PRESUNTIVA

*RESULTADOS OBTENIDOS DE COLIFORMES TOTALES A 24 HORAS DE

INCUBACIÓN

TIPO DE MUESTRA Serie de 10ml Serie de 1ml Serie de 0.1ml

Agua purificada 0 0 0

Agua potable 2 1 1

Producto lácteo 3 3 3

Producto alimenticio 5 5 5

FECHA: 31/07/2018

MUESTRA: Agua purificada

CALDO: Lauril sulfato

SERIE: 3X3 (10, 1, 0.1ml)

FECHA: 31/07/2018

MUESTRA: Agua Potable

CALDO: Lactosa

SERIE: 3X5 (10ml, 1ml, 0.1

ml)

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FECHA: 31/07/2018

MUESTRA: Producto lácteo

CALDO: Lauril sulfato

SERIE: 3X3 (10, 1, 0.1ml)

FECHA: 31/07/2018

MUESTRA: Producto
alimenticio

CALDO: Lactosa

SERIE: 3X5 (10ml)

FECHA: 31/07/2018

MUESTRA: Producto
alimenticio

CALDO: Lactosa

SERIE: 3X5 (1ml)

FECHA: 31/07/2018

MUESTRA: Producto
alimenticio

CALDO: Lactosa

SERIE: 3X5 (0.1ml)

8
 *RESULTADOS OBTENIDOS DE COLIFORMES FECALES A 24 HORAS DE
INCUBACIÓN

Tipo de muestra Serie de 10ml Serie de 1ml Serie de 0.1ml Serie de 0.01ml Serie de 0.001ml

Producto cárnico 3 3 3 ------- -------

Agua residual ------- ------- 3 3 3

Producto alimenticio 3 0 0 ------- ------

FECHA: 31/07/2018

MUESTRA: Producto cárnico

CALDO: EC

SERIE: 3X3 (10, 1, 0.1ml)

FECHA: 31/07/2018

MUESTRA: Agua residual

CALDO: EC

SERIE: 3X3 (0.1ml, 0.01ml, 0.001ml)

FECHA: 31/07/2018

MUESTRA: Producto alimenticio

CALDO: Bilis verde brillante

SERIE: 3X3 (10, 1, 0.1ml)

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 4.2 PRUEBA CONFIRMATIVA

*RESULTADOS OBTENIDOS DE COLIFORMES TOTALES A 48 HORAS DE

INCUBACIÓN

TIPO DE MUESTRA Serie de 10ml Serie de 1ml Serie de 0.1ml

Agua purificada 0 0 0

Agua Potable 4 1 2

Producto lácteo 3 3 3

Producto alimenticio 5 5 5

FECHA: 01/08/2018

MUESTRA: Agua purificada

CALDO: Lauril sulfato

SERIE: 3X3 (10, 1, 0.1ml)

FECHA: 01/08/2018

MUESTRA: Agua
Potable

CALDO: Lactosa

SERIE: 3X5 (10ml, 1ml,

0.1 ml)

10
FECHA: 01/08/2018

MUESTRA: Producto lácteo

CALDO: Lauril sulfato

SERIE: 3X3 (10, 1, 0.1ml)

FECHA: 01/08/2018

MUESTRA: Producto
alimenticio

CALDO: Lactosa

SERIE: 3X5 (10ml)

FECHA: 01/08/2018

MUESTRA: Producto
alimenticio

CALDO: Lactosa

SERIE: 3X5 (1ml)

FECHA: 01/08/2018

MUESTRA: Producto
alimenticio

CALDO: Lactosa

SERIE: 3X5 (0.1ml)

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 *RESULTADOS OBTENIDOS DE COLIFORMES FECALES A 48 HORAS DE
INCUBACIÓN

Tipo de muestra Serie de 10ml Serie de 1ml Serie de 0.1ml Serie de 0.01ml Serie de 0.001ml

Producto cárnico 3 3 3 ------- -------

Agua residual ------- ------- 3 3 3

Producto alimenticio 3 3 3 ------- ------

*Nota: Los resultados expuestos en las tablas se presentan por número de tubos positivos tanto
para coliformes totales y fecales.

FECHA: 01/08/2018

MUESTRA: Producto cárnico

CALDO: EC

SERIE: 3X3 (10, 1, 0.1ml)

FECHA: 01/08/2018

MUESTRA: Agua residual

CALDO: EC

SERIE: 3X3 (0.1ml, 0.01ml, 0.001ml)

FECHA: 01/08/2018

MUESTRA: Producto alimenticio

CALDO: Bilis verde brillante

SERIE: 3X3 (10, 1, 0.1ml)

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 5. ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS

5.1 NMP/100ml PARA COLIFORMES TOTALES

TIPO DE MUESTRA Serie de 10ml Serie de 1ml Serie de 0.1ml NMP/mL

Agua purificada 0 0 0 <0.018

Agua potable 4 1 2 0.26

Producto lácteo 3 3 3 >11

Producto alimenticio 5 5 5 >16

Empleando la técnica del número más probable se pudo comprobar la presencia o

ausencia de coliformes totales, para ello se puede constatar los siguientes resultados:

 Para el agua purificada se presentó <1.8NMP/100ml, es decir, ausencia de coliformes

totales, con lo cual se comprueba que este tipo de agua si está apta para consumo
humano de acuerdo a lo expuesto por (NTE INEN 1108, 2008)
 En el caso del agua potable se reportan número más probable de coliformes totales:
26/100mL siendo este número elevado comparado con los datos registrados en (NTE
INEN 1 108, 2006) siendo aceptable NMP de menos 2/100mL, por tanto, se requiere
control de desinfección de dicho líquido antes de su uso o consumo.
 Para el producto lácteo se cuantificaron más de 1100NMP/100mL, sin embargo,
dentro de la (NTE INEN 1528, 2012) no indica los valores límite para la presencia de
coliformes totales, esto es realmente preocupante, ya que refleja la posibilidad de
contaminación fecal por prácticas inadecuadas de higiene o la exposición del alimento
a condiciones que favorecen el crecimiento y la multiplicación de este
microorganismo.

Teniendo en cuenta que parte de los coliformes totales son de tipo fecal se sugiere que
en la norma ecuatoriana se establezca un límite para este tipo de microorganismo.
Además se puede deducir que al presentar un alto nivel de coliformes totales
(+1100NMP/100mL) las condiciones de higiene durante la elaboración del queso
fueron insatisfactorias o que hubo contaminación después del proceso de elaboración
antes de llegar al consumidor.

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  El producto alimenticio, en este caso balanceado de maíz, contiene más de
1600NMP/100ml cantidad que se presenta por encima de los límites permisibles
según (NTE INEN 1829, 1992) y que puede afectar al desarrollo y nutrición de aves.
Sin embargo, en la variante actualizada sobre la norma (NTE INEN 1829, 2014) no
se expresan rangos de aceptabilidad o límites permisibles de coliformes totales en
dichos productos.

5.2 NMP/100mL PARA COLIFORMES FECALES

Serie de Serie de Serie de Serie de Serie de

Tipo de muestra NMP/mL
10ml 1ml 0.1ml 0.01ml 0.001ml

Producto cárnico 3 3 3 ------- ------- >11

Agua residual ------- ------- 3 3 3 >1100

Producto alimenticio 3 3 3 ------- ------ >11

1
Nota: Como en el agua residual se usó un factor de dilución de se emplea la misma
10

tabla con la que se cuantificó las muestras anteriores pero utilizando un factor de
corrección de 100 o también se podrá emplear una tabla que se encuentre con ese tipo de
combinaciones.

De acuerdo a lo estipulado por (NTE INEN 1338, 2010) los productos cárnicos crudos no
presentan un nivel de referencia sobre coliformes fecales, sin embargo, si éste se
presentase cocido o curado debería mostrar menos de 3 NMP/g. Es decir, que dicha carne
analizada debe entrar en un proceso de tratado y eliminación de microorganismos para
evitar que esa cantidad de más de 1100 NMP/100ml de coliformes fecales se sigan
presentando una vez que se haya cocido, curado o marinado y así poder evitar posibles
enfermedades debido a su consumo.

El agua residual (como era de esperarse) contiene más de 1100 NMP/ml de coliformes
fecales, por consiguiente, es un tipo de líquido que está totalmente alejado a condiciones
óptimas para su uso o consumo mientras no se realice un tratamiento previo.

Así mismo como se expresó en líneas anteriores sobre el límite mínimo y máximo
permisible de coliformes totales en el balanceado de maíz según (NTE INEN 1829, 1992)

14
la cantidad de más de 1100/100mL de coliformes fecales indican contaminación del
producto ya sea por factores externos al momento de elaborarlo o por malas prácticas de
manipulación.

6. CONCLUSIONES
 Se identificó la presencia de coliformes totales en muestras lácteas, agua potable,
producto alimenticio y ausencia de los mismos en agua purificada, de igual manera
se evidenció presencia de coliformes fecales en el producto cárnico, balanceado y
agua residual mediante la técnica del NMP registrando como positivos aquellos tubos
en donde se observaba turbidez (crecimiento) y producción de gas.
 Se evaluó la calidad sanitaria de muestras de agua y alimentos mediante comparación
de los datos obtenidos con la Norma Técnica Ecuatoriana “INEN” específicas para
cada caso y en aquellas que no cuantificaban la cantidad de coliformes totales o
fecales se realizó un análisis en base a los resultados alcanzados.
 Se diferenció los organismos coliformes totales de las bacterias coliformes fecales
siendo estas últimas un subgrupo de coliformes totales y las cuales dependiendo del
producto que los contengan deben llevar un estricto control de disminución o
eliminación bajo técnicas de regulación.

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7. BIBLIOGRAFÍA

 Anónimo. (2015). Método para la determinación de bacterias coliformes,

coliformes fecales y Escherichia coli por la técnica de diluciones en tubo
múltiple (NMP). Recuperado el 03 de Agosto de 2018, de
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Analisis_Agua_NMP_22309.pdf

 Jiménez, B. E. (2001). La Contaminación Ambiental en México. México:

Limusa.

 Laboratorio de Tecnología Educativa. (2012). Recuento de coliformes totales.

España: Universidad de Salamanca.

 Mossel, D., Moreno , B., & Struijak, C. (2008). Microbiología de alimentos

(Segunda ed.). Acribia.

 NTE INEN 1 108. (2006). Norma Técnica Ecuatoriana para el agua potable.
Quito.

 NTE INEN 1 108. (2008). Norma Técnica Ecuatoriana para Agua purificada (1
ed.). Quito.

 NTE INEN 1 338. (2010). Norma Técnica Ecuatoriana: Carne y productos

cárnicos. Productos cárnicos crudos, productos cárnicos curados-madurados y
productos cárnicos precocidos-cocidos. Requisitos . Quito.

 NTE INEN 1 528. (2012). Norma general para quesos frescos no madurados.
Quito: Norma Técnica Ecuatoriana.

 NTE INEN 1 829. (1992). Alimentos zootécnicos compuestos para pollos de

engorde. Requisitos. Quito: Norma Técnica Ecuatoriana.

 NTE INEN 1 829. (2014). Alimentos para animales. alimentos balanceados

para aves de producción zootécnica . Quito: Norma Técnica Ecuatoriana.

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 8. ANEXOS

TABLAS EMPLEADAS PARA RECUENTO DE COLIFORMES POR EL

MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE

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