You are on page 1of 6

Aktivitas penghambatan in vitro dan penambatan molekuler senyawa

flavonoid pada inducible nitric oxide synthase : Review

(Inhibitor activity of in vitro and molecular docking of flavonoid compounds in inducible


nitric oxide synthase: Review)
Recky Patala1, Tiana Milanda2, Jutti Levita1
1
Departemen Farmakologi dan Farmasi Klinik, Fakultas Farmasi, Universitas Padjadjaran, Jl. Raya Bandung,
Sumedang Km 21 Jatinangor 45363
2
Departemen Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Padjadjaran, Jl. Raya Bandung, Sumedang Km 21
Jatinangor 45363
Article Info:
Received:
ABSTRACT
in revised form:
Accepted: Some flavonoids, including quercetin derivatives, have been reported to
Available Online: exhibit inhibitory activities against inducible nitric oxide synthase (iNOS),
an isoenzyme responsible for the formation of both in vitro inhibitory and
Keywords:
Flavonoids molecular docking of nitric oxide (NO). The purpose of this study was to
In vitro investigate the antiinflammatory activity of flavonoid compounds and some
Molecular docking quercetin derivatives in iNOS by in vitro method and molecular docking.
iNOS Five flavonoid compounds showed activity as antiinflammatory in inhibition
Antiinflamatory
of iNOS in vitro based on IC 50 values obtained, the compound was identified
Corresponding Author: against J774A.1 and RAW 264.7 cell lysates using western blot analysis.
Recky Patala Then ten quercetin derivatives are used as ligands for molecular docking.
Fakultas Farmasi The iNOS structure was obtained from PDB data (http://www.rcsb.org) and
Universitas Padjadjaran
Jatinangor, 45363, Bandung, the docking study is performed using molecular docking software. The
Indonesia simulated data are Gibs binding energy (ΔGbind) and hydrogen bonds on
Phone : +62 451-423468: amino acid residues to analyze the interaction stability between ligand and
Email: Reckyfarmasi@gmail.com iNOS active site. The result of molecular docking attainment is Gibs binding
energy (ΔGbind) which indicates that the binding reaction is spontaneous or
stable.

Copyright © 2017 JFG-UNTAD


This open access article is distributed under a Creative Commons Attribution (CC-BY-NC-SA) 4.0 International license.

How to cite (APA 6th Style):


Patala R., Milanda T.,dan Levita J. (2018). Aktivitas penghambatan in vitro dan penambatan molekuler senyawa flavonoid
pada inducible nitric oxide synthase : Review. Jurnal Farmasi Galenika : Galenika Journal of Pharmacy.

1
ABSTRAK

Beberapa flavonoid, termasuk turunan kuersetin, telah dilaporkan menunjukkan aktivitas


penghambatan terhadap inducible nitric oxide synthase (iNOS), sebuah isoenzim yang bertanggung
jawab dalam pembentukan nitric oxide(NO) baik penghambatan secara in vitro maupun penambatan
molekuler. Tujuan dari review ini yaitu untuk mengetahui aktivitas antiinflamasi dari senyawa
flavonoid dan beberapa turunan kuersetin pada iNOS dengan metode in vitro dan penambatan
molekuler. Lima senyawa flavonoid menunjukkan aktivitassebagai antiinflamasi dalam penghambatan
iNOS secara in vitro berdasarkan nilai IC50 yang diperoleh, senyawa tersebut diidentifikasi terhadap
sel lisatJ774A.1 dan RAW 264.7menggunakan analisis western blot. Kemudian sepuluh turunan
kuersetin digunakan sebagai ligan untuk penambatan molekuler. Struktur iNOS diperoleh dari data
PDB (http://www.rcsb.org) dan studi penambatan dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak
penambatan molekuler. Data hasil simulasi berupaenergi ikatan bebasGibs (ΔGbind) dan ikatan
hidrogen pada residu asam amino untuk menganalisis kestabilan interaksi antara ligan dan sisi aktif
iNOS. Hasil penambatan molekuler yang diperoleh adalah energi ikatan bebas Gibs (ΔGbind) yang
bernilai negatif, ini menunjukan bahwa reaksi ikatan yang terjadi bersifat spontan atau stabil.

Kata Kunci : Flavonoid, in vitro, penambatan molekuler, iNOS, antiinflamasi

PENDAHULUAN bersama-sama dengan pyran heterosiklik atau cincin


Nitric oxide (NO) dihasilkan dari L-arginin pyrone dan banyak ditemukan dalam buah-buahan
dalam jaringan mamalia oleh enzim nitric oxide dan sayuran. Senyawa ini banyak menunjukkan
synthase (NOS). Ada tiga isoenzim NOS, yaitu, aktivitas farmakologi dan sifat terapeutik termasuk
nNOS (konstitutif dalam jaringan saraf), eNOS antioksidan, antikanker dan anti inflamasi.
(konstitutif pada sel endotel vaskular) dan iNOS
(diinduksi oleh sitokin dalam makrofag dan
hepatosit) (Knowles dan Moncada, 1994). Ekspresi
konstitutif eNOS dan nNOS bertanggung jawab
untuk kadar fisiologis rendah NO, sedangkan jumlah
yang lebih besar dari NO diproduksi oleh
iNOS.iNOS diinduksi oleh produk mikroba, seperti
lipopolisakarida (LPS) dan sitokin inflamasi seperti
interleukin-1 (IL-1), tumor necrosis factor-α (TNF-
Gambar 1. Struktur umum flavonoid
α) dan interferon-γ (INF-γ) dalam makrofag dan
beberapa sel-sel lain (Hamalainen et al., 2007).
Produksi NO meningkat pada respon terhadap Beberapa flavonoid telah dilaporkan memiliki
rangsangan inflamasi dan memediasi efek destruktif sifat anti inflamasi dengan menghambat iNOS dalam
(Korhonen et al., 2005). Karena pentingnya NO medium kultur yang diransang Lipipolisakarida
yang berasal dari iNOS pada respon peradangan, ada (LPS), yaitu, kuersetin, kuersetin pentaasetat,
beberapa upaya penelitian untuk menemukan apigenin, rutin, galangin, silimarin dan naringenin
selektif inhibitor iNOS. Senyawa ekspresi (Mattace et al., 2001; Chau chen et al., Commented [U1]: Sesuaikan tulisannya dengan yang ada di
2001). Kuersetin (3,3', 4', 5,7-pentahydroxyflavon) daftar pustaka Chau / Chen...cek cara sitasi dari nama yang ada
penghambatan atau aktivitas iNOS diusulkan di jurnal aslinya
menjadi potensi sebagai agen anti-inflamasi adalah flavonoid yang sesuai untuk dipilih sebagai
(Knowles dan Moncada, 1994). Flavonoid (Gambar senyawa utama untuk pengembangan agen anti
1.) adalah kelompok alami senyawa inflamasi, karena selain efek anti inflamasi, kuersetin
poli fenolik yang tersebar di berbagai tanaman, juga menunjukkan efek pelindung dalam saluran
mengandung dua cincin benzena dihubungkan pencernaan (Morikawa et al., 2003;Coskun et al.,
2004). Biologi komputasi dan bioinformatika

2
berpotensi tinggi dalam ilmu kimia medisinal, tidak yang dirangsang dengan LPS (1µg/ml). Persentase
hanya mempercepat proses penemuan obat tetapi penghambatan dinyatakan sebagai mean ± SEM.
juga mengubah cara penemuan dan perancangan Flavonoid % Penghambatan iNOS
obat. Rational drug design (RDD) memfasilitasi dan 0.5 µM 5 µM 50 µM
mempercepat proses rancangan obat, yang Apigenin 47.80 ± 1.47 55.74 ± 2.27 88.75 ± 6.33
melibatkan berbagai metode untuk mengidentifikasi Galangin 47.57 ± 2.28 60.30 ± 6.67 97.20 ± 2.09
senyawa baru (Ramya, 2011).Penambatan molekuler Morin 0 2.26 ± 0.74 8.43 ± 1.78
adalah alat dalam biologi molekuler struktural dan Naringenin 4.75 ± 1.38 28.52 ± 3.25 72.80 ± 3.78
penemuan obat berbasis struktur. Tujuan dari Kuersetin 59.33 ±1.20 91.36 ± 2.18 96.50 ± 2.23
penambatan ligan-protein adalah untuk memahami Silimarin 1.08 ± 0.65 15.53 ± 2.44 79.11 ± 2.11
dan memprediksi pengenalan molekuler, menemukan
kemungkinan mode ikatan dan memprediksi afinitas
pengikatan (Morris dan Lim-Wilby, 2008).

AKTIVITAS PENGHAMBATAN INOS


SECARA IN VITRO
Gambar 3. Penghambatan ekspresi iNOS yang
Untuk mendapatkan data studi penghambatan iNOS diinduksi oleh LPS pada sel silat RAW 264.7 Commented [U3]: ?
secara in vitro sebagai bahanreview jurnal, penulis makrofag oleh senyawa flavonoid rutin (RT),
melakukan teknikpengumpulan data penelitian kuersetin (QCT), danKuersetin pentaasetat (QCTPA)
berdasarkan studi literaturyang telah dipublikasikan dengan masing-masing konsentrasi 20 dan 40 µM.,C:
sebelumnya.Literatur yang digunakan adalah artikel kontrol; L: LPS-treated.
danjurnal penelitian yang diperoleh melalui publikasi
padabeberapa situs online Google Schoolar, seperti Tabel 2.Efek rutin, kuersetin, dan kuersetin
Pubmed, Elsevier dan NCBI. pentaasetat pada aktivitas iNOS oleh uji aktivitas
enzim langsung sel lisat RAW 264.7.
Pra Penambahan pada Aktivitas spesifik
perlakuan sel lisat iNOS : Formasi
sebelum lisis NO (µM/200 µg
total protein)a
None DMSO 0.9 ± 0.3
LPS DMSO 7.3 ± 0.8
(100ng/ml), Rutin
12 jam 20 µM 7.4 ± 0.7
40 µM 7.2 ± 0.1
Kuersetin
20 µM 8.7 ± 1.3
40 µM 7.9 ± 0.4
Kuersetin pentaasetat
20 µM 6.8 ± 0.2
40 µM 6.9 ± 0.6
Gambar 2. Analisis western blot yang menunjukkan N-nitro-L-arginin
perubahan senyawa flavonoid pada ekspresi iNOS 4 mM 4.6 ± 0.4** Commented [U2]: Cek kembali redaksi kalimatnya
yang diinduksi oleh LPS (1 µg/ml) pada sel lisat N-nitro-L-arginin (SPOKnya)...yang berubah ekspresi iNOSnya atau senyawa
Metil ester 4.3 ± 0.3** flavonoidnya?
J774A.1dengan konsentrasi (0,5-50 µM) Flavonoid 4 mM
(A untuk apigenin, G untuk galangin, M untuk morin, Nilai a diperoleh dari tiga eksperimen terpisah dan
N untuk naringenin, Q untuk kuersetin, dan S untuk digambarkan sebagai mean±SEM. Setiap senyawa yang
silimarin). ditunjukkan ditambahkan ke dalam sel lisat (200 mg) dari
perlakuan LPSRAW 264.7. ** P <0,01, berbeda nyata
Tabel 1.Persen penghambatan ekspresi iNOS dengan dengan LPS saja, dianalisis dengan uji t Student. Commented [U4]: Cantumkan sumber (pustaka) data ini
peningkatan konsentrasi flavonoid pada makrofag Flavanoid menunjukan keragaman struktural
yang sangat luas, lebih dari 4000 flavanoid yang

3
berbeda telah diidentifikasi dari berbagai tanaman. molekuler dari turunan kuersetin menggunakan
Senyawa tersebut memiliki efek yang spesifik software molecular docking (penambatan molekuler).
terhadap berbagai enzim yang dapat mengganggu Dari penambatan molekuler tersebut maka akan
berbagai proses seluler, termasuk pertumbuhan dan memperoleh nilai afinitas pengikatan yang ditandai
diferensiasi. (Di Carlo et al., 1999;Brandi, 1992). dengan nilai energi ikatan bebas Gibs (ΔG) dan
Menurut Van Acker et al., (1995), Aktivitas ikatan hidrogen residu asam amino antara ligan dan
antiinflamasi dari senyawa flavonoid dikenal sebagai enzim (ArgusLab 4.0.1, 2004; Oda et al., 2007).
penangkal radikal bebas yang sangat baik dan juga
sebagai penangkal Nitric oxide (NO) yang sangat
manjur. Prostaglandin dan biosintesis NO yang
terlibat dalam reaksi peradangan dan respon imun
dan isoform induksi NOS bertanggung jawab pada
produksi sejumlah mediator proinflamasi tersebut.
Selain itu LPS meransang sel inang, terutama
monosit/makrofag untuk menghasilkan dan
melepaskan NO dengan menginduksi protein iNOS
yang dihasilkan dalam sitotoksisitas. Moroney, Gambar 4. Perbandingan konformasi 3-bromo-7-
(1988), menyatakan bahwa flavonoid juga dapat nitroindazole dari struktur kristal kompleks 3-bromo-
menghambat metabolisme asam arakidonat. 7-nitroindazole-iNOS (merah) dan dari simulasi
Flavanoid yang paling aktif yang telah diidentifikasi penambatan menggunakan program software (biru).
adalah kuersetin dan apigenin. Studi yang dilakukan
oleh Chan et al., (1997), menemukan bahwa
kuersetin memiliki aktivitas penghambatan pada NO
dan TNF-α yang diproduksi oleh makrofag induksi
oleh LPS dan apigenin secara signifikan menghambat
edema yang disebabkan oleh minyak kroton dan
aktivitas ini mungkin disebabkan oleh penghambatan
langsung pada metabolisme arakidonat. Studi lain
yang dilakukan oleh Liang et al., (1999) melaporkan
bahwa apigenin mengurangi ekspresi iNOS dan
kuersetin menghambat iNOS. Sehingga dari hasil
penelitian ini yang telah dilakukan apigenin, rutin, Gambar 5.Konformasi pengikatan flavonoid (hijau)
kuersetin pentasetat, kuersetin dan galangin efektif pada sisi ikatan iNOS. Ikatan hidrogen ditandai
menghambat secara signifikan tidak hanya produksi dengan garis merah (Kartasasmita, 2010).
NO dan PGE2 (prostaglandin) tetapi juga ekspresi
iNOS yang diaktivasi oleh LPS sel silat makrofag
J774A.1 dan RAW 264.7. Temuan tersebut
menunjukan bahwa beberapa senyawa flavonoid
tersebut dapat melindungi secara in vitro terhadap
respon yang diinduksi oleh endotoksin dengan
menghambat langsung L-arginin melalui jalur NO.

AKTIVITAS PENAMBATAN MOLEKULER


PADA iNOS
Teknik pengumpulan data untuk studi penambatan
molekuler yaitu dengan mengambil struktur Gambar 6. (a) Interaksi kuersetin dan (b) 6,8-
koordinasi untuk iNOS dari RCSB dichloroquercetin-3- O -acetate pada sisi ikatan
(http://www.rcsb.org) Protein Data Bank (PDB ID: iNOS (Kartasasmita, 2010).
1M9T), di mana domain inducible NOSoxygenase
dicokristalisasi dengan 3-bromo-7-nitroindazole Tabel 3. Struktur turunan kuersetin, energi ikatan
(Rosenfeld et al., 2002). Kemudian membuat Gibs (ΔGbind) pada iNOS.
struktur 3D, optimasi geometri dan penambatan

4
dari interaksi antara flavonoid dan sisi ikatan iNOS,
afinitas turunan kuersetin pada sisi ikatan iNOS
diprediksi. Diperoleh bahwa nilai energi ikatan dari
quercetin-3 -O- acetate, 6,8-dichloroquercetin-3 -O-
acetate dan 6-bromoquercetin-3 -O- acetate lebih
rendah dari kuersetin, menunjukkan bahwa senyawa
ini memiliki afinitas tinggi pada sisi ikatan iNOS dari
kuersetin.
Substituen
Nama 3 6 8 ∆G KESIMPULAN
(Kkal mol-1) Dari beberapa hasil studi penghambatan dari
Kuersetin H H H -9.78
Kuersetin-3-O-asetat O-CO-CH3 H H -10.92 aktivitas senyawa flavonoid dan turunan kuersetin
3-O-Metil-kuersetin CH3 H H -7.49 terhadap iNOS baik secara studi in vitro maupun
6-klorokuersetin H Cl H -8.92 secara molecular docking (penambatan molekuler)
6,8-diklorokuersetin H Cl Cl -10.46
3-O-asetat dapat disimpulkan bahwa beberapa senyawa
3-O-metil-1-6, flavonoid yang telah diidentifkasi serta beberapa
8-O-diklorokuersetin CH3 Cl Cl -9.16
6-bromokuersetin H Br H -8.28
turunan senyawa kuersetin secara signifikan
6,8-dibromokuersetin H Br Br -7.77 berpotensi sebagai antiinflamasi pada ekspresi iNOS
6-bromokuersetin- O-CO-CH3 Br H -10.23 yang diinduksi oleh LPS dan berdasarkan ikatan
3-O-asetat
3-O-metil 1-6- CH3 Br H -8.88 hidrogen pada residu asam amino dan energi ikatan
bromokuersetin Gibs ΔGbind yang dihasilkan.

Secara umum, flavonoid terdiri dari 2 cincin UCAPAN TERIMAKASIH


benzena (A dan B), yang dihubungkan oleh sebuah Ucapan terima kasih disampaikan
cincin pyrane mengandung oksigen (C). Struktur X- kepada Fakultas Farmasi Universitas
ray 3-bromo-7-nitroindazole, sebuah iNOS inhibitor, Padjadjaran yang telah memfasilitasi dalam
menunjukkan bahwa cincin aromatik dari 3-bromo-7- pembuatan review ini. Terima kasih juga
nitroindazole mengikat kantung heme iNOS. Selain kepada Prof. Dr. Anas Subarnas, M.Si., Apt.
itu, bagian nitro membentuk ikatan hidrogen dengan yang telah membantu dalam proses pembuatan
gugus amida dari Met368. Flavonoid dapat review ini sehingga dapat terselesaikan tepat
menambat sama sebagai 3-bromo-7-nitroindazole pada waktunya.
dengan bagian planar cincin A flavonoid berorientasi
terhadap bidang heme iNOS. Menurut Rosenfeld et DAFTAR PUSTAKA
al., (2002), ketika terikat NOS, sistem planar
menunjukkan afinitas tinggi dibandingkan dengan ArgusLab 4.0.1, (2004).Software Planaria
sistem nonplanar. Kelompok karbonil flavonoid LLC. Seattle.
membentuk ikatan hydrogen dengan kelompok amida Brandi, M. L. (1992). Flavonoids: biochemical
dari Gly365 dan Trp366. effects and therapeutic applications,Bone Miner,
Studi sebelumnya yang dilakukan oleh 19, S3–14.
Francis et al., (2008), menggambarkan interaksi ligan Chan, M. M., Fong, D. Ho. T., &Huang, Hj. (1997).
pada iNOS, dimana sisi aktif dari NOS terdiri dari Inhibition of inducible nitric oxide synthase gen
empat kantung, yaitu substrat yang mengikat kantung expression and enzyme activity by
S, kantung tengah M, kantung C1 dan kantung C2 epigallocatechin gallate a natural product from
pada akses kanal substrat. Residu Trp372 dan Glu377 green tea,Biochem Pharmacol, 54, 1281-1286.
dalam kantung S (iNOS) menjadi residu utama Chen, Y.C., Shen, S.C., Lee, W.R., Hou, W.C.,Yang,
dengan substrat (L-arginin) membentuk ikatan L.L., & Lee, T.J.F. (2001). Inhibition of nitric
hidrogen. Hasil ini menunjukkan bahwa flavonoid oxide synthase inhibitors and lipopolysaccharide
membentuk ikatan hidrogen dengan residu Gly365 induced inducible NOS and cyclooxygenase-2
dan Trp366. Namun, ada perbedaan struktural yang gene expressions by rutin, quercetin and
jelas antara L-arginin dan flavonoid sebagai ligan quercetin pentaacetate in RAW 264.7
karena menyebabkan berbagai residu asam amino macrophages. J. Cell. Biochem, 82, 537-548. Commented [U5]: Tulisan namanya disesuaikan dengan yang
dari iNOS dalam interaksi tersebut. Berdasarkan studi ada di sitasi naskah ...naskah : Chau Chen

5
Coskun, O. M.,Kanter, F., Armutcu, K., Cetin, B., Morikawa, K., Nonaka, M.,Narahara, M.,Torii, I., &
Kaybolmaz, & Yazgan, O. (2004). Protective Kawaguchi, K. (2003). Inhibitory effect of
effects of quercetin, a flavonoid antioxidant, in quercetin on carrageenan-induced inflammation
absolute ethanol-induced acut gastric ulcer. Eur. in rats. Life Sci, 26, 709-721.
J. Gen. Med, 1, 37-42. Oda, A., Okayasu, M.,Kamiyama, Y., Yoshida,
Di Carlo, G., Mascolo, N., Izzo A. A., Capasso, F. T.,Takahashi, O., & Matsuzaki, H.
(1999). Flavanoids: old and new aspects of a (2007). Evaluation of docking accuracy and
class of natural therapeutic. Drugs Life Sci, 65, investigastions of roles of parameters and each
337-353. term in scoring functions for protein-ligand
Francis, S.M., Mittal, A.,Sharma, M., & docking using arguslab software. Bull. Chem.
Bharatam,P.V.(2008). Design of Benzene-1,2- Soc. Jap., 80, 1920-1925.
diamines as selective inducible nitric oxide Ramya, T., Sri, Sathyanathan, V.,Kumar, D. P.,
synthase inhibitors: A combined de novo design Chowdhari, M. (2011). Docking Studies on
and docking analysis. J. Mol. Model, 14, 215- Synthesizwd Quinazoline Compounds Against
224. Androgen Receptor. Int. J. Pharm & Ind. Res 01.
Hamalainen, M., Nieminen, R.,Vuorela, P.,Heinonen, 04, 266 – 269.
M., & Moilanen, E. (2007). Anti-inflammatory Kartasasmita, R.E.,Herowati, R., & Gusdinar, T.
effects of flavonoids: Genistein, kaempferol, (2010). Docking Study of Quercetin Derivatives
quercetin, and daidzein inhibits STAT-1 and NF- on Inducible Nitric Oxide Synthase and
ΚB activation, whereas flavone, isorhamnetin, Prediction of their Absorption and Distribution
naringenin, and pelargonidin inhihibit only NF- Properties. Journal of Applied Sciences, 10,
ΚB activation along with their inhibitory effect 3098-3104.
on iNOS expression and NO production in Rosenfeld, R.J., Garcin, E.D., Panda, K.,Andersson,
activated macrophages. Mediators Inflamm, 1-10. G., & Aberg, A.(2002). Conformational changes
Knowles, R. G., & Moncada, S. (1994). Nitric oxide in nitric oxide synthases induced by
synthasein mammal. Biochem. J, 298, 249-258. chlorzoxazone and nitroindazoles:
Korhonen, R., Lahti, A.,Kankaanranta, H., Crystallographic and computational analyses of
&Moilanen, E. (2005). Nitric oxide production inhibitor potency. Biochemistry, 41, 13915-
and signaling in inflammation. Curr. Drug 13925.
Targets Inflamm. Allergy, 4, 471-479. Van Acker, S. A., Tromp, M. N., Haenen, G. R., Van
Liang, Y. C., Huang, Y. T., Tsai, S. H., Lin-Shiau, S. Dervijgh, W. J., Bast, A. (1995). Flavonoids as
Y., Chen, C. F., Lin, J. K. (1999). Suppression of scavengers of nitric oxide radical. Biochem
inducible cyclooxygenase and nitric oxide Biophys Res Comm, 214, 755–759.
synthase by apigenin and related flavonoids in
mouse macrophages. Carcinogenesis, 20, 1945–
1952.
Mattace, G. R., Meli, R., Di Carlo, G., Pacilio, M., Di
Carlo, R. (2001). Inhibition of inducible nitric
oxide synthase and cyclooxygenase-2 expression
by flavonoids in macrophage J774A.1. Life
Sciences,68,921–931.
Morris, G.M., & Lim-Wilby, M. (2008). Molecular
Docking, Methods in Molecular Biology. In:
Molecular Modeling of Proteins, Kukol, A. (Ed.).
Humana Press, Totowa, New Jersey, pp: 365-
382.
Moroney, M. A., Alcaraz, M. J., Forder, R. A.,
Carey, F., Hoult, J. R. S.(1988). Selectivity of
neutrophil 5-lipoxygenase and cyclo-oxygenase
inhibition by an anti-inflammatory flavonoid
glycoside and related aglycone flavonoids. J
Pharm Pharmacol, 40, 787–792.