Introducción a la Biotecnología 2011

IIB-UNSAM

Introducción a los
Bioprocesos
Gastón Ortiz
gas.ortiz@gmail.com
Introducción a los Bioprocesos

Una breve historia
 Desde 5000 AC las civilizaciones egipcias y más tarde las
chinas comienzan a producir alimentos y bebidas
fermentadas.
 Sin embargo, pasan casi 7000 años para descubrir el
origen microbiano de la fermentación (1856).
 Otros 50 en utilizar las bacterias para producir compuestos
químicos industriales (1900).
 70 años más para obtener el primer organismo transgénico
(1972).
 Y 5 años más para la obtención de la primera proteína
humana expresada en bacteria. (somatostatina 1977)
 Introducción a los Bioprocesos

¿Que es un bioproceso?
 Es todo proceso industrial que involucra la manipulación

de organismos vivos o sus componentes celulares para

proveer bienes o servicios

Bienes: (antibióticos, hormonas, fermentos, vacunas,
ácidos orgánicos, amino ácidos, biocombustibles,
biomasa, etc.)

Servicios (biorremediación, biolixiviación, tratamiento
de efluentes)
Introducción a los Bioprocesos
 De acuerdo a su definición tenemos: Bioprocesos
y biotransformaciones.
Son los procesos mediante los cuales determinados SUSTRATOS
BIOPROCESO (nutrientes) son transformados por acción biológica (microorganismos,
células, tejidos) en BIOMASA y diversos PRODUCTOS

Biocatalizador

Glucosa + amonio + sales + oxígeno BIOMASA + PRODUCTOS + calor

Moléculas sencillas Moléculas complejas
Fuentes de carbono y energía, fuente de Antibióticos, drogas, vacunas, efluente
Nitrógeno y sales tratado, vitaminas, ácidos orgánicos,
aminoácidos, proteínas, hormonas,
Son los procesos en los que sustratos naturales o sintéticos
BIOTRANSFORMACIÓN son MODIFICADOS por medio de una Actividad Enzimática

Enzimas,
células
inmovilizadas

Sustrato + agua Sustrato modificado

Moléculas complejas Moléculas sencillas
Almidón Glucosa Fructosa
Un bioproceso se caracteriza entonces por:

Uso de un catalizador biológico: Enzima,
microorganismos, células vegetales, células
animales, células insecto, hongos filamentosos,
algas, plantas y animales

Uso de un Biorreactor: La reacción ocurre en
forma controlada
Artificial

Generación de un Producto o Servicio

Upstream Process

Downstream Process
Introducción a los Bioprocesos
Aspectos básicos de un proceso Biotecnológico
Upstream Processing Process Downstream Processing

Elección del
Elección del reactor.
Recuperación del

microorganismo.

Preparación de medio
(Formulación).

Esterilización.

Preparación del inoculo.

Elección del sistema de
operación: Bacth; Alimentado;
Sistema Continuo; etc.

Estequeometría y cinética.

Instrumentación y control.
producto por medio de
operaciones unitarias
(físicas/químicas)

Acondicionamiento y
estabilización del
producto

Formulación del producto
El microorganismo productor

Tenemos varias posibilidades

 Partir del microorganismo productor wild type
 Microorganismos modificados genéticamente
para tal fin.
 Recurrir a sistemas de expresión heteróloga
Microorganismos productores wild type

Ventajas
 Generalmente suele ser el mejor productor.
(seleccionado por la naturaleza)
 La manipulación genética es mínima o nula, esto
nos ahora tiempo y dinero.

Posibles desventajas
 Puede que no cumpla con las normas GRAS
(Generally recognized as safe)
 Su utilización pueden presentar dificultades al
momento del escalado y etapas danwstream. Ej
hongos filamentosos.
Algunos microorganismos productores wild type

Ac. orgánicos Alcoholes

Algunos microorganismos productores wild type

Antibióticos
Enzimas
Sistemas de expresión heteróloga

Son utilizados para la producción de proteínas
recombinantes

Ventajas
 Sistemas preparados para una finalidad determinada
 Amplia variedad de hospedadores
 Gran variedad de herramientas moleculares disponibles
(vectores, marcadores de selección, etc.)

Desventajas
 No siempre el producto final posee las mismas
características que el deseado.

Es por eso que debemos poner énfasis en elegir el mejor
sistema de expresión para nuestro fin
Sistemas de expresión heteróloga

A tener en cuenta para la elección del sistema de expresión

 Productividad (es difícil determinar a priori pero se un buen tip es
comenzar con una búsqueda de bibliografía)
 Complejidad estructural
 Modificaciones postraduccionales
 Bioactividad de la proteína de interés
 Manipulación del sistema de expresión
 Bioseguridad del sistema de expresión
Sistemas de expresión heteróloga
Sistemas de expresión heteróloga:
Escherichia coli

Ventajas
 Alta tasa de crecimiento
 Amplio conocimiento de su genética y fisiología
 Fácil manipulación genética: gran variedad de vectores y cepas disponibles,
alta eficiencia de transformación, etc)
 Fácil de cultivar
 Bajo costo de cultivo
 Alta acumulación de proteínas recombinantes (30% del total celular).
 Lisis y recuperación relativamente sencilla

Desventajas
 No es GRAS
 Contaminación con endotoxinas

 Proteínas intracelular con formación de cuerpos de inclusión

 No posee modificaciones postranducionales
Sistemas de expresión heteróloga:
Escherichia coli

Desventajas
 No todos los genes se expresan eficientemente debido a:

Características de la secuencia nucleotídica del gen endógeno.

Estabilidad y eficiencia traducción del RNAm

Diferencias de uso de determinados codones de

Deficiencia en el folding proteico, capacidad limitada de formación de
puentes S-S.
 Toxicidad de la proteína recombinante
 No es GRAS
 Contaminación con endotoxinas
 Proteínas intracelular con formación de cuerpos de inclusión
 Generalmente se requiere un refolding de la proteína
 No posee modificaciones post-traduccionales
Sistemas de expresión heteróloga:
Levaduras: (S. cerevisiae, K. lactis y P. pastoris)

Ventajas
 Unicelular eucariota, fácil crecimiento y manipulación
 Capacidad para realizar modificaciones postraduccionales
(glicosilación, acetilación, fosforilación, eliminación del Met-
1, procesamiento proteolítico de precursores)
 Fácilmente escalable
 Bajo o nulo nivel de endotoxinas
 Proteínas extracelulares e intracelulares

Desventajas
 Baja eficiencia de transformación
 Hiperglicosilación (S. cerevisiae principalmente)
Crecimiento microbiano

En un medio de cultivo apropiado los microorganismos se dividen
hasta que algún nutriente del medio de cultivo se agota (sustrato
limitante)

También puede detenerse el crecimiento por acumulación de
alguna substancia inhibidora formada por los mismos
microorganismos.

Hay dos aspectos claramente diferenciables que nos permiten
interpretar al crecimiento microbiano ya sea en un erlenmeyer como
en un reactor:
 Estequiométrico:

Nos permite conocer la concentración final de microorganismos a
obtener a partir de datos de la composición del medio de cultivo,
saber si hay formación de algún producto, etc.
 Cinético:

Nos dice con qué velocidad se lleva a cabo el proceso.
Crecimiento microbiano (Estequiometría)
Rendimientos
Dada la ecuación de crecimiento microbiano

S FCE + N FN + B O2 X Biomasa + P Producto + W H2O + C CO2

Para poder conocer la Estequiometría del proceso es necesario conocer los coeficientes
(S, N, B, X, P, W y C) para ello introduciremos el concepto de:
 Rendimiento: Se define como la cantidad en gramos de producto formado (biomasa,
EtOH, CO2,H2O etc) o reactivos consumidos (FN, Oxigeno), sobre gramos de fuente de
carbono y energía consumida FCE (glucosa, glicerol, etc)

Por que el signo

negativo ?

Como seria el rendimiento para el nitrógeno ?

Crecimiento microbiano (Estequiometría)
El carbono mol (C-mol)

Si deseamos efectuar cálculos estequiométricos debemos conocer el
rendimiento en moles.
 La pregunta es ¿qué peso de células (o biomasa) corresponde a "un mol"?.

Experimentalmente se vio que la composición elemental promedio de un
microorganismo es en (% p/p): C = 46.5; H = 6.49; 0 = 31.0; N = 10.85

De la cual podemos definir una "fórmula mínima": CH1.79O0.5N0.2 (en la que
está representado el 95% p/p de la biomasa el otro 5% son sales)

Entoces definimos un C-mol de biomasa como la cantidad de biomasa que
contiene un átomo gramo de Carbono.

Podemos definir 1 C-mol de FCE: Ej 1C-mol de glucosa (C6H12O6) esta

representado por CH20 y pesará 30 g

En general para obtener los gramos de 1C-moles de un compuesto dado
es:
Cn Hf Oq Nm C Hf/n Oq/n Nm/n 12+ f/n + 16.q/n + 14.m/n

Donde σX tiene unidades de (cmol/g) de X

Donde σS tiene unidades de (cmol/g) de S
Crecimiento microbiano (Estequiometría)
Ecuación de crecimiento y balances de materia

Balance de Carbono: Puesto que los rendimientos están referidos

a 1 C-mol de fuente de Carbono y energía, resulta

Tarea plantear los

¿Como seria el balance de materia para el Nitrogeno? balances para el resto
de los componentes
Hidrogeno y Oxigeno
¿De que factores de pende el rendimiento celular? Ayuda. fórmula mínima
de la biomasa: CH1.79O0.5N0.2
• Yx/s es f (FCE, FN) y de cómo son estos son metabolizados
• De la naturaleza microorganismo y como este aprovecha dichas fuentes
 Crecimiento microbiano (Cinética)
Velocidades volumétricas y especificas
Donde µ = rx/X
Los rendimientos pueden expresarse como
cocientes de velocidades
Y x/s = rx/rs = µ/qs
• Como se ve r1 (t1) = r2 (t2), esto
nos llevaría a pensar que el
microorganismo consume FCE a
la misma velocidad en ambos
tiempos. Esto es engañoso por
que al final del cultivo hay mas
células
•A diferencia de las velocidades
volumétricas, las velocidades
especifica nos dan idea de lo que
ocurre en el cultivo
Crecimiento microbiano (Cinética)
Ecuación de Monod dependencia de µ con el Sustrato limitante
El sustrato limitante es aquel que controlara la velocidad de crecimiento
del microorganismo. Ojo no necesariamente tiene que ser la FCE

Monod estudio la dependencia del µ con el sustrato limitante y encontró

que la incorporación de un sustrato limitante a la célula sigue una
cinética del tipo de Michaelis-Menten

Supuestos de Monod
•El proceso difusión del sustrato limitante
es rápido comparado con la cinética de
crecimiento
•El sustrato es metabolizado por una
única E que controla la velocidad de todo
el metabolismo
•El proceso sigue la cinética de
Michaelis-Menten
Crecimiento microbiano (Cinética)
¿De que factores depende el µ ?
La composición del medio de
cultivo (FCE, FN) afectan al µ
El sustrato limitante
S >> Ks  µ = µm
S<< Ks  µ = f (S)
Crecimiento microbiano (Cinética)
¿De que factores depende el µ ?
pH

10 g/l FCE
Crecimiento microbiano (Cinética)
Mantenimiento celular

Vimos que el rendimiento celular puede expresarse como

Y x/s = rx/rs = µ/qs

Pero esta ecuación solo nos dice que el consumo de sustrato
solo es posible cuando hay crecimiento.

Pregunta: ¿puede ocurrir consumo de sustrato sin que se
produzca crecimiento (generación de biomasa)?

Resp. Si por que el microorganismo debe mantener su
homeostasis.

A este consumo de FCE sin crecimiento de biomasa se lo
conoce como mantenimiento celular (propuesto por Pirt)
rs = r’s + ms.X
Ecuación de Pirt Otra forma de la ecuación de Pirt

qs = (µ / Y’x/s) + ms.X Divido por µ .X 1 / Y’x/s) + ms/µ

1/Yx/s = (1 µ

Y’x/s es el rendimiento máximo teórico el que tendría si no hay

mantenimiento celular en tanto que el Yx/s es el real el que mido
Crecimiento microbiano (Cinética)
Mantenimiento celular

¿Qué factores afectan el mantenimiento?

Ayuda (qs - (µ / Y’x/s)) / X = ms

 Resp. Todos los factores que afectan al µ y al Y’x/s

Temperatura,

pH

Composición del medio de cultivo particularmente
naturaleza del sustrato limitante (recordar la
dependencia de µ con S “Monod” )

Presión osmótica
Transferencia de Oxigeno. Modelo de la Película

¿Como llega el oxigeno al
microorganismo?
 1°debe este disolverse en el líquido
(Burbujas). Ley de Henry
(PO2 = H.C*)
 2°debe transferirse desde la burbuja al
microorganismo. Ley de Fick
(JO2 = -DO2 .(dC/dX))

El modelo que combina estos dos
principios es el modelo de la película,
este nos dice
 Que existe una película estanca de
líquido alrededor de la burbuja en donde
la transferencia de materia sigue la ley
de Fick
 La fuerza impulsora de esta
transferencia es la diferencia de
Concentraciones entre el seno del liquido
y la Burbuja
 Transferencia de Oxigeno Kla

Fick
JO2 = -DO2 . (dC/dL)
Henry
C* = PO2 / H
Transferencia de Oxigeno.
Factores que afectan al Kla.

Agitación: si aumenta la agitación aumenta el Kla por que:
 Disminuye el espesor de la película (pendiente mas pronunciada)

 Disminuye el tamaño de la burbuja el área volumétrica (A)

aumenta.

Viscosidad del cultivo: si aumenta la viscosidad disminuye el
Kla por que:
 Aumenta el espesor de la película

Temperatura: el Kla aumenta con la raíz cuadrada de la

temperatura, dado que el coeficiente de difusión aumenta con la
temperatura.

Detergentes: aumentan el Kla dado que disminuyen la tensión
superficial forman burbujas mas chicas aumenta el área
volumétrica de transferencia

Antiespumantes: estos aumentan la tensión superficial,
burbujas mas grandes, disminuye el Kla
Consumo de Oxigeno

Bueno sabemos que:
 El suministro de oxigeno esta dado por Ro2
 La velocidades de consumo de un sustrato limitante esta dada por la
ecuación de Monod.

 Al valor al cual C >> Ko se lo conoce como Cc (critico) y tiene un valor

del 15% de C*,en estas condiciones qo2 es independiente del oxigeno
disuelto.

Por lo que para que el microorganismo no note la falta de oxigeno,

es decir no se limite en oxigeno.
 El suministro debe igualar durante todo el transcurso del cultivo a la
velocidad de consumo de oxigeno ro2 max o qo2 max.
 Para que esto suceda el Kla de nuestro reactor tiene que cumplir con
la siguiente igualdad.

Kla = ro2 max / (C* - Cc)

Transferencia de Oxigeno
Equipo Kla

Tubo de ensayo sin agitación 10

Erlenmeyer de 1000 ml, con 10% de su 50-150

capacidad y agitación

Reactor tipo tanque agitado 100-1000 según la

agitación

Tipo Celular
µmax Kla apropiado

Cél. Animales 0.01-0.04 1-25

Cél. Vegetales 0.007-0.03 20-30

Bacterias 0.6-1.4 100-1000

Levaduras 0.2 - 0.6 100-1000

Hongos filamentosos
Bioreactores

Como ya se menciono anteriormente, el equipo donde se realiza el
proceso se denomina biorreactor o fermentador,

El mismo debe garantizar un ambiente uniforme y adecuado para el
desarrollo de los microorganismos

Para eso un biorreactor debe poseer:
 Sistema de Mezclado:

Debe mantener las células uniformemente distribuidas en todo el volumen de
cultivo a fin de prevenir la sedimentación o la flotación.

Minimizar los gradientes de concentración de nutrientes.
 Sistema de Termostatización:

Debe mantener constante y homogénea la temperatura.
 Sistema de Oxigenación:

Debe suministrar oxígeno a una velocidad tal que satisfaga el consumo
 Sistema de Esterilidad:

El diseño debe ser tal que permita mantener el cultivo puro (acero pulido reactores
de mas de 100 l o vidrio menor volumen).

Fácil de limpiar y de esterilizar (por calor húmedo preferentemente)

Mantener la asepsia durante el transcurso del cultivo (filtros de aire)
 Sistema de Control y Automatización:

Debe garantizar las condiciones estables de pH, O2, agitación y temperatura como
mínimo, también puede controlarse el volumen por medio de la alimentación, nivel
de espuma, etc.
Biorreactores de uso mas frecuentes
Tanque agitado
Ventajas
 Alta flexibilidad de operación
(controlada por agitación y flujo
de gas).
Desventajas
 Mecánicamente complejos
(agitador, eje, sellos, etc.).
 En muchas ocasiones provocan
alta cizalladura.
 Transferencia de O2 limitada
por el diseño de las paletas
 Difíciles de limpiar; mayores
posibilidades contaminación en
operaciones extendidas
Biorreactores de uso mas frecuentes
Air Lift
Características

Estructura sencilla.

Agitación por inyección de aire.

Separación física de las corrientes
ascendentes y descendentes.

Adecuado rendimiento de
transferencia de materia y calor.

Bajo shear.

Usos:
 Cultivo de células animales, vegetales,
procesos con catalizadores inmovilizados,
producción de proteínas unicelulares a
partir de metanol y tratamiento de aguas
residuales.
Biorreactores de uso mas frecuentes
Columna de burbujeo
Características

Estructura sencilla.

Agitación por inyección de aire.

Bajo shear.

Adecuado rendimiento de transferencia de
materia y calor.

Bajo costo.

Usos:
 Producción de levaduras de panificación,
cerveza, vinagre, tratamiento de aguas
residuales.
Biorreactores
Agitación mecánica (Tanques
agitados)
Mecánicamente complejos (agitador,
eje, sellos, etc.)
En muchas ocasiones provocan alta
cizalladura
Carga de gas limitada
por inundación del impelente
Flexibilidad de operación (controlada
por velocidad impelente y flujo de
gas)
Difíciles de limpiar; mayores
posibilidades contaminación en
operaciones extendidas
En medios no-Newtoniano se crean
canales de gas a través de zona
impelente
Agitación neumática (Airlift, y
Columnas de burbujeo)
Mecánicamente simples y robustos
Muy baja cizalladura, adecuados para
cultivos frágiles
Posibilidad de admitir altas cargas de gas
(especialmente los airlift)
Limitada flexibilidad. Requieren de un
diseño más cuidadoso
Fáciles de limpiar, posibilitan operación
aséptica extendida
Distribución más uniforme de la turbulencia
Sistemas de operación o de cultivo

Llamamos así al modo de operar el biorreactor, este puede
ser de forma continua o discontinua. Suponemos mezclado
Balance de materia perfecto

Velocidad de Velocidad de
salida consumo
Velocidad de Velocidad de Velocidad de
acumulación ingreso formación

Acumulación de volumen

Dependiendo como sean F1 y F2 tenemos tres

tipos de cultivos.
Opera en continuo • Si F1 = F2 Tenemos un Cult. Continuo.
• Si F1>0 y F2=0 Tenemos un Cult. Alimentado.
Opera en discontinuo
• Si (F1 y F2)= 0 Tenemos un Batch.
Cultivo en batch

Es el cultivo mas simple

Se realiza a volumen constante

La composición inicial del medio de cultivo determina el curso del cultivo
 Ecuación de diseño de un batch

En un Batch tenemos que F1 = F2 =0 Batch

Por lo que = 0 = cte

Entonces el balance de materia nos queda

Como V= cte
Descripción matemática del Batch en fase
exponencial

¿Para que nos sirve todo esto?

Para calcular el tiempo que nos
demandara el proceso.
 Descripción matemática del Batch limitado en
Oxigeno

¿Que sucede si el cultivo se nos limita en Oxigeno?
 ¿los microorganismos continúan creciendo?

 ¿el tiempo del proceso se verá afectado?

Resp. 1: Sí, continúan creciendo.
Resp. 2: Sí , el tiempo del

 En estas condiciones el
proceso será mayor ¿Por
microorganismo continua creciendo qué?
pero quien manda a que velocidad
debe hacerlo es el sustrato limitante
en este caso el Oxigeno
Características de un cultivo batch

La duración del cultivo batch depende
esencialmente de las condiciones iniciales del
cultivo.

Una vez inoculado el medio, la concentración de
biomasa aumenta a expensas de los nutrientes
disponibles.

Cuando el sustrato que limita el crecimiento se
agota, finaliza el batch.

El crecimiento puede cesar también por la
acumulación de algún producto toxico. (esto se puede
solucionar con un cultivo continuo)
 Cultivo continuo
Batch Cult. continuo

Se inicia
con un
batch
 Ecuación de diseño de un cultivo continuo
Cult. continuo

En un C. Continuo tenemos que F1 = F2 = F

Por lo que = 0 = cte V= cte

El balance de materia nos queda

Despejando V Donde D = F / V y es la
velocidad de dilución.

En el estado estacionario
 Balances de materia en continuo
Biomasa

Sustrato: Para el sustrato tenemos

El sustrato limitante es quien controla la velocidad de

crecimiento en el C.C, por lo que podemos escribir la
ecuación de Monod en términos de la velocidad de
dilución D
Combinando los balances de Biomasa y Sustrato tenemos la
dependencia de X con D
 Balances de materia en continuo
Combinando los balances de Biomasa y Sustrato en el estado
estacionario, tenemos la dependencia de X con D.
Nos dice que cual será la concentración de biomasa en el estado
estacionario

Situación real
cuando tengo
mantenimiento

Velocidad Dc
óptima de Dilución critica
operación 80% cuando el D es
del µmax igual al µmax
Cultivo continuo

Aplicaciones del cultivo continuo
 Permite obtener los parámetros de crecimiento µmax, ms,
Ks, Y’x/s, entre otros.
 Permite realizar estudios fisiológicos.

Podemos discriminar los efectos de la velocidad de
crecimiento µ, de la composición del medio de cultivo y del pH
y la Temperatura, sobre la fisiología celular del
microorganismo.
 Permite realizar estudios de ingeniería metabólica.

Inconvenientes del cultivo continuo
 Inestabilidad genética de la cepa en cultivos extendidos
(perdida de plásmidos)
 Riesgos de contaminación en cultivos extendidos.
 Cultivo Batch Alimentado
En este tipo de cultivos el volumen
varia con el tiempo debido a la
alimentación esto permite mantener
controlada la concentración “Ci”
dentro del reactor.

El objetivo de este cultivo es

 Al igual que el continuo es evitar la acumulación de

productos tóxicos o inhibitorios

 Controlar la velocidad de crecimiento µ de forma constante

(alimentado exponencial) o por debajo de cierto valor

(alimentado lineal)
 Incrementar la obtención de productos como intermediarios

del metabolismo primario y proteínas recombinantes

 Maximizar la producción de biomasa o de proteínas

unicelulares.
Productos

Productos de bajo peso molecular: alcoholes,
ác. orgánicos, aa, nucleótidos, antibióticos, etc.
 Tipo I: Productos finales del catabolismo anaeróbico

 Tipo II: Intermediarios del metabolismo primario

 Tipo III: Productos del metabolismo secundario

Productos de alto peso molecular:

polisacáridos, proteínas, antígenos, enzimas etc.
Productos Tipo I (productos finales del
catabolismo anaeróbico)

En este grupo tenemos: etanol, acido láctico, acético, butírico,
butanol y otros compuestos asociados a procesos anaeróbicos.

Su formación es consecuencia directa de la degradación FCE
acoplada a la producción de ATP por fosforilación al nivel del
sustrato.(proceso anaeróbico)

Siguen una cinética qp =αµ + β
 Donde β es directamente proporcional al ms y α con
1/Y’x/s.

Por lo que para este tipo de productos busco:
 Que el mantenimiento sea grande, por ejemplo vario temperatura
o tonicidad del medio.
 Que m se lo mas pequeño posible, lo logro por ejemplo limitando
en Nitrógeno al cultivo.
 En definitiva busco un Y’x/s bajo de forma tal que todo el sustrato
sea destinado a la formación de productos
 Productos Tipo II (Intermediarios del
metabolismo primario)

En este grupo tenemos: aminoácidos, nucleótidos, vitaminas y
ácidos orgánicos provenientes del ciclo de krebs.

En este caso los procesos de obtención son aerobios.

A diferencia de los productos tipo I, no existe una dependencia
directa entre la FCE y la obtención del producto.

Al ser compuestos intermediarios del metabolismo primario,
los microorganismos mas utilizados son los modificados
genéticamente y estos se combinan con un buen sistema de
cultivo (generalmente batch alimentado o cultivo continuo).
 Ejemplo: producción de lisina por Corynebacteriuin
glutamicum mutante en homoserina deshidrogenasa
auxotrofo para metionina y treonina
 Productos Tipo II (Ej. producción de lisina)
La estrategia para obtener
lisina consiste en: Retroinhibición
concertada

Realizar el cultivo en
condiciones tales que la
concentración de treonina
libre sea mínima. ¿Cómo se
logra esto?

Limitando el cultivo en
treonina (batch alimentado
exponencial o cultivo
continuo)

Esto nos demuestra lo
importante que resulta la
elección del sistema de Auxotrofo
cultivo adecuado para
nuestra cepa.
Productos Tipo III (Metabolitos secundarios)

En este grupo tenemos: antibióticos, las toxinas, los alcaloides y las
giberelinas.

Frecuentemente los precursores específicos para la biosíntesis de estos

productos son obtenidos por modificación de metabolitos primarios.

Estos precursores suelen ser limitantes de la biosíntesis.
 Es conveniente contar con microorganismos deficientes en los mecanismos de
regulación de la síntesis de los precursores.

Estos productos requieren un gasto de ATP adicional por lo que es conveniente
que el ms sea lo menor posible.

Por otra parte las fuentes de nitrógeno fácilmente metabolizadas como sulfato
de amonio no son recomendables, en su lugar se utiliza harina de soja.

Los productos de este grupo se forman cuando los microorganismos crecen a µ
bajos.
 A µ altos las enzimas asociadas al metabolismo secundario se encuentran reprimidas
(represión catabólica)

Finalmente estos tipos de productos producen un feed back negativo (su
acumulación inhibe su síntesis)

Pregunta: ¿que sistema de cultivo elijo para este tipo de productos?
 El cultivo continuo o bath alimentado, ya que con esto puedo controlar el µ y mantener
a raya el feed back negativo del producto
 Resumen productos Tipo: I, II y III
Producto Tipo cultivo ¿ms? µ?
¿µ Sistema de cultivo
Batch limitado en
nitrógeno
I Anaerobio Alto Bajo
Batch alimentado
Cultivo continuo
Alto o Bajo
Batch alimentado
II Aerobio (depende del Bajo
Cultivo continuo
producto)

Bajo
(la formación de Batch alimentado
III Aerobio producto consume
Bajo
Cultivo continuo
energía)

Alto
(siempre y cuando a m
altos no forme
Biomasa Aerobio Bajo
productos).
Batch alimentado
Ej. efecto crabtree en
S. cereviciae
Productos de alto peso molecular

En este grupo tenemos: polisacáridos, proteínas,
antígenos, enzimas, etc.

Es importante entender la cinética de formación le estos
productos, para ello definimos:
 La concentración intrínseca de nuestro producto i (enzima,
antígeno, etc) se define como: (Ri = Xi/X)

Donde Xi es la cantidad de producto que obtenemos g.proteínas, UE, etc y X son los g.biomasa.
 Por otra parte la velocidad neta de formación de nuestro producto será igual
a lo que se forma menos lo que se degrada.

La variación de la concentración intrínseca en el tiempo es:

 Tenemos dos factores que afectan a Ri

La velocidad neta de producción

La velocidad con la que se diluye (µ.Ri)
Productos de alto peso molecular

Para maximizar su producción

Entonces

Es decir quiero un crecimiento balanceado, en donde
la velocidad de producción debe ser igual a la de
dilución
 ¿Cómo lo logro? Enzima inducible en
 Experimentando a varios K. Latis
D en un continuo

K. lactis limitado en lactosa

D (h-1) Ri (UE/mg.biomasa)
0,1 8,25
0,25 18,3
 Downstream Processing
1. SEPARACIÓ
SEPARACIÓN CELULAR Intracelular

remoció
remoción del
componente mámás 2. DISRUPCIÓ
DISRUPCIÓN CELULAR
abundante

3. REMOCIÓ
REMOCIÓN DE RESTOS CELULARES
Es muy importante la elecció
elección del Y DESECHOS
PASO INICIAL, ya que es el que debe
eliminar la mayorí
mayoría de los Extracelular
contaminantes. Los pasos 4. CONCENTRACIÓ
CONCENTRACIÓN
subsiguientes son empleados para
eliminar los contaminantes de menor
importancia 5. PURIFICACIÓ
PURIFICACIÓN DE ALTA RESOLUCIÓ
RESOLUCIÓN

6 ACABADO
 Downstream Processing
1. Remoción celular: centrifugación y filtración.
2. Disrupción celular y separación de restos celulares:
• Homogenizadores: La técnica más recomendada para alta escala son los
homogeinizadores (Gaulin homogenizer).
• Operan a densidades celular del 15 a 20 % del peso seco.
• La concentración celular no afecta la eficiencia
• Es necesario refrigerar (4-5ºC)
• Los modelos más grandes operan a 6,000 L/h (levaduras y bacterias)
• Molinos de perlas
• Las células se rompen mediante la abración generada por pequeñas perlas de vidrio
(0.3-0.4mm φ)
• concentración de células afecta la eficiencia, la concentración óptima ∼ 30-60% peso
húmedo
• Los modelos mas grandes operan a 2000 L/h
• Ruptura química o enzimática
• Limitado a baja escala (Lysozyme, Triton, otras)
Downstream Processing
3. Separación de restos celulares
• centrifugación (no adecuada)
• Ultrafiltración (300,000 – 500,000 o mayor)
• Microfiltración (0.1µ m.)
• Partición en dos fases acuosas
• CDR (cell Debris Remover: Whatman)
4. Concentración
• Los productos deben concentrarse hasta 10-50 veces.
• Técnica preferida : Ultrafiltración
• partición líquido-líquido. Extracción con solventes
• Precipitación (sulfato de NH4)
• Evaporación o destilación
Downstream Processing

5. Purificación de alta resolución

• Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC)
• Cromatografía de intercambio iónico de alta
resolución
• Cromatografía de afinidad
• Cromatografía metal quelante (IMAC)
6. Acabado
• Esterilización y estabilización del producto
• Deshidratación, liofilizado, estabilización (sales)
Downstream Processing
¿Cómo elegimos las operaciones y la secuencias ?

Utilizando de las reglas de oro de la purificación

 REGLA 1 “Elegir procesos de separación basados en diferentes

propiedades físicas, químicas o bioquímicas”
 REGLA 2 “Separar las impurezas más abundantes primero”
Es importante eliminar el agua en las primeras etapas del proceso.
Tratar de reducir el material de trabajo hasta un 90% del volumen inicial
 REGLA 3 “Seleccionar un procesos que permita aprovechar al
máximo las diferencia entre las propiedades fisicoquímicas del
producto y los contaminantes.
Se deben conocer las propiedades del producto y de las principales
impurezas
 REGLA 4 “Realizar las separaciones más caras y difíciles al
final”
KEEP IT SIMPLE!
Bibliografía

Microbiología Industrial. Rodolfo Ertola,
Osvaldo Yantorno y Carlos Mignone.

Encyclopedia of Bioprocess Tech [Vols 1-5,
Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation]
- M. Flickinger, S. Drew (Wiley, 1999)

Bioprocess Engineering Principles. Pauline M.
Doran

Cat. de Biotecnología - Bioprocesos II UNQUI

Cat. de Ingeniería bioquímica UNLP