Rev Argent Microbiol.

2018;50(2):211---215

REVISTA ARGENTINA DE
MICROBIOLOGÍA
www.elsevier.es/ram

INFORME BREVE

Validación de una técnica de Dot blot para la detección

de Cercospora kikuchii en plantas de soja
Mónica C. Mattio, María V. Peretti Canale, María C. Lurá y María G. Latorre Rapela ∗

Cátedra de Microbiología General, Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas, Universidad Nacional del Litoral, Ciudad
Universitaria, Santa Fe, Pcia. de Santa Fe, Argentina

Recibido el 1 de marzo de 2017; aceptado el 17 de junio de 2017

Disponible en Internet el 20 de noviembre de 2017

PALABRAS CLAVE Resumen Cercospora kikuchii, fitopatógeno usual en plantas de soja, ocasiona deterioro en las
Dot blot; cosechas. Su identificación precoz y correcta evitaría el uso indebido de plaguicidas y permitiría
Cercospora kikuchii; iniciar un tratamiento adecuado. Una técnica rápida, económica y de fácil ejecución es el Dot
Validación blot, capaz de reconocer la presencia de una proteína específica del género conocida como
CFP (Cercosporin Facilitator Protein). El objetivo de este trabajo fue validar dicha técnica para
garantizar la fiabilidad del resultado. Para ello, se procesaron 29 plantas de soja infectadas y
31 plantas sanas teniendo en cuenta una confianza deseada del 95% y un error permitido del
5%. La técnica presentó una sensibilidad diagnóstica del 93,3% y una especificidad diagnóstica
del 96,7%. La eficacia fue del 95% y los valores predictivos positivo y negativo del 96,6 y el
93,5%, respectivamente. Estos resultados la postulan como una herramienta útil para detectar
precozmente C. kikuchii en plantas de soja.
© 2017 Asociación Argentina de Microbiologı́a. Publicado por Elsevier España, S.L.U. Este es un
artı́culo Open Access bajo la licencia CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-
nc-nd/4.0/).

KEYWORDS Validation of the technique based on Dot blot for the detection of Cercospora
Dot blot; kikuchii in soybean plants
Cercospora kikuchii;
Validation Abstract Cercospora kikuchii is a common pathogen in soybean plants that causes crop spoi-
lage. Its early and precise identification would prevent the misuse of pesticides and allow the
initiation of an appropriate treatment. A quick, economical and easy-to-execute technique
is the Dot blot, capable of recognizing the presence of a genus-specific protein called CFP
(Cercosporin Facilitator Protein). The objective was to validate this technique to guarantee the

∗ Autor para correspondencia.

Correo electrónico: latorrerapela@gmail.com (M.G. Latorre Rapela).

https://doi.org/10.1016/j.ram.2017.06.003
0325-7541/© 2017 Asociación Argentina de Microbiologı́a. Publicado por Elsevier España, S.L.U. Este es un artı́culo Open Access bajo la
licencia CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
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reliability of the results. For that purpose, 29 infected soybean plants and 31 healthy plants
were processed, taking into account a 95% desired confidence level and a permissible error
of 5%. The technique provided a diagnostic sensitivity of 93.3% and a diagnostic specificity
of 96.7%. The efficiency was 95% and positive and negative predictive values were 96.6% and
93.5%, respectively. These results postulate it as a useful resource for the early detection of C.
kikuchii in soybean plants.
© 2017 Asociación Argentina de Microbiologı́a. Published by Elsevier España, S.L.U. This is an
open access article under the CC BY-NC-ND license (http://creativecommons.org/licenses/by-
nc-nd/4.0/).

En Argentina, la soja es el principal producto de la agri-
cultura nacional2 . Sin embargo, su cultivo se encuentra
limitado por las enfermedades de fin de ciclo (EFC) debido a
que estas provocan madurez anticipada de la planta y reduc-
ción del rendimiento o de la calidad de las semillas, lo que
genera graves deterioros en las cosechas y pérdidas en la
producción12 . Entre las EFC que presentan mayor prevalen-
cia e incidencia en las principales áreas sojeras del país se
encuentra el tizón de la hoja y mancha púrpura de la semilla,
enfermedad ocasionada por el hongo Cercospora kikuchii3 .
La patogenicidad de este hongo se asocia a la produc-
ción de la exotoxina cercosporina, responsable de muchos
de los síntomas de la enfermedad. La cercosporina ha sido
aislada in vitro de al menos 34 especies de Cercospora,
entre las que se encuentra Cercospora sojina. La produc-
ción y la exportación de cercosporina hacia el exterior del
hongo están reguladas por la expresión del gen cfp, que codi-
fica la proteína denominada Cercosporin Facilitator Protein
(CFP)1 .
Debido a que este patógeno se encuentra presente en
estadios tempranos del cultivo en forma latente y asin-
tomática, resulta indispensable disponer de métodos de
diagnóstico precoces y certeros, que contribuyan a generar
medidas de control efectivas, para optimizar los recursos y
reducir los efectos negativos sobre el medio ambiente por
el uso indebido de plaguicidas. Asimismo, dichos métodos
permitirían originar información respecto de la interacción
patógeno-hospedante8 .
Hasta el momento, no existen en el mercado métodos
de detección temprana de este patógeno. En la actuali-
dad, su diagnóstico se realiza cuando la planta ya presenta
los síntomas característicos en las etapas avanzadas, uti-
lizando métodos tradicionales (aislamiento, cultivo del
hongo, observación de características macro y microscópi-
cas) que requieren de personal especializado y prolongados
períodos de tiempo (semanas).
Por ello, el desarrollo de un método de detección pre-
coz de Cercospora en plantas de soja es de gran necesidad.
Entre las principales técnicas disponibles que permiten
complementar o reemplazar los procedimientos de labora-
torio tradicionales se encuentran las inmunoquímicas y las
moleculares8 .
Latorre Rapela7 desarrolló y optimizó un método de
detección precoz para el género Cercospora, capaz de reco-
nocer la presencia de la proteína CFP, específica del género.
Dicho método es muy versátil y aplicable al diagnóstico de
un gran número de muestras y se basa en la técnica de
Dot-enzyme linked immunosorbent assay (Dot-ELISA). Esta
metodología consiste en un ELISA rápido, que utiliza como
soporte sólido papel de nitrocelulosa, caracterizado por su
excelente capacidad para adsorber proteínas13 .
Para su correcta aplicación, debe efectuarse su vali-
dación diagnóstica, evaluando dicha metodología en un
número considerable de plantas de soja enfermas y sanas,
según el intervalo de confianza (IC) deseado y el error
estimado. Entre los principales indicadores estadísticos se
deben determinar la sensibilidad y la especificidad, la efi-
cacia y los valores predictivos positivo (VPP) y negativo
(VPN)4 .
El objetivo del presente trabajo fue validar la técnica de
Dot blot para la detección precoz de C. kikuchii en plantas de
soja, desarrollada previamente en el laboratorio de Micro-
biología General de la Facultad de Bioquímica y Ciencias
Biológicas de la Universidad Nacional del Litoral.
Para tal fin, se trabajó con 29 muestras positivas (hojas de
plantas infectadas experimentalmente con C. kikuchii NBRC
6711, cepa perteneciente a la colección japonesa NITE Bio-
logical Resource Center [NBRC]) y con 31 muestras negativas
(hojas de plantas sanas), acorde con lo establecido para
una sensibilidad diagnóstica (DSe) y especificidad diagnós-
tica (DSp) estimada del 98%, con una confianza deseada del
95% y un error permitido del 5%6 .
Las muestras positivas se obtuvieron a partir de plantas
de soja cultivadas e inoculadas bajo condiciones de creci-
miento controladas. El cultivo de las plantas se llevó a cabo
utilizando semillas RAS16, grupo de madurez 5, que a simple
vista no presentaban daño mecánico por almacenamiento
o enfermedad. Para el pregerminado de las semillas, estas
se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 0,5% y luego
se colocaron en bandejas plásticas que contenían papel de
filtro embebido en agua sobre una capa de algodón, a fin
de mantener las condiciones de humedad apropiadas. Estas
bandejas se mantuvieron bajo condiciones de oscuridad con-
tinua a una temperatura de 25 ± 0,2 ◦ C durante 96 h, en una
incubadora modelo I-501PF (INGELAB, Argentina). Luego, las
semillas pregerminadas se dispusieron en macetas plásticas
de 300 ml, estas macetas contenían tierra-arena-vermiculita
en proporción 2:1:1, a 1,5 cm de la superficie. Las plantas
continuaron su desarrollo en la incubadora bajo condiciones
alternadas de luz (16 h luz/8 h oscuridad), a la temperatura
ya citada, y durante su crecimiento fueron fertilizadas con
solución de Hoagland o solución nutritiva de Jensen11 . Una
Validación de una técnica de Dot blot para la detección de Cercospora kikuchii
1 2 3 4 5 6
1 1 4 2 1 2
Figura 1 Dot blot aplicado a extractos de plantas sanas e infectadas con Cercospora kikuchii NBRC 6711. Calles 4, 5 y 6: plantas
sanas. Calles 7, 8, 9 y 10: plantas inoculadas con la cepa de referencia C. kikuchii NBRC 6711. Calle 1: control negativo (extracto de
Penicillium sp.). Calle 2: control negativo (extracto de Alternaria sp.). Calle 3: falso positivo. Calle 11: control positivo (extracto
de C. kikuchii NBRC 6711).
vez que las plantas alcanzaron el estado fenológico V3, se
inocularon con una suspensión de C. kikuchii NBRC 6711.
Para la preparación del inóculo, el hongo se sembró en
5 tubos que contenían agar papa dextrosa; estos se incu-
baron durante 4 días a 25 ± 0,2 ◦ C, bajo ciclos alternados
de luz (16 h luz/ 8 h oscuridad). Transcurrido dicho tiempo,
se agregaron 5 ml de agua destilada estéril a cada tubo y
se procedió a desprender las estructuras fúngicas mediante
un raspado suave de la superficie del cultivo con ansa. La
suspensión se cuantificó mediante un recuento en placa
en superficie y la concentración del inóculo se ajustó en
104 UFC/ml.
Para la inoculación se seleccionaron las hojas trifoliadas
correspondientes al primer y segundo par de hojas completa-
mente desplegadas. Se asperjaron con un volumen de 2,5 ml
del inóculo por planta, humedeciendo ambas caras de las
hojas. Luego, se cubrieron con bolsas plásticas transparen-
tes y perforadas, previamente humedecidas en su interior, y
así se mantuvieron durante 24 h a fin de proveer las condicio-
nes de humedad y mojado foliar adecuadas para estimular
el proceso de infección7 .
Una vez inoculadas, las plantas se colocaron nueva-
mente en la incubadora manteniendo las condiciones de
temperatura y ciclos de luz/oscuridad empleados para su
crecimiento.
Transcurridos 4 días, se recolectaron las hojas trifoliadas
y se lavaron 3 veces con agua estéril para eliminar restos
de inóculo adheridos a la superficie foliar. Se observaron
a simple vista en busca de lesiones macroscópicas y con
lupa estereoscópica (BOECO Germany) en busca de lesio-
nes no visibles a simple vista. Las zonas de tejido lesionado
se cortaron con un bisturí y, posteriormente, se realizó la
extracción de las proteínas totales siguiendo el método pro-
puesto por Rollins et al.14 .
El tiempo de muestreo de 4 días se seleccionó teniendo en
cuenta los resultados logrados por Latorre Rapela7 , y la téc-
nica de Dot blot se llevó a cabo según el diseño previamente
213
7 8 9 10 11
Puro
D 1/2
D 1/8
D 1/32
D1/64
8 32 128 16 64 score
descrito por este mismo autor. A modo de resumen, sobre
una membrana de nitrocelulosa se depositaron los extractos
proteicos solubles puros y cantidades decrecientes de aque-
llos (1/2, 1/8, 1/32 y 1/64). Posteriormente, la membrana
se secó a temperatura ambiente y se bloqueó con solución
salina de fosfatos (PBS)-leche 5%. Después de 3 ciclos de
lavado con PBS-Tween 20 (PBS-T) durante 5 min, se incubó
con suero de conejo anti-CFP diluido 1/500 en PBS-leche al
1%. Luego de una nueva etapa de lavado (3 veces), se incubó
con suero anti-IgG total de conejo conjugado con peroxi-
dasa, diluido 1/500 con PBS-leche al 1%. Tras otra etapa
de lavado (3 veces), se agregó como reactivo revelador
una solución de tetraclorhidrato de 3,3 -diaminobenzidina y
peróxido de hidrógeno (Invitrogen Argentina S.A.). La reac-
ción se detuvo con una etapa de lavado con agua. Todos
los pasos de incubación se realizaron en agitación mode-
rada. Como control positivo se utilizó el extracto proteico
de C. kikuchii NBRC 6711 y como controles de especifici-
dad de género, los extractos proteicos de Penicillium sp. y
Alternaria sp.
Para facilitar la lectura visual y disminuir la subjetivi-
dad de las observaciones, se estableció un score o puntaje
asignando valores a las señales obtenidas y multiplicándo-
los entre sí. Cada señal obtenida sobre la membrana se
consideró que tenía una base numérica igual a 4, 2 o 1,
dependiendo de si la señal era muy fuerte, tenue/baja o
no visible, respectivamente. Luego, los puntajes asignados
a cada una de las 5 observaciones correspondientes a cada
muestra (la original y sus 4 diluciones) se multiplicaron y
el resultado se consideró su score final. Por ejemplo, en la
figura 1, para la muestra correspondiente a la calle 7, el
score se determinó de la siguiente manera, 4 × 2 × 1 × 1 × 1
= 8.
Se definió una línea de corte a través de la curva ROC
utilizando el programa MedCalc y se consideró un score ≤ 2
para las plantas sanas y uno ≥ 4 para las plantas enfermas.
Para el análisis estadístico de los resultados se utilizó una
214 M.C. Mattio et al.

dores principales del rendimiento durante la validación de

Tabla 1 Tabla de contingencia de presencia de enfermedad
una prueba5 .
por técnica diagnóstica
La técnica de Dot blot empleada presentó una DSe del
Síntomas típicos 93,3% (IC95% = 84,4-100) y una DSp de 96,7% (IC95% = 90,3-100),
valores inferiores al 98% estimado. Sin embargo, dichos valo-
Presencia Ausencia Total res sí están comprendidos dentro del IC seleccionado para
Dot blot la validación de la técnica (95%).
Positivo 28 1 29 Estas estimaciones son la base del cálculo de otros pará-
Negativo 2 29 31 metros, como los VPP y los VPN, a partir de los cuales se
Total 30 30 60 realizan inferencias sobre los resultados de la técnica5 . El
VPP del 96,6% y el VPN del 93,5% indican que la probabi-
lidad de que la planta esté realmente infectada (VPP) o
tabla de contingencia de las variables enfermedad y técnica realmente sana (VPN) es muy alta cuando se aplica esta
de detección o de diagnóstico10 . técnica diagnóstica y los scores antes señalados.
Los parámetros de validación evaluados fueron: La eficacia de la prueba fue del 95%, lo que revela que
la probabilidad de que el patógeno sea detectado correcta-
a. DSe = VP/(VP + FN). mente es también elevada15 .
b. DSp = VN/(VN + FP). Al comparar estos resultados con los obtenidos por Peretti
c. Eficacia = (VP + VN)/(VP + VN + FP + FN). Canale et al.11 para la técnica de PCR, se puede observar que
d. VPP = VP/(VP + FP). ambas metodologías presentaron parámetros de validación
e. VPN = VN/(VN + FN) similares. No obstante, el Dot blot es una prueba de diagnós-
tico económica y de fácil ejecución en laboratorios de baja
El VP correspondió al número de los verdaderos positivos, complejidad13 . Al generar un precipitado coloreado, tam-
el VN al de los verdaderos negativos, el FP al de los falsos bién podría ser utilizada en el campo como un método de
positivos y el FN al de los falsos negativos. screening9 , sin la necesidad de disponer de equipos especí-
Se calcularon los intervalos de confianza para la DSe y DSp ficos.
empleando las ecuaciones 1 y 2, considerando una confianza Por lo tanto, el método de Dot blot descrito y validado
del 95%: es una metodología útil para la detección de C. kikuchii en
 plantas de soja, ya que ofrece resultados positivos y nega-
DSe (1 − DSe) tivos que permiten confirmar o descartar la presencia de
IC95% (DSe) = DSe ∓ 1, 96 (1)
VP + FN este patógeno con un elevado nivel de confianza en etapas
 tempranas de infección.
DSp (1 − DSp) Además, esta metodología podría ser utilizada para la
IC95% (DSp) = DSp ∓ 1, 96 (2)
FP + VN detección de otras especies de Cercospora productoras de
cercosporina, como es el caso de C. sojina. Cabe desta-
A manera de ejemplo, se muestra en la figura 1 el Dot
car que durante la optimización del método, Latorre Rapela
blot aplicado a extractos de plantas sanas e infectadas con
obtuvo similares resultados para ambas especies7 .
C. kikuchii NBRC 6711.
Los resultados alcanzados en el presente trabajo son los
De las 29 muestras de plantas enfermas analizadas, solo
primeros de su tipo en Argentina para el diagnóstico de esta
2 presentaron un score ≤ 2, lo que indica que hubo solo 2
importante enfermedad de fin de ciclo de la soja y brindan
falsos negativos con este método, y de las 31 muestras de
la posibilidad de contar con una valiosa herramienta para
plantas sanas, solo una arrojó un resultado falso positivo, al
el perfeccionamiento de los procedimientos fitosanitarios
presentar un score ≥ 4 (fig. 1, calle 3), estos resultados se
actuales, ya que el diagnóstico precoz de las enfermeda-
volcaron en la tabla 1.
des, de forma rápida y precisa, evita el uso desmedido o
Con los resultados obtenidos se calcularon luego los pará-
incorrecto de compuestos químicos como plaguicidas.
metros de validación antes mencionados, que se expresan en
la tabla 2.
Las estimaciones de la DSe (proporción de plantas que se
sabe que están infectadas y que dan positivo en una prueba) Responsabilidades éticas
y de la DSp (proporción de plantas que se sabe que no están
infectadas y que dan negativo en una prueba) son los indica- Protección de personas y animales. Los autores declaran
que para esta investigación no se han realizado experimen-
tos en seres humanos ni en animales.
Tabla 2 Calidad de la detección con la técnica propuesta
Parámetros de validación
Confidencialidad de los datos. Los autores declaran que en
Sensibilidad diagnóstica 93,3% (IC95% = 84,4-100) este artículo no aparecen datos de pacientes.
Especificidad diagnóstica 96,7% (IC95% = 90,3-100)
Eficacia 95,0%
Valor predictivo positivo 96,6% Derecho a la privacidad y consentimiento informado. Los
Valor predictivo negativo 93,5% autores declaran que en este artículo no aparecen datos de
IC95% : intervalo de confianza del 95%. pacientes.
Validación de una técnica de Dot blot para la detección de Cercospora kikuchii
Financiación
Este trabajo se realizó en el marco del Proyecto CAI + D 2011,
financiado por Universidad Nacional del Litoral, Argentina y
del Proyecto Federal de Innovación Productiva PFIP 2009-1
evaluado/financiado por COFECYT.
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no existen conflictos de intereses.
Agradecimientos
Se agradece a la Dra. Roxana Maumary por la desinteresada
provisión de las semillas utilizadas.
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