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2018;50(2):211---215
REVISTA ARGENTINA DE
MICROBIOLOGÍA
www.elsevier.es/ram
INFORME BREVE
Cátedra de Microbiología General, Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas, Universidad Nacional del Litoral, Ciudad
Universitaria, Santa Fe, Pcia. de Santa Fe, Argentina
PALABRAS CLAVE Resumen Cercospora kikuchii, fitopatógeno usual en plantas de soja, ocasiona deterioro en las
Dot blot; cosechas. Su identificación precoz y correcta evitaría el uso indebido de plaguicidas y permitiría
Cercospora kikuchii; iniciar un tratamiento adecuado. Una técnica rápida, económica y de fácil ejecución es el Dot
Validación blot, capaz de reconocer la presencia de una proteína específica del género conocida como
CFP (Cercosporin Facilitator Protein). El objetivo de este trabajo fue validar dicha técnica para
garantizar la fiabilidad del resultado. Para ello, se procesaron 29 plantas de soja infectadas y
31 plantas sanas teniendo en cuenta una confianza deseada del 95% y un error permitido del
5%. La técnica presentó una sensibilidad diagnóstica del 93,3% y una especificidad diagnóstica
del 96,7%. La eficacia fue del 95% y los valores predictivos positivo y negativo del 96,6 y el
93,5%, respectivamente. Estos resultados la postulan como una herramienta útil para detectar
precozmente C. kikuchii en plantas de soja.
© 2017 Asociación Argentina de Microbiologı́a. Publicado por Elsevier España, S.L.U. Este es un
artı́culo Open Access bajo la licencia CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-
nc-nd/4.0/).
KEYWORDS Validation of the technique based on Dot blot for the detection of Cercospora
Dot blot; kikuchii in soybean plants
Cercospora kikuchii;
Validation Abstract Cercospora kikuchii is a common pathogen in soybean plants that causes crop spoi-
lage. Its early and precise identification would prevent the misuse of pesticides and allow the
initiation of an appropriate treatment. A quick, economical and easy-to-execute technique
is the Dot blot, capable of recognizing the presence of a genus-specific protein called CFP
(Cercosporin Facilitator Protein). The objective was to validate this technique to guarantee the
https://doi.org/10.1016/j.ram.2017.06.003
0325-7541/© 2017 Asociación Argentina de Microbiologı́a. Publicado por Elsevier España, S.L.U. Este es un artı́culo Open Access bajo la
licencia CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
212 M.C. Mattio et al.
reliability of the results. For that purpose, 29 infected soybean plants and 31 healthy plants
were processed, taking into account a 95% desired confidence level and a permissible error
of 5%. The technique provided a diagnostic sensitivity of 93.3% and a diagnostic specificity
of 96.7%. The efficiency was 95% and positive and negative predictive values were 96.6% and
93.5%, respectively. These results postulate it as a useful resource for the early detection of C.
kikuchii in soybean plants.
© 2017 Asociación Argentina de Microbiologı́a. Published by Elsevier España, S.L.U. This is an
open access article under the CC BY-NC-ND license (http://creativecommons.org/licenses/by-
nc-nd/4.0/).
En Argentina, la soja es el principal producto de la agri- un gran número de muestras y se basa en la técnica de
cultura nacional2 . Sin embargo, su cultivo se encuentra Dot-enzyme linked immunosorbent assay (Dot-ELISA). Esta
limitado por las enfermedades de fin de ciclo (EFC) debido a metodología consiste en un ELISA rápido, que utiliza como
que estas provocan madurez anticipada de la planta y reduc- soporte sólido papel de nitrocelulosa, caracterizado por su
ción del rendimiento o de la calidad de las semillas, lo que excelente capacidad para adsorber proteínas13 .
genera graves deterioros en las cosechas y pérdidas en la Para su correcta aplicación, debe efectuarse su vali-
producción12 . Entre las EFC que presentan mayor prevalen- dación diagnóstica, evaluando dicha metodología en un
cia e incidencia en las principales áreas sojeras del país se número considerable de plantas de soja enfermas y sanas,
encuentra el tizón de la hoja y mancha púrpura de la semilla, según el intervalo de confianza (IC) deseado y el error
enfermedad ocasionada por el hongo Cercospora kikuchii3 . estimado. Entre los principales indicadores estadísticos se
La patogenicidad de este hongo se asocia a la produc- deben determinar la sensibilidad y la especificidad, la efi-
ción de la exotoxina cercosporina, responsable de muchos cacia y los valores predictivos positivo (VPP) y negativo
de los síntomas de la enfermedad. La cercosporina ha sido (VPN)4 .
aislada in vitro de al menos 34 especies de Cercospora, El objetivo del presente trabajo fue validar la técnica de
entre las que se encuentra Cercospora sojina. La produc- Dot blot para la detección precoz de C. kikuchii en plantas de
ción y la exportación de cercosporina hacia el exterior del soja, desarrollada previamente en el laboratorio de Micro-
hongo están reguladas por la expresión del gen cfp, que codi- biología General de la Facultad de Bioquímica y Ciencias
fica la proteína denominada Cercosporin Facilitator Protein Biológicas de la Universidad Nacional del Litoral.
(CFP)1 . Para tal fin, se trabajó con 29 muestras positivas (hojas de
Debido a que este patógeno se encuentra presente en plantas infectadas experimentalmente con C. kikuchii NBRC
estadios tempranos del cultivo en forma latente y asin- 6711, cepa perteneciente a la colección japonesa NITE Bio-
tomática, resulta indispensable disponer de métodos de logical Resource Center [NBRC]) y con 31 muestras negativas
diagnóstico precoces y certeros, que contribuyan a generar (hojas de plantas sanas), acorde con lo establecido para
medidas de control efectivas, para optimizar los recursos y una sensibilidad diagnóstica (DSe) y especificidad diagnós-
reducir los efectos negativos sobre el medio ambiente por tica (DSp) estimada del 98%, con una confianza deseada del
el uso indebido de plaguicidas. Asimismo, dichos métodos 95% y un error permitido del 5%6 .
permitirían originar información respecto de la interacción Las muestras positivas se obtuvieron a partir de plantas
patógeno-hospedante8 . de soja cultivadas e inoculadas bajo condiciones de creci-
Hasta el momento, no existen en el mercado métodos miento controladas. El cultivo de las plantas se llevó a cabo
de detección temprana de este patógeno. En la actuali- utilizando semillas RAS16, grupo de madurez 5, que a simple
dad, su diagnóstico se realiza cuando la planta ya presenta vista no presentaban daño mecánico por almacenamiento
los síntomas característicos en las etapas avanzadas, uti- o enfermedad. Para el pregerminado de las semillas, estas
lizando métodos tradicionales (aislamiento, cultivo del se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 0,5% y luego
hongo, observación de características macro y microscópi- se colocaron en bandejas plásticas que contenían papel de
cas) que requieren de personal especializado y prolongados filtro embebido en agua sobre una capa de algodón, a fin
períodos de tiempo (semanas). de mantener las condiciones de humedad apropiadas. Estas
Por ello, el desarrollo de un método de detección pre- bandejas se mantuvieron bajo condiciones de oscuridad con-
coz de Cercospora en plantas de soja es de gran necesidad. tinua a una temperatura de 25 ± 0,2 ◦ C durante 96 h, en una
Entre las principales técnicas disponibles que permiten incubadora modelo I-501PF (INGELAB, Argentina). Luego, las
complementar o reemplazar los procedimientos de labora- semillas pregerminadas se dispusieron en macetas plásticas
torio tradicionales se encuentran las inmunoquímicas y las de 300 ml, estas macetas contenían tierra-arena-vermiculita
moleculares8 . en proporción 2:1:1, a 1,5 cm de la superficie. Las plantas
Latorre Rapela7 desarrolló y optimizó un método de continuaron su desarrollo en la incubadora bajo condiciones
detección precoz para el género Cercospora, capaz de reco- alternadas de luz (16 h luz/8 h oscuridad), a la temperatura
nocer la presencia de la proteína CFP, específica del género. ya citada, y durante su crecimiento fueron fertilizadas con
Dicho método es muy versátil y aplicable al diagnóstico de solución de Hoagland o solución nutritiva de Jensen11 . Una
Validación de una técnica de Dot blot para la detección de Cercospora kikuchii 213
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Puro
D 1/2
D 1/8
D 1/32
D1/64
1 1 4 2 1 2 8 32 128 16 64 score
Figura 1 Dot blot aplicado a extractos de plantas sanas e infectadas con Cercospora kikuchii NBRC 6711. Calles 4, 5 y 6: plantas
sanas. Calles 7, 8, 9 y 10: plantas inoculadas con la cepa de referencia C. kikuchii NBRC 6711. Calle 1: control negativo (extracto de
Penicillium sp.). Calle 2: control negativo (extracto de Alternaria sp.). Calle 3: falso positivo. Calle 11: control positivo (extracto
de C. kikuchii NBRC 6711).
vez que las plantas alcanzaron el estado fenológico V3, se descrito por este mismo autor. A modo de resumen, sobre
inocularon con una suspensión de C. kikuchii NBRC 6711. una membrana de nitrocelulosa se depositaron los extractos
Para la preparación del inóculo, el hongo se sembró en proteicos solubles puros y cantidades decrecientes de aque-
5 tubos que contenían agar papa dextrosa; estos se incu- llos (1/2, 1/8, 1/32 y 1/64). Posteriormente, la membrana
baron durante 4 días a 25 ± 0,2 ◦ C, bajo ciclos alternados se secó a temperatura ambiente y se bloqueó con solución
de luz (16 h luz/ 8 h oscuridad). Transcurrido dicho tiempo, salina de fosfatos (PBS)-leche 5%. Después de 3 ciclos de
se agregaron 5 ml de agua destilada estéril a cada tubo y lavado con PBS-Tween 20 (PBS-T) durante 5 min, se incubó
se procedió a desprender las estructuras fúngicas mediante con suero de conejo anti-CFP diluido 1/500 en PBS-leche al
un raspado suave de la superficie del cultivo con ansa. La 1%. Luego de una nueva etapa de lavado (3 veces), se incubó
suspensión se cuantificó mediante un recuento en placa con suero anti-IgG total de conejo conjugado con peroxi-
en superficie y la concentración del inóculo se ajustó en dasa, diluido 1/500 con PBS-leche al 1%. Tras otra etapa
104 UFC/ml. de lavado (3 veces), se agregó como reactivo revelador
Para la inoculación se seleccionaron las hojas trifoliadas una solución de tetraclorhidrato de 3,3 -diaminobenzidina y
correspondientes al primer y segundo par de hojas completa- peróxido de hidrógeno (Invitrogen Argentina S.A.). La reac-
mente desplegadas. Se asperjaron con un volumen de 2,5 ml ción se detuvo con una etapa de lavado con agua. Todos
del inóculo por planta, humedeciendo ambas caras de las los pasos de incubación se realizaron en agitación mode-
hojas. Luego, se cubrieron con bolsas plásticas transparen- rada. Como control positivo se utilizó el extracto proteico
tes y perforadas, previamente humedecidas en su interior, y de C. kikuchii NBRC 6711 y como controles de especifici-
así se mantuvieron durante 24 h a fin de proveer las condicio- dad de género, los extractos proteicos de Penicillium sp. y
nes de humedad y mojado foliar adecuadas para estimular Alternaria sp.
el proceso de infección7 . Para facilitar la lectura visual y disminuir la subjetivi-
Una vez inoculadas, las plantas se colocaron nueva- dad de las observaciones, se estableció un score o puntaje
mente en la incubadora manteniendo las condiciones de asignando valores a las señales obtenidas y multiplicándo-
temperatura y ciclos de luz/oscuridad empleados para su los entre sí. Cada señal obtenida sobre la membrana se
crecimiento. consideró que tenía una base numérica igual a 4, 2 o 1,
Transcurridos 4 días, se recolectaron las hojas trifoliadas dependiendo de si la señal era muy fuerte, tenue/baja o
y se lavaron 3 veces con agua estéril para eliminar restos no visible, respectivamente. Luego, los puntajes asignados
de inóculo adheridos a la superficie foliar. Se observaron a cada una de las 5 observaciones correspondientes a cada
a simple vista en busca de lesiones macroscópicas y con muestra (la original y sus 4 diluciones) se multiplicaron y
lupa estereoscópica (BOECO Germany) en busca de lesio- el resultado se consideró su score final. Por ejemplo, en la
nes no visibles a simple vista. Las zonas de tejido lesionado figura 1, para la muestra correspondiente a la calle 7, el
se cortaron con un bisturí y, posteriormente, se realizó la score se determinó de la siguiente manera, 4 × 2 × 1 × 1 × 1
extracción de las proteínas totales siguiendo el método pro- = 8.
puesto por Rollins et al.14 . Se definió una línea de corte a través de la curva ROC
El tiempo de muestreo de 4 días se seleccionó teniendo en utilizando el programa MedCalc y se consideró un score ≤ 2
cuenta los resultados logrados por Latorre Rapela7 , y la téc- para las plantas sanas y uno ≥ 4 para las plantas enfermas.
nica de Dot blot se llevó a cabo según el diseño previamente Para el análisis estadístico de los resultados se utilizó una
214 M.C. Mattio et al.