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. Genómica funcional - Proyecto investigación.

Expresión de canales CFTR en células ciliares respiratorias inoculadas


con proteína M2 de virus influenza, y su enfoque en pacientes con
fibrosis quística.

Objetivo:
. Investigar relación en niveles de CFTR en células de epitelio respiratorio de
pacientes con fibrosis quística infectadas con virus influenza, respecto a las no
infectadas.
Introducción:

Si bien cualquier infección recurrente es factor de complicaciones en pacientes con fibrosis quística,
el virus influenza agrava el cuadro respiratorio por medio de un mecanismo celular común, que
implica la afectación en la funcionalidad del canal CFTR. Se plantea entonces, un grado de
correlación en la agravación del cuadro respiratorio por afectación del canal CFTR en pacientes
donde este ya cumple una función deficitaria como es en el caso de la fibrosis quística.

Para analizar los datos enfocados en la expresión del canal en problema, habría que tener en cuenta
el tipo de mutación para esta enfermedad que queremos estudiar. Sería pertinente indagar la
mutación más frecuente: DF508 (alteración en el maduración de la proteína; transporte hacia
membrana celular), donde los niveles y el procesamiento de ARNm no estarían afectados, pero si la
función de esta proteína.

Marco teórico:

La fibrosis quística es una enfermedad hereditaria, autosómica recesiva, causada por la mutación del
gen para el »regulador de la conductancia de transmembrana de la fibrosis quística« (CFTR), ubicado
en el brazo largo del cromosoma 7. El CFTR es un canal iónico de cloruro, aunque también puede
transportar HCO3. Es activado por AMPc y se localiza en las membranas apicales y basolaterales de
las vías aéreas, intestino y glándulas exócrinas. Una de sus funciones primarias en los pulmones, es
mantener la capa de líquido superficial y regular el canal epitelial de sodio sensible al amiloride
(ENaC). Cuando está afectada su funcionalidad, existe una hiperabsorción de Na e hiposecreción de
HCO3, siendo esto responsable de la deshidratación del mucus y las manifestaciones clínicas
crónicas características. (1)

La fibrosis quística, es la enfermedad congénita más frecuente en la raza blanca y afecta en Uruguay,
según datos derivados de la pesquisa neonatal, uno de cada 7000 recién nacidos vivos. Actualmente
existen diagnosticados y bajo seguimiento interdisciplinario 170 pacientes, y se estima que haya
otros 150 sin contar con el diagnóstico en nuestro país. Los pacientes que padecen esta patología,
tienen una esperanza y calidad de vida reducida, esta última aproximadamente de 28 años. Por lo
tanto, es de vital importancia brindar una correcta atención para mejorar la calidad de vida de estos
pacientes, implementando las medidas pertinentes para evitar complicaciones que esta enfermedad
provoque. (2) (3)
A pesar de que actualmente se carece de un tratamiento curativo, existe un progresivo mejoro del
pronóstico de estos pacientes. Esto último, gracias a tratamientos eficaces que actúan sobre las
manifestaciones clínicas del paciente. Centrándonos en la esfera respiratoria, además de evitar las
infecciones con antibióticos, se actuará sobre la principal afectación de esta enfermedad: sus
secreciones. Para impedir que éstas generen insuficiencia respiratoria, se debe impedir que
obstruyan las vías aéreas. Existen tratamientos con implementación de proteínas humanas
recombinantes. Entre estas se encuentran: alfa-1-antitripsina recombinante y desoxiribonucleasa
(dornasa), que apuntan a evitar daño tisular por inflamación en el tracto respiratorio por parte de los
neutrófilos, y a la lisis del material genético abundante del contenido purulento presente en el
esputo (volviéndolo a este menos denso) respectivamente. (4)

Existen para la fibrosis quística, un número de mutaciones mayor a 1500, que varía según grupos
étnicos, la más común es la mutación DF508 (caracterizada por menor expresión de canales en la
membrana celular). Las mutaciones pueden ser agrupadas según a que nivel este comprometido su
procesamiento o funcionalidad, distinguimos 5 grupos:

• Clase 1: con ausencia de producción de la proteína.


• Clase 2, con defecto de procesamiento y transporte la proteína (DF508).
• Clase 3, con defecto en la regulación del canal.
• Clase 4, con defecto en la conductancia.
• Clase 5, por alteración del splicing o “empalme”.

En las mutaciones de clase 1 y 2, hay ausencia de la proteína en la membrana celular. En contraste, en


las mutaciones clases 3 y 4 pueden resultar en la presencia de una proteína con cierta actividad
residual. Las mutaciones clase 5 tienen efecto variable, según el tipo de mutación. Las mutaciones
clases 1, 2 y 3, se consideran severas, las clases 4 leves y las clases 5, sus consecuencias varían. (5)

En cuanto a tratamientos que apunten a corregir el patrón genético de base, se avanza en la


implementación de la terapia génica. El sistema CASPR/CAS9 es un ejemplo, y conforma una
posibilidad futura para la vulcanización no solo de la fibrosis quística, sino para otras enfermedades
genéticas. (6)

El virus influenza es el causante de la gripe, enfermedad ampliamente recurrente en etapas del año
frías. Durante la infección, las células de la mucosa que forma el epitelio se necrosan, existiendo
entonces, una pérdida ocasional del epitelio ciliado de la tráquea, bronquios y bronquiolos;
provocando así, un desprendimiento de la capa basal del epitelio expuesto. Los alveolos pulmonares
por el edema generado engrosan sus paredes, y con ello, el intercambio de oxígeno entre el pulmón
y la sangre se ve comprometido; existiendo un déficit de oxígeno en sangre que puede ocasionar
hipoxia tisular, con el consiguiente deterioro funcional.
El virus influenza en su cápsula, cuenta, entre otras, con una proteína llamada M2 (Matrix 2). Esta
proteína de 97 aminoácidos, funciona como canal iónico de hidrogeniones, implicado en el proceso
de replicación del virus. Se puede inhibir por amantadina, un antiviral específico para gripe tipo A.
Dentro de los mecanismos que alteran el funcionamiento de la célula, M2 es capaz de disminuir los
niveles de CFTR. Una vez el virus infecta las células del epitelio bronquial, M2 por medio de la
alcalinización de los orgánulos participantes en la vía secretora de CFTR, provoca que estos receptores
sean posteriormente eliminados por el sistema ubequitina. (7) (8) (9)
Métodos:

• Utilización de RT-PCR para cuantificar niveles de arn mensajero de cftr previo y posterior a la
incubación con proteína M2 de virus influenza.

• Western Blot para evidenciar nivel proteico del canal cftr previo y posterior a la incubación
con proteína M2 de virus influenza.

Resultados esperados:

En células epiteliales bronquiales infectadas con virus influenza en pacientes con fibrosis quística, se
expresaría menor nivel de arn mensajero que mismas células no infectadas. Por consiguiente, el
análisis posterior por Western Blot denotaría en la misma situación, una disminución en los niveles
proteicos del canal CFTR, provocado por el mecanismo anteriormente nombrado de M2.

Discusión:
Como se analizaba anteriormente, al igual que en la fibrosis quística, en la infección por influenza, se
compromete la funcionalidad del receptor CFTR. Sería pertinente evaluar complicaciones generadas
por esta confluencia; si existe una agravación mayor que en otras infecciones provocadas por otros
patógenos, que, si bien generan similares complicaciones en sus manifestaciones clínicas, no
involucran dicho receptor.
Bibliografía
(1) Alejandra G. Palma, Basilio A. Kotsias, Gabriela I. Marino. FUNCIONES DE LOS
CANALES IÓNICOS CFTR Y ENAC EN LA FIBROSIS QUÍSTICA. Instituto de
Investigaciones Médicas Alfredo Lanari, IDIM-CONICET, Universidad de Buenos Aires,
Buenos Aires, Argentina. 2014.
(2) Bargas, Claudia. Cosentino, Dinora. González, Omar Guillen, Silvia (Lic. en Fisioterapia)
Montero, María Débora. Parallada, Gabriela Ramírez, Paola. Rey, María Alejandra. (Médico
Neumóloga) Rutz, María Gabriela. GUIA CLÍNICA DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO
FIBROSIS QUÍSTICA ADULTOS. Instituto de seguridad social. Montevideo.2014.
(3) Fibrosis quística en Uruguay, situación y perspectivas. Instituto de seguridad social.
Montevideo. 2012.
(4) Kris De Boeck, Margarida D Amaral The Lancet Respiratory Medicine Vol 4, No. 8
p662–674, August 2016
(5) McAuley DF, Elborn JS. Cystic fibrosis: basic science. Adult Cystic Fibrosis Centre,
Belfast City Hospital, Belfast, Paediatr Respir Rev UK 2000;1:93- 100.
(6) María Fernanda Lammoglia-Cobo, Ricardo Lozano-Reyes,César Daniel García-
Sandoval, Cynthia Michelle Avilez-Bahena, Violeta Trejo-Reveles, Rodrigo Balam Muñoz-
Soto, César López-Camacho. La revolución en ingeniería genética: sistema CRISPR/Cas
The revolution in genetic engineering: CRISPR/Cas system. Instituto Tecnológico y de
Estudios Superiores de Monterrey, Campus Ciudad de México. Mayo-Agosto 2016
(7) Londino JD, Lazrak A, Jurkuvenaite A, Collawn JF, Noah JW, Matalon S. Influenza
matrix protein 2 alters CFTR expression and function through its ion channel activity. Am J
Physiol Lung Cell Mol Physiol 2013; 304: L582-92.
(8) James David Londino, Ahmed Lazrak, James W. Noah, Saurabh Aggarwal, Vedrana
Bali, Bradford A. Woodworth, Zsuzsanna Bebok, Sadis Matalon. Influenza virus M2 targets
cystic fibrosis transmembrane conductance regulator for lysosomal degradation during viral
infection. The FASEB Journal. July 2015.
(9) Juan Ortin. Biología molecular del virus de la gripe. Centro Nacional de BiotecnologÌa
(CSIC). Madrid. 2006.

Federico Núñez Rivero