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Microbiología General

Facultad de Ciencias Exactas - UNLP

LABORATORIO 4
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE MUESTRAS NATURALES.

Técnicas de aislamiento, cultivo puro. Medios de cultivo selectivos y diferenciales.

Los microorganismos se hallan ampliamente difundidos en la Naturaleza y uno de los procedimientos


microbiológicos fundamentales consiste en aislar los gérmenes presentes en una determinada muestra.
Las técnicas utilizadas para realizar los aislamientos, dependen del tipo de muestra y de los
microorganismos que pudieran estar presentes en la misma. Así, el estado físico de la muestra, su
procedencia, la cantidad y tipos de bacterias presentes etc. determinarán los procedimientos a seguir. Estos
procedimientos incluirán una adecuada toma de muestra, su debido procesamiento previo al aislamiento
(ej.: dispersión de muestras sólidas en medios acuosos adecuados) y la etapa de aislamiento en sí.

Técnicas de aislamiento

Si se coloca un solo microorganismo viable sobre la superficie de un medio sólido adecuado para su
desarrollo se verá, luego de la incubación, que ha tenido lugar un desarrollo macroscópico. Este desarrollo
visible se denomina colonia, y es el resultado de gran cantidad de divisiones celulares a partir del
organismo inicial.
Supongamos que de una muestra líquida que contenga un gran número de un medio sólido contenido en
una caja de Petri, de manera tal que las bacterias se "diluyan" en el área sembrada.
En alguna de las zonas, las bacterias habrán quedado lo suficientemente separadas como para formar
colonias aisladas.
En la figura puede apreciarse un esquema de una de las técnicas más utilizadas para el aislamiento de
microorganismos.
Los pasos a seguir se detallan a continuación: se toma parte de la muestra con una ansa, se disemina en un
sector de la superficie del medio sólido, se flamea el ansa y se vuelve a tomar muestra de la superficie del
medio. Este procedimiento se repite hasta que ya no queda espacio para realizar nuevas estrías.
En el esquema mostrado en la figura la muestra original se descarga inicialmente en las estrías de la zona
1, se flamea el ansa se toma muestra de un sector de la zona 1 y se disemina sobre la zona 2. El
procedimiento continúa de la misma manera en otros sectores.

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Como la finalidad del aislamiento es la obtención de cultivos puros, es decir que estén compuestos por un
solo tipo de microorganismos, es práctica común realizar sucesivos aislamientos a partir de las colonias
obtenidas en los distintos pasos.
En algunas ocasiones, los microorganismos a aislar están en una concentración tan baja que es altamente
improbable que al introducir un ansa en la misma se extraiga algún microorganismo.
Supongamos una muestra líquida con 10 microorganismos/ml y perfectamente homogeneizada.
Si tomamos el volumen de un ansa en anillo (aproximadamente 5 µl), la probabilidad de no extraer
microorganismos será p (0)= e-0,005x10= 0,95. Es decir que la probabilidad de extraer uno o más
microorganismos será del 5%. En el caso anteriormente descripto se hace necesario concentrar los
microorganismos. Esto puede lograrse mediante dos técnicas:

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a) Filtración con membranas:


Un volumen adecuado de la muestra líquida, se filtra a través de una membrana de 0,45µm de diámetro de
poro y luego se coloca la misma sobre un medio de cultivo sólido, que permita el desarrollo de los
microorganismos buscados. Luego de la incubación se formarán colonias que pueden someterse a nuevos
pasos de aislamiento.

b) Enriquecimiento en medios líquidos:


Para muestras no filtrables se hace necesario recurrir a técnicas de enriquecimiento en las que se busca
aumentar la concentración de los microorganismos a aislar.
En los métodos de enriquecimiento, se coloca en medio líquido una cantidad de muestra que contenga con
seguridad uno o más microorganismos viables, se incuba para permitir el crecimiento y luego, cuando hay
una cantidad suficiente de microorganismos, se extrae una porción con un ansa y se realizan estrías sobre
un medio sólido.
En general, suelen utilizarse medios de cultivo selectivos para favorecer el desarrollo de la población
microbiana deseada.
Los medios sólidos utilizados luego del enriquecimiento pueden ser selectivos o no. La utilización de
diferentes medios para las técnicas de aislamiento (selectivos, diferenciales, etc.) permite obtener los
microorganismos buscados independientemente de la complejidad de la muestra.

TRABAJO EXPERIMENTAL

Objetivos:
- Análisis cuantitativo de poblaciones bacterianas de muestras naturales.
- Aislamiento de microorganismos pertenecientes a los géneros y especie Pseudomonas aeruginosa,
Bacillus cereus, Escherichia coli, utilizando las técnicas de aislamiento directo y aislamiento con
enriquecimiento previo.

TIERRA
Para el análisis cuanti y cualitativo de la muestra de tierra proceder pesando 10g de tierra y suspender
en 100 ml de solución fisiológica (0,85g % de NaCl). Extraer en agitación suave (180 rpm) durante 30
min. Retirar del agitador y dejar sedimentar 10 min.
Realizar las siguientes determinaciones a partir del sobrenadante.
a) Recuento de bacterias Heterótrofas totales: realizar diluciones seriadas de la muestra
homogeneizada en solución fisiológica estéril. Las diluciones a sembrar deben ser ajustadas
según el origen de la muestra.
Posteriormente, sembrar 0,1 ml de las diluciones adecuadas en superficie de agar nutritivo, distribuir
con la espátula de Drigalsky estéril e incubar a 37ºC durante 24-48 hs.
Realizar el recuento de las colonias desarrolladas en las correspondientes diluciones y calcular el
número de UFC/g de tierra.
b) Para el aislamiento directo, sembrar con ansa, utilizando la técnica de aislamiento, una placa
de agar nutritivo, una placa de agar cetrimide, una placa de agar Mossel y una de agar EMB. Incubar
48hs a 32ºC y la caja de EMB a 37ºC.
c) Para los enriquecimientos, inocular los siguientes medios líquidos, según las proporciones
indicadas: caldo nutritivo suplementado con polimixina (1/10), caldo nutritivo o agua peptonada (1/10)
y caldo Mac Conkey (1/10). Incubar el enriquecimiento en caldo nutritivo con polimixina a 32ºC, sobre
el estante, el caldo nutritivo a 32ºC con agitación suave (180rpm) y el caldo Mac Conkey a 37ºC con
agitación suave (180rpm). Retirar todos los cultivos a las 24hs.
d) Observar las placas de los aislamientos directos y seleccionar aquellas colonias que respondan
a las características culturales de los microorganismos investigados. De aquellas colonias

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seleccionadas, hacer observaciones microscópicas previa coloración de Gram. Seleccionar finalmente


las colonias que reúnan las características macro y microscópicas de los microorganismos investigados.
e) A partir de los enriquecimientos, realizar los aislamientos en los medios selectivos
correspondientes a cada microorganismo. Incubar 24 hs a 32ºC o a 37ºC según corresponda.
f) Finalizada la incubación, retirar las placas y observar los desarrollos. Seleccionar aquellos
correspondientes a los microorganismos investigados. Observar las características microscópicas previa
coloración de Gram.
g) Reaislar en agar nutritivo las colonias seleccionadas. Incubar a 32ºC, durante 24hs.
h) Luego de las incubaciones, observar los desarrollos y verificar la pureza de los aislados por
observación microscópica con coloración de Gram. Registrar las características culturales y los
resultados de la observación microscópica para la posterior identificación de los aislados.

AGUA
Para el análisis cuali y cuantitativo de la muestra de agua, homogeneizar por inversión el recipiente.
Las diluciones a sembrar deben ser ajustadas según el origen de la muestra.
Según referencias bibliográficas el número de bacterias heterótrofas totales oscila entre 1500 y 6200
UFC/ml y el número de coliformes fecales entre 100 y 1300 cada 100ml (Pérez y col., 1993. Revista
Argentina de Microbiología 25: 7-14).
a) Recuento de bacterias Heterótrofas totales: realizar diluciones seriadas de la muestra
homogeneizada en solución fisiológica estéril. Posteriormente sembrar 0,1ml en superficie de agar
nutritivo, distribuir con la espátula de Drigalsky estéril e incubar a 37ºC durante 24-48 hs. Realizar el
recuento de las colonias desarrolladas en las correspondientes diluciones y calcular el número de
UFC/ml de agua.
b) Recuento de la población de coliformes fecales por la técnica del Número Más Probable
(NMP): utilizar la muestra sin diluir, y dos diluciones seriadas de la misma (10 0, 10-1, 10-2). Inocular
0,5 ml de cada dilución en series de 3 tubos de caldo Mac Conkey con campanita de Durham (5 tubos
de cada una de tres diluciones). Inocular 500µl de las diluciones 100, 10-1 y 10-2. Incubar a 44ºC durante
24hs. Finalizada todas las incubaciones, registrar los tubos con desarrollo, viraje del indicador al
amarillo y producción de gas como + en cada dilución, y calcular el tamaño de las poblaciones (tabla
NMP/programa NMP). Expresar los resultados como NMP de bacterias coliformes fecales/ml de agua.
c) Para el análisis cualitativo, sembrar con ansa, directamente de la muestra de agua, utilizando
la técnica de aislamiento, una placa de agar nutritivo, una placa de agar cetrimide y una de agar EMB.
Incubar 48hs a 37ºC.
d) Para los enriquecimientos, inocular los siguientes medios líquidos con un volumen de la
muestra de agua, según las proporciones indicadas: caldo nutritivo o agua peptonada (1/10) y caldo
Mac Conkey doble concentración (1/1). Incubar los enriquecimientos a 37ºC con agitación suave
(180rpm). Retirar todos los cultivos a las 24hs.
Continuar según los incisos e) hasta h) explicados para la muestra de tierra.

Microorganismo Medio de Condiciones de Medio de aislamiento


enriquecimiento incubación
Pseudomonas Caldo nutritivo o agua A 32ºC con
Agar cetrimide
aeruginosa peptonada (0.1%) agitación
Caldo nutritivo con
Bacillus cereus A 32ºC en estante Agar Mossel
polimixina
A 37 ºC con
Escherichia coli Caldo Mac Conkey Agar EMB
agitación
Caldo nutritivo salado
Staphylococcus sp. A 37 ºC Agar Manitol Salado
(10% NaCl)

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Medios de cultivo utilizados en el aislamiento de enterobacterias

Caldo MacConkey (g/l)


Peptona de caseína 20
Lactosa 10
Bilis de buey desecada 5
Púrpura de bromocresol 0,01
Agua destilada c.s.p. 1000 ml
pH = 7,2

Agar Eosina Azul de Metileno (EMB) (g/l)


Peptona 10
Lactosa 5
Sacarosa 5
PO4K2H 2
Eosina 0,4
Azul de metileno 0,065
Agua destilada c.s.p. 1000 ml
Agar 13,5
pH = 7,2

Medios de cultivo utilizados en el aislamiento de Pseudomonas spp.

Medio Mineral Líquido (MML) (g/litro)


ClNa 5
PO4K2H 1
PO4(NH4)H2 1
SO4(NH4)2 1
SO4Mg 0,2
NO3K 3
Agua destilada c.s.p. 1000 ml.
pH = 7

Agar Cetrimide (g/l)


Peptona de gelatina 20.0
Cloruro de magnesio 1.4
Sulfato de potasio 10.0
Agar 13.6
Cetrimida 0.3
Glicerol 10 ml
pH final: 7.2 ± 0.2

Medios de cultivo utilizados en el aislamiento de Bacillus spp.

Caldo nutritivo (g/l)


Extracto de carne 3.0
Peptona 5.0
pH final: 6.9 ± 0.2
Luego de esterilizar el caldo nutritivo agregar asépticamente 0,01 g de sulfato de polimixina B.

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Agar selectivo para Bacillus cereus según Mossel (g/l)


Peptona de carne 10.0
Manitol 10.0
Cloruro de sodio 10.0
Extracto de carne 1.0
Rojo de fenol 0.025
Agar 14.0
Luego de esterilizar el medio base agregar asépticamente al medio fundido y a 50ºC, 0,01 g de
sulfato de polimixina B y 100 ml de emulsión de yema de huevo.
pH final: 7.2 ± 0.2

Agar nutritivo (g/l)


Extracto de carne 3
Peptona 5
Agar 15
pH final: 6,9 ± 0,2

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SEMINARIO Nº4
Análisis de una muestra: aislamiento y obtención de cultivos puros. Medios de cultivo.

1. Formule cualitativamente un medio de cultivo complejo mencionando qué aporta cada


componente. ¿Cómo haría para transformarlo en un medio sintético?

2. ¿Cuál es la función del agar en un medio de cultivo? ¿Por qué es el agente elegido?
¿Podría utilizar gelatina en su reemplazo? Justifique.

3. Proponga un medio de cultivo (cualitativo) y condiciones de incubación para un


microorganismo heterótrofo, halófilo, termófilo y anaerobio facultativo.

4. Explique mediante que mecanismos ejercen acción selectiva los siguientes agentes: cloruro
de sodio, antibióticos, oxígeno, incubación a 45°C, acidez, bilis.

5. ¿Cuáles de los siguientes agentes poseen función buffer: glucosa, cloruro de sodio, fosfato
ácido de potasio, peptona, agar, cloruro de amonio extracto de carne, citrato de sodio? Explíquelo
mediante las correspondientes ecuaciones químicas.

6. Se tienen dos microorganismos, uno de ellos es capaz de utilizar manitol como fuente de
carbono mientras que el otro no. Formule un medio de cultivo para poner en evidencia ambos
microorganismos al mismo tiempo.

7. Los medios listados a continuación fueron utilizados en el laboratorio para la


caracterización de Bacillus cereus y Staphylococcus aureus respectivamente.

Medio de Mossel Agar-manitol-sal


común-rojo de fenol
peptona de caseína 10 g/l peptona de caseína 10 g/l
extracto de carne 1 g/l extracto de carne 1.0 g/l
NaCl 10 g/l NaCl 75 g/l
rojo de fenol 0.025 g/l D(-)manitol 10.0 g/l
sulfato de polimixina 50.000 UI/l rojo de fenol 0.025 g/l
yema de huevo 10% v/v agar-agar 12 g/l
manitol 10 g/l
agar-agar 12 g/l

a- Indique si se trata de medios selectivos y/o diferenciales. Justifique indicando qué


componente/s da la selectividad y diferencialidad a cada medio.
b- Indique cuál/es componente aportan fuente de C, energía, y factores de crecimiento.
c- En base a los caracteres diferenciales indicados en el inciso a, explique como observaría las
diferentes colonias en ambos medios.

8. ¿Los microorganismos anaerobios son capaces de crecer en los mismos medios que los
aerobios? Justifique.

9. Indique los principales componentes de un medio de cultivo para anaerobios señalando la


importancia de cada uno.

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10. ¿Aseguraría anaerobiosis total poniendo sobre el cultivo una capa de vaselina? ¿Cómo
mejoraría el método?

11. En condiciones de incubación anaeróbicas, ¿sólo desarrollan microorganismos anaeróbicos


estrictos? Justifique.

12. Usted recibe en su laboratorio una muestra de un polvo antimicótico presuntamente


contaminado con un bacilo esporulado. ¿Cómo procedería para su aislamiento e identificación?
Explique y justifique brevemente cada paso.

13. Ud. decide investigar la muestra de las aguas del Río Negro y los canales de riego alimentados
por él, en las inmediaciones de la ciudad de Viedma; realizando los siguientes estudios:
a) Aislamiento de los microorganismos que se encuentran en la muestra de agua en mayor
concentración (suponga que son microorganismos anaerobios facultativos, heterótrofos y
nutricionalmente poco exigentes).
b) Desea descartar la presencia de Vibrio cholerae en 500 ml de una muestra que Ud. mismo tomó.
Para ello cuenta con los siguientes medio de cultivo:
Agar TCBS (agar-tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa): las elevadas concentraciones de
tiosulfato, citrato y el medio fuertemente alcalino inhiben a las Enterobacterias. La bilis de buey
inhibe a los Enterococos. Solamente algunas cepas de Proteus sacarosa-positivas pueden formar
colonias amarillas semejantes a las que forman los vibrios. El indicador mixto Azul de Timol- Azul
de Bromotimol presenta un viraje al amarillo por la formación de ácido, incluso en medio
fuertemente alcalino.
Explique claramente como procedería para descartar la presencia de vibrio. Recuerde la
morfología típica que presentan las bacterias pertenecientes al género Vibrio.

14. Industrias de distintos orígenes vierten en el Río de la Plata aguas residuales que contienen
compuestos tóxicos inorgánicos tales como metales pesados conjuntamente con compuestos
orgánicos. Dichos elementos envenenan los ecosistemas acuáticos. Con el fin de evaluar la
posibilidad de efectuar un tratamiento biológico, usted desea demostrar que existen microorganismos
capaces de utilizar fenol como única fuente de carbono y que a su vez tengan alta resistencia a los
metales pesados tales como el cromo.
a) ¿Cómo realizaría el aislamiento de bacterias capaces de utilizar fenol como única fuente de
carbono, a partir de una muestra de agua del Río de la Plata? Elija además, aquellas que sean capaces
de producir halo de hemólisis en un medio de agar sangre.
b) Usted sabe que las bacterias aisladas son capaces de crecer en agar nutritivo. Explique como
haría si desea conocer si son capaces de desarrollar en presencia de 50mg/l de cromo.

15- Usted trabaja en un laboratorio de control de calidad de una fábrica de medicamentos. Al


realizar el análisis microbiológico de uno de los productos elaborados, encuentra que éste tiene un
número de microorganismos viables de 104/g y presencia de Sthaphylococcus aureus en 1 gramo.
Ud. sabe que este microorganismo es un coco Gram positivo, que se agrupa formando racimos, que
tolera altas concentraciones de cloruro de sodio y utiliza el manitol.
Explique detalladamente como procedería para aislar Sthaphylococcus aureus de esta muestra
hasta la obtención de un cultivo puro.

16- En la Argentina, las enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) producidas por
Salmonella ocupan un lugar preponderante por la gravedad del cuadro clínico. Los brotes de
Salmonella se hallan asociados a diversos alimentos, entre ellos: cárneos, leche y sus derivados,

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huevos, tortas, cremas, etc. El CAA exige, en determinados alimentos, ausencia de este
microorganismo en 25 g de muestra. Se dispone de los siguientes medios de cultivo:
Caldo Selenito-Cisteína
En este medio de cultivo, el selenito de sodio inhibe flora Gram positiva y la mayoría de la flora
entérica excepto Salmonella spp. La l-cistina es el agente reductor y fue propuesta por la FDA para
el aislamiento de Salmonella en productos alimenticios incrementando la recuperación por reducción
de la toxicidad del selenito.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones


Peptona 5.0 Suspender 23 g del polvo en un litro de
Lactosa 4.0 agua destilada. Mezclar bien y calentar
Fosfato de sodio 10.0 ligeramente hasta disolución completa.
Selenito de sodio 4.0 Evite el calentamiento excesivo y no
esterilice en autoclave.
L-Cistina 0.01
pH final: 7.0 ± 0.2

Agar SS
En este medio de cultivo la sales biliares y el verde brillante inhiben el desarrollo de bacterias Gram
positivas, de la mayoría de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp. A partir del
tiosulfato de sodio se puede evidenciar las bacterias formadoras de ácido sulfhídrico. Los pocos
microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar, acidifican el medio haciendo virar
al rojo el indicador de pH, obteniéndose colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo. Salmonella,
Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen bien en el medio de cultivo, y
producen colonias transparentes. La producción de ácido sulfhídrico se evidencia como colonias con
centro negro debido a la formación de sulfuro de hierro.
Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones
Pluripeptona 5.0
Extracto de carne 5.0
Suspender 60 g del polvo por litro de
Lactosa 10.0
agua destilada. Reposar 5 minutos y
Mezcla de sales biliares 8.5 mezclar hasta homogeneizar. Calentar
Citrato de sodio 8.5 a ebullición durante 2 o 3 minutos. NO
Tiosulfato de sodio 8.5 ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE.
Citrato férrico 1.0 Enfriar a 45-50°C y distribuir unos 20
ml por placa. Secar la superficie del
Agar 13.5
medio unos minutos en la estufa.
Verde brillante 0.00033
Rojo neutro 0.025
pH final: 7.0 ± 0.2

Agar nutritivo: g/litro


Peptona de carne 5g
Extracto de carne 3g
Agar-agar 15 g
Agua destilada 1000ml pH= 7

a) Clasifique los medios de cultivo empleados. Justifique su clasificación.

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b) Explique que aportan al medio de cultivo los siguientes componentes: la pluripeptona, el
extracto de carne y la lactosa.
c) En el agar nutritivo que componente/es aportan los micronutrientes y los factores de
crecimiento?
d) ¿Cómo demostraría ausencia de Salmonella en este producto, si sigue las normas del CAA?.
Indique medios de cultivo, cantidades a procesar, diluciones, temperaturas y tiempos de
incubación.

17- Los parámetros a testear en un control microbiológico de una crema de enjuague para
cabellos son los siguientes:
# Recuento de Heterótrofas Mesófilas Totales< 1x103 UFC/ml
# Recuento de hongos y levaduras < 1 x 102 UFC/ml
# Ausencia de E. coli en 1 gr.
# Ausencia de Pseudomonas, aeruginosa en 1 gr.
# Ausencia de Staphylococcus aureus en 1 gr.
¿Cómo demostraría la ausencia de Pseudomona aeruginosa?

18- Con el propósito de conocer la calidad sanitaria de helados de fabricación industrial y la


presencia de especies patógenas se examinaron una serie de muestras procedentes de 5
establecimientos de San Luis. Se investigó la presencia de especies patógenas de Staphylococcus
aureus y Yersinia enterocolítica en 1 g.
Se dispone de los siguientes medios de cultivo:
-Caldo GC: peptona, extracto de carne, extracto de levadura, ClLi (inhibidor de Gram(-)), manitol,
ClNa, glicina, piruvato sódico y como aditivo telurito potásico (inhibidor de Gram(+)). El desarrollo
de S. aureus se evidencia por ennegrecimiento del medio debido a la reducción de telurito a teluro.
-Caldo Mac Conkey: Peptona de caseína, Lactosa, Bilis de buey , Púrpura de bromocresol.
-Agar nutritivo: Peptona de carne, Extracto de carne y Agar-agar.
-Agar BP: peptona, extracto de carne, extracto de levadura, piruvato de sodio, glicina, ClLi y agar.
Yema de huevo y telurito de potasio, como aditivos.
a) Clasifique el caldo GC y el agar BP, y explique que aportan al medio de cultivo cada uno de los
componentes.
b) Describa el procedimiento para demostrar la ausencia de St. aureus por g de helado, indicando la
técnica, medios de cultivo y condiciones de incubación. Recuerde que St. aureus es un coco Gram+,
anaerobio facultativo, reduce las sales de telurito a teluro con ennegrecimiento del medio e hidroliza
lecitina (fosfolípido).

19- Durante un vuelo, se sirvió a los pasajeros una comida que incluyó jamón. Dos horas después de
la comida, la mayoría de los pasajeros sufrió náuseas y vómitos. Sólo un tercio de estos individuos
padeció, además, diarrea. A partir del análisis de una muestra se obtuvo una colonia con
características de S. aureus. Los pasajeros habían ingerido un alimento contaminado con una de las
muchas toxinas de este microorganismo. El S. aureus causa enfermedades muy variadas y de las
enfermedades bacterianas transmitidas por los alimentos, sólo la causada por Bacillus cereus tiene
síntomas similares. S. aureus es un coco Gram (+), inmóvil, que crece en grupos o racimos y
coloniza la parte externa de las fosas nasales del 30% de los individuos normales. Esta bacteria es
productora de hemolisinas, y excreta una enzima denominada coagulasa que es capaz de coagular el
plasma normal y tiene gran utilidad para diferenciarlo de otras especies del mismo género que no son
capaces de producirla. Además, fermenta manitol, fermenta glucosa y algunas cepas generan
vestigios de SH2. B. cereus es un bacilo Gram (+), móvil, esporulante, fermentador de glucosa pero
no de manitol, productor de lecitinasa y hemolisina. Teniendo en cuenta las características de cada
microorganismo, proponga un esquema de aislamiento que permita diferenciar ambos

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microorganismos. Especifique la muestra o muestras de partida, los medios y condiciones de cultivo
empleados y la metodología utilizada.

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