UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS

DEPTO. DE CIENCIA DE LOS ALIMENTOS Y TECNOLOGÍA
QUÍMICA

EXTRACCIÓN DE LUTEÍNA A PARTIR DE

FLORES DE TAGETE (Tagete erecta) Y
ESTABILIZACIÓN POR
MICROENCAPSULACIÓN.

MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE INGENIERO EN ALIMENTOS

CRISTIÁN ANDRÉS ARELLANO CORRAL

Director de Memoria:
Dra. Paz Robert C.
Departamento de Ciencia de los
Alimentos y Tecnología Química.
Universidad de Chile

Santiago, Chile
2011

Esta Memoria fue financiada por el proyecto Fondecyt Nº 1080469

DEDICATORIA

A mis padres

Rosa y Miguel,

y a mi Analía.

ii
 AGRADECIMIENTOS

Quiero agradecer a mis padres, por su constante e incondicional apoyo durante este
largo camino de vida universitaria.

A Analía Calabrán, que llegó a llenar de alegría y amor mi vida, por su comprensión,
consejos, apoyo, motivación y su amor incondicional en este último paso.

A toda mi familia, por su preocupación y apoyo durante este proceso.

A mis amigos y amigas, que fueron mi compañía en alegrías y frustraciones.

A la profesora Paz Robert, por su buena disposición, compresión, su aporte a mis

conocimientos, y en especial a la formación que me entregó en este periodo.

A mis compañeros de tesis y laboratorio, que me ayudaron con sus conocimientos y

buena disposición. En especial a Lidia Herrera por su colaboración en la parte
experimental.

Y a todas las personas que estuvieron presentes y formaron parte de mi vida

universitaria.

iii
 TABLA DE CONTENIDOS

INTRODUCCIÓN ..........................................................................................................1

1.1 Revisión bibliográfica. ........................................................................................... 3

1.1.2 Pigmentos carotenoides: luteína .................................................................... 3

1.1.2.1 Importancia biológica de la luteína .......................................................... 5

1.1.3 Extracción de luteína. .................................................................................... 6

1.1.4 Microencapsulación ....................................................................................... 7

1.1.5 Materiales de encapsulación .......................................................................... 8

1.1.5.1 Inulina ..................................................................................................... 9

1.1.5.2 Aceite de girasol y girasol alto oleico. .................................................... 10

1.2 Hipótesis ............................................................................................................ 11

1.3 Objetivos ............................................................................................................ 11

1.3.1 Objetivo general ........................................................................................... 11

1.3.2 Objetivos específicos ................................................................................... 11

MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................... 12

2.1 Materiales ........................................................................................................... 12

2.1.1 Materias primas ........................................................................................... 12

2.1.2 Equipos........................................................................................................ 12

2.2 Metodología ....................................................................................................... 14

2.2.1 Determinación del contenido de luteína en pétalos de tagete (Tagete erecta).

............................................................................................................................. 14

2.2.2 Preparación de extracto de luteína a partir de pétalos de tagetes. ............... 15

iv
 2.2.3 Elaboración de las oleorresinas de luteína. .................................................. 17

2.2.4 Caracterización de aceites con y sin la adición de extracto de luteína ......... 17

2.2.4.1 Determinación de la composición de ácidos grasos por GLC. ............... 17

2.2.4.2 Determinación de tocoferoles. ............................................................... 18

2.2.5 Elaboración de las dispersiones para microencapsular. ............................... 18

2.2.6 Secado por atomización............................................................................... 19

2.2.7 Diseño estadístico........................................................................................ 20

2.2.8 Caracterización de las microcápsulas .......................................................... 20

2.2.8.1 Determinación de luteína superficial de las microcápsulas .................... 20

2.2.8.2 Determinación de luteína total en las microcápsulas ............................. 21

2.2.8.3 Cálculo de la eficiencia de encapsulación de luteína. ............................ 21

2.2.9 Caracterización de las microcápsulas obtenidas bajo condiciones óptimas. 22

2.2.9.1 Morfología de la partícula. ..................................................................... 22

2.2.9.2 Contenido de humedad. ........................................................................ 22

RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................................23

3.1 Contenido de luteína en pétalos de flores de tagete (Tagete erecta). ................. 23

3.2 Obtención de extracto de luteína a partir de flores de tagete. ............................. 24

3.3 Composición en ácidos grasos de los aceites de girasol (AG) y girasol alto oleico
(AGAO), con y sin la adición de extracto de luteína (LUT)........................................ 28

3.4 Contenido de tocoferoles en los aceites de girasol (AG) y girasol alto oleico
(AGAO), con y sin la adición de extracto de luteína (LUT)........................................ 30

3.5 Microencapsulación ............................................................................................ 31

3.5.1 Encapsulación de aceite de girasol adicionado de extracto de luteína, con

inulina (AG+LUT)-INU........................................................................................... 31

v
 3.5.2 Encapsulación de aceite de girasol alto oleico adicionado de extracto de
luteína, con inulina (AGAO+LUT)-INU. ................................................................. 33

3.6 Recuperación de luteína en la encapsulación de luteína en los sistemas

(AG+LUT)-INU y (AGAO+LUT)-INU. ........................................................................ 35

3.7 Caracterización de las microcápsulas obtenidas bajo condiciones óptimas. ....... 37

3.8 Contenido de humedad de las microcápsulas obtenidas bajo condiciones

óptimas. ................................................................................................................... 38

3.9 Morfología de las microcápsulas obtenidas bajo condiciones óptimas. .............. 39

CONCLUSIÓNES........................................................................................................41

BIBLIOGRAFÍA ...........................................................................................................43

ANEXOS .....................................................................................................................47

6.1 Determinación de carotenoides en los pétalos de flor de tagete (Tagete erecta).

................................................................................................................................. 47

6.2 Curva de calibración de la luteína....................................................................... 48

6.3 Composición en ácidos grasos ........................................................................... 49

6.4 Efecto de la molienda de los pétalos de tagete (Tagete erecta) sobre la cinética
de extracción de luteína por el método de extracción y saponificación simultáneos. 50

6.5 Cálculo del coeficiente de difusividad. ................................................................ 51

6.6 Análisis de la varianza para eficiencia de encapsulación del diseño experimental

(AG+LUT)-INU ......................................................................................................... 53

6.7 Análisis de la varianza para eficiencia de encapsulación del diseño experimental

(AGAO+LUT)-INU .................................................................................................... 54

vi
 ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: Estructura química de la Luteína .................................................................... 4

Figura 2: Secador por atomización ............................................................................... 8

Figura 3: Cromatrograma del extracto saponificado de luteína, desde pétalos de

tagetes de color naranjo. ............................................................................................ 24

Figura 4: Perfil cinético de extraccion de luteina desde pétalos secos de tagetes

naranjo sin moler y molidos. ....................................................................................... 25

Figura 5: Cromatograma por HPLC para la cinética de extracción-saponificación de

pétalos de tagetes naranjas molidos: 4 minutos (A); 360 minutos (B); 24 horas (C).... 27

Figura 6. Gráfico de superficie respuesta estimada para la optimización de la eficiencia

de encapsulación del sistema (AG+LUT)-INU, con respecto a la temperatura de aire de
entrada y la relación (AG+LUT)/INU. .......................................................................... 32

Figura 7: Gráfico de superficie respuesta estimada para la optimización de la eficiencia

de encapsulación del sistema (AGAO+LUT)-INU, con respecto a la temperatura del aire
de entrada al secador y la relación (AGAO+LUT)/INU. ............................................... 34

Figura 8. Fotografías obtenidas mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) de

las microcápsulas obtenidas bajo condiciones óptimas: (A) (AG+LUT)-INU y (B)
(AGAO+LUT)-INU, amplitud x 45; (C) (AG+LUT)-INU y (D) (AGAO+LUT)-INU, amplitud
x 450........................................................................................................................... 40

Figura 9: Curva de calibración para luteína. ................................................................ 48

Figura 10. Gráfica de Ln[C∞/C∞-C] en función del tiempo t en las etapas de inicio de la
extracción. .................................................................................................................. 51

vii
 ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1: Programa utilizado en HPLC ......................................................................... 14

Tabla 2: Condiciones utilizadas para la preparación de las dispersiones en los

diferentes ensayos. ..................................................................................................... 19

Tabla 3: Niveles para las variables independientes usadas en el diseño experimental

para la microencapsulación de oleorresinas de luteína. .............................................. 20

Tabla 4: Contenido de luteína de los pétalos de flor de tagete (Tagete erecta) naranja,
amarilla y roja. ............................................................................................................ 23

Tabla 5: Comparación entre el método de extracción por acetona y hexano. ............. 28

Tabla 6: Composición en ácidos grasos para el aceite de girasol (AG) y aceite girasol
alto oleico (AGAO) con y sin la adición de extracto de luteína (LUT). ......................... 29

Tabla 7: Contenido de tocoferoles del aceite de girasol (AG) y aceite de girasol alto
oleico (AGAO), con y sin la adición de luteína (LUT). ................................................. 30

Tabla 8: Eficiencia de encapsulación de luteína, para el sistema (AG+LUT)-INU. ...... 32

Tabla 9: Eficiencia de encapsulación de luteína, para el sistema (AGAO+LUT)-INU. . 33

Tabla 10: Recuperación de luteína en las microcápsulas obtenidas bajo condiciones

óptimas después del secado por atomización. ............................................................ 37

Tabla 11: Contenido de luteína superficial, total y eficiencia de encapsulación de luteína

para las microcápsulas, obtenidas bajo condiciones óptimas. .................................... 38

Tabla 12: Contenido de humedad en las microcápsulas, obtenidas bajo condiciones

óptimas. ...................................................................................................................... 39

Tabla 13: Valores de concentración y área para la confección de la curva de

calibración. ................................................................................................................. 48

viii
Tabla 14: Contenido de luteína obtenida de la cinética de extracción de los pétalos
secos sin moler y los pétalos secos molidos. .............................................................. 50

ix
 RESUMEN

El Tagete (Tagete erecta) es una planta originaria de América Latina que posee un
alto contenido de luteína. La luteína es un pigmento carotenoide que pertenece al
grupo de las xantofilas. Este carotenoide puede ser encontrado en dos tejidos oculares
(macula y lente) que desempeñan un papel fundamental en la visión, previniendo la
degeneración macular y reduciendo el riesgo de cataratas. Este efecto beneficioso en
la salud se ha asociado con las propiedades antioxidantes de los carotenoides, vía
desactivación de radicales libres o atrapamiento de oxígeno singlete.

Desafortunadamente la luteína presenta una alta inestabilidad en presencia de

oxígeno, luz y altas temperaturas, lo que dificulta su incorporación a matrices
alimentarias. Una de las metodologías para otorgarle protección a la luteína es
utilizando la tecnología de microencapsulación, como el secado por atomización. La
microencapsulación permite la incorporación de sustancias activas en una matriz
polimérica con el objeto de proteger a los compuestos activos desde el medio
ambiente.

En la presente tesis se extrajo la luteína desde pétalos de flor de tagete (Tagete

erecta), utilizando el método tradicional (acetona y posterior saponificación) y el
método con extracción y saponificación simultánea (hexano). Las oleorresinas de
luteína se obtuvieron adicionando el extracto a aceites vegetales de diferente grado de
insaturación: (aceite de girasol (AG) y aceite de girasol alto oleico (AGAO)).

Las oleorresinas de luteína, se encapsularon con inulina (INU), utilizando el secado

por atomización como método de encapsulación. Se realizó un diseño factorial central
compuesto 22 para los sistemas (AG+LUT)-INU y (AGAO+LUT)-INU. Las variables

x
independientes evaluadas fueron la temperatura de entrada al secador (140-180°C) y
la relación (aceite+LUT)/inulina (1:1 a 1:3). La variable respuesta fue la eficiencia de
encapsulación de luteína. Para la optimización de la variable respuesta, se utilizó la
metodología de superficie respuesta.

El rango de eficiencia de encapsulación de luteína para los sistemas (AG+LUT)-INU

y (AGAO+LUT)-INU fue de 78-86,4% y 69,8-76,9%, respectivamente. No se encontró
un efecto significativo de la insaturación del aceite sobre la eficiencia de encapsulación
de luteína. Un aumento en el contenido de inulina aumentó la eficiencia de
encapsulación. La recuperación de luteína después del secado por atomización,
alcanzó un valor de 40%, sin diferencias significativas entre los sistemas estudiados.
Las microfotografías SEM (microscopía electrónica de barrido) mostraron partículas
irregulares, con aglomeraciones.

Las micropartículas con luteína e inulina presentan un potencial antioxidante y

prebiótico para ser utilizado como nutracéutico o para el diseño de alimentos
funcionales, adicionándose de manera directa o dentro de matrices alimentarias, como
derivados lácteos, embutidos, masas y pan, confiterías y salsas, entre otros.

xi
 SUMMARY

Tagete (Tagete erecta) is a native plant from Latin America that has a high content
of lutein. Lutein is a one kind of carotenoid pigment that belongs to the xanthophylls
group. This carotenoid can be found in two ocular tissues (macula and lens) and plays
a fundamental role in the vision; preventing macular degeneration (AMD) and reducing
the risk of cataracts. These beneficial effects on health have been associated with the
antioxidant properties of carotenoids via deactivation of free radicals or singlet oxygen
quenching.

However lutein is highly unstable in the presence of oxygen, light and high
temperatures, which makes not easy its incorporation into food matrices. The
stabilization of lutein could be improving using microencapsulation technology, such as
spray drying, for use in industrial purposes. Microencapsulation allows the incorporation
of active substances in a polymeric matrix in order to protect the active compounds
from the environmental conditions.

In this thesis lutein was extracted from flower petals of Tagetes (Tagete erecta),
using the traditional method (acetone and saponification) and extraction and
saponification simultaneous method (hexane). Lutein Oleoresins were obtained adding
extract to vegetable oils with different unsaturation degrees (sunflower oil (AG) and high
oleic sunflower oil (AGAO)).

Lutein oleoresins were encapsulated with inulin. A 22 statistical factorial design was
performed for (AG+LUT)-INU and (AGA+LUT)-INU systems using spray drying The
inlet temperature (140-180°C) and AT/coating material ratio (1:1 to 1:3) were the

xii
independent variables and lutein encapsulating efficiency was the dependent variable.
To optimize the response variable, we used the response surface methodology.

The range of encapsulation efficiency of lutein for the systems (AG+LUT)-INU and
(AGAO+LUT)-INU was 78 to 86.4% and 69.8 to 76.9%, respectively. There was not a
significant effect of unsaturation of oil on the encapsulation efficiency of lutein. An
increase in the content of inulin increased the lutein encapsulation efficiency. The
recovery of lutein after spray drying, reaching a value of 40%, showing that there was
not significant differences between the systems studied. The SEM (scanning electron
microscopy) micrographs showed irregular particles with crowds.

The lutein and inulin microparticles have potential antioxidant and prebiotic for use
as a nutraceutical or functional food design, additions directly or within food matrices
such as dairy products, meats, pastries and bread, confectionery, sauces, among
others.

xiii
 CAPÍTULO I

INTRODUCCIÓN

En los últimos años, se ha percibido un creciente interés en los carotenoides para

su aplicación en la alimentación humana, principalmente la luteína. La principal fuente
natural de la luteína, son los pétalos de las flores de Tagete (Tagete erecta) en donde
se encuentra formando esteres con diferentes ácidos grasos (Skerget y cols., 2010). La
luteína, es un carotenoide di-hidroxilado perteneciente a la clase de las xantofilas,
presenta una estructura química con un amplio sistema de dobles enlaces conjugados,
lo que le otorga su actividad antioxidante (Nachtigall, 2007).

La luteína juega un importante rol en la prevención de la degeneración macular

causada por la edad (MDA). En el centro de la retina (región de elevada agudeza
visual) es posible visualizar una pequeña mancha amarilla llamada mácula, pigmento
de la retina responsable de la visión nítida de las imágenes. El color amarillo se debe a
la presencia de carotenoides (luteína) presentes en el ojo, zona de mayor exposición a
la luz, disminuyendo la oxidación de proteínas y lípidos (Calvo, 2005).

Por otro lado, la cadena poliénica es también la causa de la inestabilidad de la

luteína incluyendo su susceptibilidad a la oxidación e isomerización. El calor, la luz y
los ácidos promueven la isomerización de los carotenoides trans (configuración
habitual en la naturaleza) a la forma cis, disminuyendo su valor biológico (Márquez y
García, 2007). Dentro de los mecanismos que se pueden utilizar para su estabilización,
se encuentra la microencapsulación, la cual permite la incorporación de sustancias
activas dentro de una matriz o sistema pared con el objeto de proteger estos
compuestos, impidiendo que sufran reacciones de oxidación debido a las condiciones
ambientales, aumentando su vida útil (Pedroza, 2002).

1
 Existe una amplia variedad de materiales de recubrimiento; sin embargo, es
importante considerar las características de éste en cuanto a flexibilidad, fuerza o
resistencia, permeabilidad, facilidad de aplicación, naturaleza hidrofóbica o hidrofílica,
ya que todas ellas influirán en las características del producto final. Entre los materiales
de recubrimiento utilizados, se pueden mencionar: polisacáridos (almidón,
maltodextrina, ciclodextrinas, carboximetilcelulosa, goma arábica, alginato de sodio),
lípidos (ceras, grasas) y proteínas (gelatina, proteína de soya, caseinatos, suero de
leche, zeina) (Gouin, 2004) entre otros. Otro posible agente encapsulante puede ser la
inulina, debido a sus propiedades técnicas y nutricionales.

La inulina es un fructooligosacárido obtenido comercialmente de la raíz de la

achicoria (Cichorium intybus). Se compone de fructosa con enlaces (2-1) unida a
glucosa al final de la cadena. Dentro de sus beneficios a la salud, se encuentra su
efecto prebiótico, que mejora la biodisponibilidad de calcio, entre otros. La inulina es
hidrolizada en pequeñas cantidades por el estómago y el intestino grueso, sin la
formación de monosacáridos; es fermentada por la microflora intestinal en ácidos
grasos de cadena corta, ácido láctico y gas. Este hecho evita un aumento el índice
glicémico, siendo un ingrediente potencial en los alimentos para diabéticos (Stevens y
cols., 2001).

Dentro de los métodos para lograr la encapsulación de ingredientes activos, el

secado por atomización es el más utilizado en la industria de alimentos, debido a que
es un proceso económico, flexible y produce partículas de buena calidad. Este proceso
de deshidratación, permite la encapsulación, ya que puede producir partículas que
atrapan el material activo. Por definición, corresponde a la transformación de un líquido
en un material sólido, atomizándolo en forma de gotas minúsculas en un medio de
secado con un gas en caliente. Una de las ventajas de este proceso, es que es
apropiado para materiales sensibles al calor, debido a que el tiempo de exposición a
temperaturas elevadas es muy corto, entre 5-30 segundos (Gharsallaoui y cols., 2007)

2
1.1 Revisión bibliográfica.

El Tagete (Tagete patula L. y Tagete erecta) es una planta herbácea anual,

originaria de América Latina, de grandes ramificaciones con flores de color amarillo a
anaranjado, las cuales crecen en un clima cálido y de baja humedad (Piccagliy y cols.,
1998). Las flores de Tagete (Tagete erecta) son la fuente más importante de luteína,
pudiendo encontrarse además en algunas variedades y caroteno (Hojnik y cols.,
2008)

1.1.2 Pigmentos carotenoides: luteína

Los carotenoides son tetraterpenos naturales derivados de la unión de 8 unidades

de isopreno, que origina un esqueleto de 40 átomos de carbono. En general los
carotenoides se clasifican en dos grandes grupos: carotenoides compuestos sólo de
carbono e hidrógeno que se denominan carotenos y los que contienen oxigeno que se
denominan xantofilas (Rodriguez-Amaya, 2001). Los carotenoides pueden presentar
una estructura acíclica, o cíclica de cinco o seis carbonos en uno o ambos extremos de
la molécula. Dado el gran número de dobles enlaces de la cadena central, los
carotenoides pueden existir en conformaciones cis/trans, aunque la más estable y por
tanto presente en la naturaleza es la trans (Mínguez-Mosquera y cols., 2006).

La luteína pertenece al grupo de las xantofilas de formula general C 40H56O2 y

nombre sistemático β,ε-carotene-3,3′-diol (Rodriguez-Amaya, 2001). La estructura se
muestra en la Figura 1. Este pigmento carotenoide es uno de los principales
componentes de vegetales verdes, frutas de color naranja y yema de huevo, donde se
puede encontrar libre ó esterificada con ácidos grasos. La fuente más importante (en
una cantidad 20 veces mayor) son los pétalos de flores de tagete (Tagete erecta), en
donde la luteína esta químicamente ligada a varios tipos de ácidos grasos como el

3
ácido láurico, miristico y palmítico. Al saponificar el extracto de tagete, se obtiene
luteína libre (Hojnik y cols., 2008).

H3C OH
CH3 CH3
H3C CH3

H3C CH3
CH3 CH3
HO CH3
Figura 1: Estructura química de la Luteína

La luteína es un antioxidante biológico que inactiva a los radicales libres producidos

en la autoxidación de lípidos y/o atrapa oxígeno singlete. La propiedad antioxidante de
los carotenoides se relaciona con su estructura, debido a la presencia de un elevado
número de enlaces conjugados alternados (Nachtigall, 2007). Los carotenoides que
tienen nueve o más enlaces dobles otorgan la máxima protección (Rodriguez- Amaya,
1999), ya que los dobles enlaces permiten la absorción de energía de especies
reactivas, canalizándola a través de las largas cadenas de dobles enlaces que entran
en resonancia, luego la energía es liberada en forma de calor, regenerando la molécula
de carotenoide a su estado inicial (Nachtigall, 2007).

De esta forma el principio de protección conferido por la luteína contra reacciones

de foto sensibilización se basa en un mecanismo de transferencia de energía que
vuelve el oxígeno singlete a su estado basal (ecuación 1). El retorno de la luteína
triplete a su estado original, por la disipación de energía en forma de calor, de acuerdo
con la ecuación 2, que hace posible que esta pueda reaccionar con otro oxigeno
singlete (Nachtigall, 2007).

(1)

(2)

4
 Las reacciones en cadena de formación de peróxido, que ocurren en la
autooxidación de lípidos, pueden ser interrumpidas por los carotenoides a través de
tres posibles mecanismos: por transferencia de electrones, donación de hidrógeno o
por adición, ecuaciones 3, 4 y 5 respectivamente.

(3)

(4)

(5)

1.1.2.1 Importancia biológica de la luteína

La luteína, además de ser un potente antioxidante, presenta beneficios para la salud

humana, siendo conocida como “el nutriente protector del ojo”. Este efecto se ha
confirmado a partir de varios estudios que muestran una relación inversa entre la
luteína y enfermedades oculares (Alves-Rodrigues y Shao, 2004). La luteína está
presente en dos tejidos oculares que desempeñan un papel fundamental en la visión:
la mácula y el lente. La mácula lútea (o "mancha amarilla", por su característico color
amarillo) se encuentra en la parte central de la retina y posee la más alta concentración
de fotorreceptores que son responsables de la visión central y la agudeza visual de alta
resolución. Los daños inducidos por la luz en la retina dependen en gran medida de la
longitud de onda y tiempo de exposición. La luteína es capaz de absorber la luz en un
amplio espectro de longitud de onda entre 440 nm y 590 nm, alcanzando su peak de
absorción en 446 nm del espectro visible, lo cual indicaría que cumple una función
como agente fotoprotector, descartando la luz dañina del sol. Debido a esto la luteína
ofrece una protección a las células de la mácula, actuando como un antioxidante y con
esto preservando la salud macular (Alves-Rodrigues y Shao, 2004).

5
1.1.3 Extracción de luteína.

Los métodos tradicionales para la extracción de componentes bioactivos desde

plantas, incluyen: la destilación por vapor y la extracción con solventes orgánicos
(maceración o técnicas Soxhlet). Específicamente los pigmentos carotenoides son
compuestos liposolubles, que normalmente se extraen con solventes orgánicos tales
como: acetona, éter de petróleo, benceno, hexano, éter dietílico, cloroformo, etanol y
metanol (Park y cols., 2007). Sin embargo, los solventes presentan algunas
desventajas como: la degradación y pérdida de los componentes bioactivos, los
grandes volúmenes de solventes que se utilizan, el tiempo de los procesos y el alto
costo de los insumos y mano de obra (Sovová y cols., 2004), además de obtener
extractos con residuos de solvente. El interés en alternativas a la extracción con
solventes convencionales, tales como el dióxido de carbono supercrítico (SC-CO2) es
cada vez mayor, ya que el CO2 no es inflamable y no ocasiona daño al medio ambiente
(Gao y cols., 2009).

Los principales parámetros para la selección de una tecnología de extracción son:

las características bioquímicas de las moléculas extraídas, la rapidez, la limitación del
uso de solventes, reproducibilidad, rendimiento de la extracción, la selectividad, la
protección de las moléculas extraídas para que no sufran transformación química y
costo (Pasquet y cols., 2010).

Estudios realizados han demostrado que la luz, el oxígeno y la alta temperatura

promueven la degradación e isomerización de la luteína (Calvo, 2005). Uno de los
mecanismos utilizados para estabilizar la luteína es la microencapsulación, la cual
permite la incorporación de sustancias dentro de una matriz o sistema pared con el
objeto de proteger estos compuestos, impidiendo que sufran reacciones debido a la luz
y/o al oxígeno (Pedroza, 2002).

6
1.1.4 Microencapsulación

La microencapsulación es definida como la tecnología que incorpora cantidades

microscópicas de materiales sólidos, líquidos o gaseosos sellados en cápsulas, que
pueden liberar su contenido a una velocidad controlada bajo condiciones específicas
(Desai y Park, 2005). Dicha tecnología ha sido utiliza por la industria de los alimentos
por más de 60 años. La selección del proceso de microencapsulación está dado por las
propiedades (físicas y químicas) del material del núcleo y el recubrimiento. Diferentes
técnicas se utilizan para la encapsulación, tales como: secado por atomización (spray-
drying), enfriamiento por atomización (spray cooling/chilling), recubrimiento por lecho
fluidizado (fluidized-bed coating), extrusión, extrusión centrifuga (centrifugal extrusión),
liofilización, coacervación, separación por centrifuga (centrifugal suspension
separation), cocristalización, liposomas, complejación por inclusión entre otros (Desai y
Park, 2005).

El secado por atomización se ha utilizado en la industria alimentaria desde finales

de 1950. Es la técnica más utilizada en la industria alimentaria ya que es un proceso
económico, flexible y que ofrece una variación sustancial en la matriz de
microencapsulación; adaptable a equipos de uso general de procesamiento, y produce
partículas de buena calidad. Una de las limitaciones de esta tecnología es el número
limitado de materiales que se pueden utilizar como agentes encapsulantes, debido a
que casi todos los procesos en la industria alimentaria se llevan a cabo a partir de
formulaciones de alimentos acuosos, por lo que el material debe ser un biopolímero
soluble en agua a un nivel aceptable y de baja viscosidad, que permita un alto
contenido de sólidos. En este método, se homogeniza el material que se desea
encapsular con el encapsulante en una determinada proporción, si el compuesto
bioactivo es hidrofóbico se debe preparar previamente una emulsión. La solución
resultante es alimentada al secador y es atomizada por medio de una boquilla ó un
disco que gira a alta velocidad. El agua es evaporada por el aire caliente en contacto
con el material atomizado dando origen a las microcápsulas que son luego

7
recolectadas en el contenedor del secador (Desai y Park, 2005). La Figura 2 muestra
un equipo de secado por atomización.

Para obtener una buena eficiencia de encapsulación, incluso si el material de

encapsulación es adecuado, se deben optimizar las condiciones de formulación y de
proceso. Los principales factores que deben ser optimizados son: temperatura de
alimentación, temperatura de ingreso y salida del aire y relación compuesto bioactivo:
agente encapsulante (Gharsallaoui y cols., 2007).

Fuente: http://www.buchi.com

Figura 2: Secador por atomización

1.1.5 Materiales de encapsulación

La elección del material para encapsulación por secado por atomización, es muy
importante para la eficiencia de encapsulación y estabilidad de la micropartícula. El
criterio de selección se basa en las propiedades físico-químicas tal como: peso

8
molecular, punto de ebullición, solubilidad, viscosidad, difusividad, cristalinidad,
capacidad de formación de películas y propiedades emulsificantes (Gharsallaoui y
cols., 2007).

Dentro de algunos materiales de uso común para recubrimiento biocompatible y de

calidad alimentaria están presentes los carbohidratos (almidón, maltodextrina,
quitosano), celulosas (carboximetilcelulosa, metil y etil celulosa), gomas (goma acacia,
agar, alginato de sodio, carragenina), lípidos (aceites, grasas, cera) y proteínas (gluten,
caseinatos, gelatina, albuminas, péptidos) (Desai y Park, 2005). En esta tesis se utilizó
inulina como agente encapsulante.

1.1.5.1 Inulina

La inulina es un interesante agente encapsulante debido a sus propiedades técnicas

y nutricionales. Es un fructooligosacárido (FOS) obtenido comercialmente de la raíz de
achicoria (Cichcorium intybus), Dahlia (Dahlia pinuata Cav) o alcachofa Jerusalem
(Heliaanthus tuberosus). Está compuesta por unidades de fructosa con enlaces β(2-1)
unida a glucosa en el final de la cadena (Stevens y cols., 2001; Saénz y cols., 2009).

La inulina tiene efectos prebióticos y acción de fibra dietaria y mejora la

biodisponibilidad de calcio entre otros beneficios. Es solamente hidrolizada en
pequeñas cantidades en el estomago y el intestino grueso sin la formación de
monosacáridos; esta es fermentada a lo largo de la flora intestinal en ácidos grasos de
cadena corta, acido láctico y gas (Saénz y cols., 2009). Por lo tanto no hay un
incremento en el índice glicémico, proyectándose como un ingrediente potencial para
alimentos para diabéticos (Stevens y cols., 2001). Se ha demostrado también que la
incorporación de inulina en la dieta reduce los niveles de colesterol y lípidos séricos
(López-Molina y cols., 2005).

9
 Por otra parte, generalmente para estandarizar el contenido de compuestos
bioactivos hidrofóbicos se preparan oleorresinas, utilizando una matriz lipídica. En esta
tesis se utilizó aceite de girasol y aceite de girasol alto oleico.

1.1.5.2 Aceite de girasol y girasol alto oleico.

El aceite de girasol es una materia grasa de origen vegetal que se encuentra en el

grupo de los aceites comestibles de nuestro país. Es un aceite preferentemente
poliinsaturado, dado principalmente por la presencia de ácido linoleico con un
contenido entre 57 y 71% (Masson y Mella, 1985). Por otra parte el aceite de girasol
alto oleico es preferentemente monoinsaturado con un 70% de ácido oleico y un 20%
de ácido linoleico (Lampi y Kalman-Eldin, 1998).

10
1.2 Hipótesis

La eficiencia de encapsulación de la luteína en las microcápsulas será

independiente del grado de insaturación de la matriz lipídica utilizada en la elaboración
de las microcápsulas.

1.3 Objetivos

1.3.1 Objetivo general

Estudiar el efecto del grado de insaturación del aceite utilizado en la elaboración de

microcápsulas de luteína extraída de pétalos de flor de tagete (Tagete erecta), sobre la
eficiencia de encapsulación de luteína.

1.3.2 Objetivos específicos

- Caracterizar los principales pigmentos carotenoides presentes en las flores de

tagete y en los aceites (aceite de girasol y aceite de girasol alto oleico)
adicionados de un extracto de luteína obtenido de flores de tagete.
- Estudiar la razón aceite+lut/agente encapsulante y temperatura de secado
(variables independientes) sobre la eficiencia de encapsulación de luteína
(variable dependiente), por medio de un diseño estadístico.
- Estudiar el efecto del proceso de secado sobre la recuperación de luteína
determinando el contenido de luteína antes y después del secado por
atomización.

11
 CAPÍTULO II

MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Materiales

2.1.1 Materias primas

- Flores de tagete (Tagete erecta), de color rojo, amarillo y naranjo, adquiridos en

Homecenter Sodimac S.A. Las Condes, Santiago, Chile, en Noviembre de 2009

- Flores de tagete (Tagete erecta), color naranjo, adquiridos en Easy S.A. Viña
del Mar, Chile, en Febrero de 2010.

- Aceite de girasol, sin antioxidante adicionado (Natura, Chile)

- Aceite de girasol alto oleico, sin antioxidante adicionado (Miraflores, Chile)

- Inulina Raftilina-HP (DP>23) adquirida en Alfa Chilena S.A.

- Caseinato de sodio, grado alimentario (Prinal, Chile)

- Estándares para ácidos grasos (Sigma).

- Estándares de tocoferoles Calbiochem (Merck, Darmstadt, Germany)

2.1.2 Equipos

- Agitador magnético NUOVA.

- Agitador vortex Cenco Instrument B.V.

- Balanza analítica Precisa 125 A.

12
- Centrifuga modelo ROTOFIX 32 Hettich.

- Columna para HPLC LiChrocart Superspher Si-60 (5 µm x 4 mm d.i x 250 mm.,

Merck, Alemania).

- Columna para HPLC Carotenoid S-5 (5 μm x 4,6 mm d.i. x 250 mm, YMCTM).

- Cromatógrafo de gases Hewlett Packard (HP) 5890 serie II con detector FID,
integrador HP 3395, con columna SP-2560 (100 m x 0,25 µm film x 0,20 d.i.,
Supelco, USA).

- Equipo HPLC, compuesto de una bomba Merck-Hitachi L-6200, inyector

Rheodyne 7725i, loop 20 µL, detector de arreglo de diodos (Waters 996)
acoplado a un software Empower pro.

- Equipo HPLC, compuesto de una bomba Merck-Hitachi L-6200 A, inyector

Rheodyne 7725i, loop 20 µL, detector de fluorescencia Merck-Hitachi F-1050
acoplado a un computador con software Clarity (versión 2.4.1.43).

- Espectrofotómetro UV/Vis HITACHI U-2900.

- Estufa WTC Binder MEMMERT, ESM 02.

- Microscopio electrónico de barrido, JEOL, JSM-25SII.

- Moledora de café UFESA.

- Rotavapor BÜCHI Heating Bath B-490.

- Mini Spray Dried BÜCHI B-290.

- Ultra Turrax POLY TRON PT 2100.

- Compresor modelo Haug 1HP

13
2.2 Metodología

2.2.1 Determinación del contenido de luteína en pétalos de tagete (Tagete erecta).

Los pétalos se obtuvieron manualmente de las flores de tagete (Tagete erecta) y se

secaron en estufa a 40ºC (WTC Binder, MEMMERT, ESM 02) durante 24 horas, luego
se molieron con una moledora de café (Ufesa) hasta obtener un polvo fino.

La extracción de los pigmentos desde los pétalos frescos o pétalos secos, se realizó
de acuerdo al método descrito por Rodriguez-Amaya, 2001 (Anexo 6.1). El análisis de
luteína se realizó por HPLC usando una columna Carotenoid S-5 (C30, 5 μm x 46 mm
d.i x 250 mm, YMCTM) a una temperatura de 30ºC. La fase móvil consistió en: fase A
(Metanol: MTBE (metil tert-butil éter): agua (90:7:3 v/v/v)) y fase B (Metanol: MTBE
(metil tert-butil éter): agua (7:90:3 v/v/v)), de acuerdo al programa de la Tabla 1.

Tabla 1: Programa utilizado en HPLC

Fase móvil
Tiempo (min) %A %B
0 95 5
30 65 35
40 60 40
50 5 95
60 95 5
A: 90% Metanol HPLC, 7% MTBE (metil tert-butil éter) y 3% Agua
B: 7% Metanol HPLC, 90% MTBE (metil tert-butil éter) HPLC y 3% Agua

El equipo HPLC consistió de una bomba Merck-Hitachi L-6200 con detector de

arreglo de diodos (Waters 996) acoplado a un software Empower pro. La luteína se
detectó a 450 nm y se identificó comparando los tiempos de retención con estándar de

14
luteína. La cuantificación se realizó de acuerdo a una curva de calibración de luteína
(1-22,4 µg/mL, r2=0,999, Anexo 6.2)

Solución estándar de luteína. All-trans-luteína se obtuvo desde flores de tagete

(Tagete erecta). El pigmento se purificó por cromatografía en columna abierta con fase
MgO:celite (1:1), como describió Rodriguez-Amaya y cols. (1976). La concentración del
estándar en éter dietílico se determinó por espectrofotometría, considerando una
longitud de onda de 445 nm y un coeficiente de absorción de 2480 A1%1cm.

2.2.2 Preparación de extracto de luteína a partir de pétalos de tagetes.

Se realizaron dos métodos de extracción de luteína desde pétalos de tagetes: A)

extracción con acetona y posterior saponificación, de acuerdo al método descrito por
Rodriguez-Amaya, 2001 y B) extracción con saponificación simultánea utilizando
hexano, de acuerdo al método descrito por Hojnik y cols., 2008. Este último se realizó
desarrollando una cinética de extracción.

A) Extracción con acetona y posterior saponificación, de acuerdo al método

descrito por Rodriguez-Amaya.

Los pétalos secos y molidos (25 g), se maceraron con acetona fría (300 mL) en un
matraz durante 15 minutos. A continuación, se filtró al vacío en un embudo Büchner, la
torta se re-extrajo con pequeños volúmenes de acetona hasta la obtención de una torta
blanca. El solvente de la solución de pigmentos resultantes, se evaporó en rotavapor.

Posteriormente, se adicionó éter dietílico y un volumen igual de hidróxido de potasio

en metanol 10% p/v y se mezcló, se cubrió el balón con papel aluminio durante 12 h a
temperatura ambiente. Luego se lavó la solución con agua destilada para remover el
álcali, adicionando pequeñas porciones de solución cada vez al embudo de

15
decantación para evitar emulsificaciones. Cuando toda la solución de pigmento está en
el embudo de decantación se lavó reiteradas veces con agua, hasta que el agua de
lavado no estuvo alcalina.

La solución de pigmento obtenida del embudo de decantación se filtró con sulfato

de sodio anhidro para eliminar el agua remanente y se evaporó con nitrógeno gaseoso
para almacenarla en un congelador.

B) Extracción con saponificación simultánea utilizando hexano, de acuerdo al

método descrito por Hojnik.

La extracción del los pigmentos, se realizó de acuerdo al método descrito por Hojnik
y cols., 2008. Los pétalos secos se separaron en dos grupos a los cuales se le
realizaron diferentes tratamientos. Al primer grupo se le realizó una molienda hasta
obtener un polvo fino y al segundo grupo no se le realizó molienda. Los pétalos (1 g
cada grupo), se adicionaron sobre una solución de 75 mL de metanol, 100 mL de
hexano y 7,5 g de hidróxido de potasio con agitación constante. Se tomaron muestras
de 1 mL a los siguientes tiempos 0, 30 s, 1, 1,5, 2, 3, 4, 15, 30, 60, 90, 120, 180, 360,
min y a las 24 h (correspondiente al tiempo infinito).

Las muestras se adicionaron a tubos de ensayo que contenían 3 mL de agua

destilada y 2 mL de éter dietílico. La fase orgánica se lavó con agua destilada hasta
que las aguas de lavado alcanzaron un pH neutro. Posteriormente, se llevaron a
sequedad con nitrógeno gaseoso y se cuantificó la concentración de luteína mediante
espectrofotometría a 445 nm utilizando éter dietílico.

16
2.2.3 Elaboración de las oleorresinas de luteína.

El extracto (método A) de luteína (LUT) de los pétalos de flor de tagete (tagete

erecta), se adicionó a cada uno de estos aceites en forma independiente: aceite de
girasol (AG+LUT) y aceite de girasol alto oleico (AGAO+LUT). En cada procedimiento
se pesó el extracto en un balón para rotavapor y se le adicionó el aceite de girasol o
girasol alto oleico, en una relación extracto aceite 1:50 p/p para ambos casos. Luego
se agregó 3 mL de etanol para lograr la disolución total de la luteína en el aceite, lo
cual se realizó mediante agitación constante por 30 min. Finalmente se evaporó el
etanol en un rotavapor a una temperatura de 40°C.

2.2.4 Caracterización de aceites con y sin la adición de extracto de luteína

Se caracterizó el aceite de girasol (AG) y el aceite de girasol alto oleico (AGAO),

con y sin la adición de extracto de luteína (AG+LUT y AGAO+LUT), de acuerdo a su
composición en ácidos grasos y contenido de tocoferoles.

2.2.4.1 Determinación de la composición de ácidos grasos por GLC.

Los ésteres metílicos se prepararon, de acuerdo al método de la AOCS Ce-2 66

(AOCS, 1993). El perfil de ácidos grasos se determinó utilizando un cromatógrafo de
gases Hewlett Packard (HP) 5890 serie II con detector de ionización de llama (FID),
integrador HP 3395 y columna SP-2560 (0,25 µm film x 0,20 d.i. x 100 m, Supelco,
USA), utilizando como carrier hidrógeno. Se utilizó un Split de 1:100, con un flujo de
1mL/min. El volumen inyectado fue de 0,5 µL. La temperatura inicial del horno fue de
160ºC, durante tres minutos y luego se incrementó con una velocidad de 2ºC/min,
hasta alcanzar 200ºC. La temperatura del inyector y la del detector se fijó en 240ºC. La
identificación de cada ácido graso se efectuó mediante la determinación de los tiempos
de retención absolutos y relativos de retención de cada ácido graso, comparado con

17
estándares puros (Merck, Darmstadt, Germany). Los resultados se expresaron como %
de ésteres metílicos relativos al total.

2.2.4.2 Determinación de tocoferoles.

La determinación de tocoles se realizó por HPLC con detector de fluorescencia, de

acuerdo al método de la AOCS Ce 8-89 (AOCS, 1993). El equipo estuvo compuesto de
una bomba Merck-Hitachi L-6200 A, inyector Rheodyne 7725i, loop 20 µL, detector de
fluorescencia Merck-Hitachi F-1050 acoplado a un computador con software Clarity
(versión 2.4.1.43). La detección se realizó a 290 nm (longitud de onda de excitación) y
330 nm (longitud de onda de emisión). Se utilizó una columna LiChrocart Superspher
Si60 (5 µm x 4 mm d.i. x 250 mm Merck). La fase móvil correspondió a 2-propanol en
hexano (0,5:99,5 v/v) con un flujo de 1mL/min. La identificación y cuantificación se
realizó por comparación con estándares de tocoferoles Calbiochem (Merck, Darmstadt,
Germany) de concentración conocida mediante la siguiente fórmula:

donde:

a= área del peak del tocol en la muestra; C= concentración del tocol en el estándar
(µg/mL); V=volumen del matraz aforado (mL); D=Factor de dilución (si correspondiera);
A= área del peak del tocol en el estándar; P= peso de la muestra (g)

2.2.5 Elaboración de las dispersiones para microencapsular.

La pre-emulsión se preparó mezclando las oleorresinas de luteína (AG+LUT ó

AGAO+LUT) (5 g) con una solución de 20 g de agua y 1,9 g de caseinato de sodio.
Luego, la solución se homogenizó en un Ultra Turrax (POLY TRON PT 2100) por 3
minutos a una velocidad de 15000 rpm.

18
 La inulina (5-15 g) se adicionó en pequeñas porciones y agitación constante sobre
agua destilada (58,1-68,1 g) previamente calentada a 70°C. En un vaso se mezcló la
pre-emulsión (26,9 g) con la inulina disuelta como se muestra en la Tabla 2. La mezcla
resultante se homogenizó con un Ultra Turrax (POLY TRON PT 2100) durante 3
minutos a una velocidad de 15000 rpm.

Tabla 2: Condiciones utilizadas para la preparación de las dispersiones en los

diferentes ensayos.
Pre- Agente
Temperatura Relación Agua
emulsión encapsulante
Ensayo
(ºC) (MN/AE) (g)
(g) (g)

1 140 1:1 26,9 5 68,1

2 160 1:1 26,9 5 68,1
3 180 1:1 26,9 5 68,1
4 140 1:2 26,9 10 63,1
5 160 1:2 26,9 10 63.1
6 160 1:2 26,9 10 63,1
7 180 1:2 26,9 10 63,1
8 140 1:3 26,9 15 58,1
9 160 1:3 26,9 15 58,1
10 180 1:3 26,9 15 58,1
MN: material núcleo, AE: agente encapsulante.

2.2.6 Secado por atomización.

Las dispersiones resultantes de AG+LUT y AGAO+LUT con inulina como agente

encapsulante se alimentaron a un secador por atomización Mini Spray Dried B-290,
utilizando una alimentación de 5 mL/min, aspiración de 100 % y flujo de aire de 600
L/h. Los polvos resultantes se almacenaron en frascos a -20ºC.

19
2.2.7 Diseño estadístico

Se aplicó un diseño central compuesto 2 2 para los sistemas (AG+LUT)-INU y

(AGAO+LUT)-INU, con un total de 10 experimentos para cada uno. Se consideró como
variables independientes la temperatura del aire de entrada al secador y la relación
((AG ó AGAO)+LUT)/inulina y como variable dependiente o de respuesta la eficiencia
de encapsulación de la oleorresina de luteína. Se empleó el método de superficie de
respuesta (MSR) para la optimización de la variable dependiente. La matriz del diseño
experimental se muestra en la Tabla 3.

Tabla 3: Niveles para las variables independientes usadas en el diseño

experimental para la microencapsulación de oleorresinas de luteína.

VARIABLES NIVELES
-1 0 1

aceite+LUT / inulina 1:1 1:2 1:3

Temperatura (ºC) 140 160 180

Aceite: AG ó AGAO

2.2.8 Caracterización de las microcápsulas

2.2.8.1 Determinación de luteína superficial de las microcápsulas

La concentración de luteína se determinó de acuerdo al método de Loksuwan, 2007

y la ecuación (6).

(6)

20
 La luteína superficial de las microcápsulas de los sistemas (AG+LUT)-INU ó
(AGAO+LUT)-INU (200 mg) se extrajo con 3 mL de hexano (solvente en el cual las
microcápsulas son insolubles) y se agitaron en un vortex. La fase orgánica, se filtró y
se evaporó el solvente con nitrógeno. A continuación se realizó la saponificación con 5
mL de éter dietílico, 10 mL de hidróxido de potasio en metanol (10% p/v), 1 mL BHT en
metanol (0,1% p/v) por 12 h en oscuridad. Posteriormente se realizó la transferencia de
luteína a éter dietílico en un embudo de decantación. Se lavó con agua, hasta obtener
pH neutro en el agua de lavado. La fase etílica se evaporó con nitrógeno. El contenido
de luteína se determinó por HPLC, como se describió en el ítem 2.2.1.

2.2.8.2 Determinación de luteína total en las microcápsulas

La luteína total de las microcápsulas de los sistemas (AG+LUT)-INU ó

(AGAO+LUT)-INU (100 mg) se extrajo con 3 mL de éter dietílico; se agitó en vortex
durante 1 minuto, se centrifugó 5 minutos. Se repitió la extracción con 2 mL de éter
dietílico. La fase orgánica obtenida de ambas extracciones se saponificó con 5 mL de
éter dietílico, 10 mL de hidróxido de potasio en metanol (10% p/v), 1 mL BHT en
metanol (0,1% p/v) por 12 h en oscuridad. Se lavó con agua, hasta obtener un pH
neutro en el agua de lavado. La fase etílica se evaporó con nitrógeno. El contenido de
luteína se determinó por HPLC, como se describió en el ítem 2.2.1.

2.2.8.3 Cálculo de la eficiencia de encapsulación de luteína.

El porcentaje de eficiencia de encapsulación de cada muestra se determinó de

acuerdo al contenido superficial y total de luteína en las microcápsulas según la
siguiente relación:

(7)

21
2.2.9 Caracterización de las microcápsulas obtenidas bajo condiciones óptimas.

Las microcápsulas obtenidas bajo condiciones óptimas MCPs (AG+LUT) y

(AGAO+LUT) se caracterizaron por su contenido de luteína total y superficial, y
eficiencia de encapsulación, de acuerdo a los métodos descritos previamente.

2.2.9.1 Morfología de la partícula.

Se determinó mediante microscopía electrónica de barrido (SEM), utilizando un

microscopio Jeol JSM-25SII, a 30 kV del Servicio de Microscopía Electrónica de la
Pontificia Universidad Católica de Chile.

2.2.9.2 Contenido de humedad.

La humedad se determinó por termogravimetría (AOAC 935.29; 1996). Las

microcápsulas (1g) se pesaron en una cápsula de porcelana y se colocaron en una
estufa de aire forzado a 105ºC (WTC Binder, MEMMERT, ESM 02), hasta alcanzar
peso constante. Estos ensayos se realizaron en duplicado.

22
 CAPÍTULO III

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1 Contenido de luteína en pétalos de flores de tagete (Tagete erecta).

El contenido de luteína para los pétalos de flor de tagete (Tagete erecta) de colores
naranjo, amarillo y rojo, se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4: Contenido de luteína de los pétalos de flor de tagete (Tagete erecta)

naranja, amarilla y roja.

Pétalos flor naranja Pétalos flor amarilla Pétalos flor roja

Contenido de
luteína (mg/g 9,98 ± 0,02a 0,78 ± 0,003b 7,65 ± 0,23c
pétalo)*
Letras diferentes indican diferencias significativas (p< 0,05). *Valores expresados en base seca.

Como se muestra en la Tabla 4 el mayor contenido de luteína se obtuvo para los

pétalos de la flor naranja (9,98 mg/g pétalo). Este valor es similar al reportado en la
literatura de 11,0 ± 0,47 mg/g, utilizando las mismas condiciones de extracción
(Deineka y cols., 2007). De acuerdo con estos resultados se seleccionó los tagetes de
color naranjo para los siguientes experimentos.

En la Figura 3, se muestra el cromatograma obtenido por HPLC para el extracto

saponificado de los pétalos de flor naranja donde se observa el pick de luteína libre a
los 13 minutos. No se observaron ésteres de luteína, los cuales tienen tiempos de
retención mayores al de la luteína libre (Giuffrida y cols., 2007).

23
 0,80

13,462
0,60
AU

0,40

0,20

0,00
10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00
Minutes

Figura 3: Cromatrograma del extracto saponificado de luteína, desde pétalos de

tagetes de color naranjo.

3.2 Obtención de extracto de luteína a partir de flores de tagete.

La extracción de luteína desde los pétalos de flor de tagete naranjo se realizó por
dos métodos: (A) extracción con acetona y posterior saponificación (Rodríguez-Amaya,
2001) y (B) extracción con saponificación simultáneos utilizando hexano (Hojnik y cols.,
2008). La saponificación es necesaria para obtener la luteína libre, debido a que en
forma natural se encuentra formando ésteres con ácidos grasos.

El método (A) de extracción con acetona y posterior saponificación es el más

utilizado ya que requiere menor cantidad de solvente y permite obtener mayor
extracción de carotenoides. Además el método (B) no asegura una completa
saponificación durante la extracción (Rafajlovska y cols., 2007).

En la Figura 4, se presenta la cinética de extracción de luteína desde pétalos secos

de tagetes naranjo sin moler y molidos obtenida aplicando el método de extracción y
saponificación simultáneos (Hojnik y cols., 2008). Se observa que la extracción de
luteína desde los pétalos de tagete molidos alcanzó un valor de 4,0 ± 0,2 mg luteína/g

24
pétalo seco antes de los 30 minutos, mientras que para los pétalos sin moler se
alcanzó un valor de 3,2 ± 1,5 mg luteína/g pétalo seco a las 24 horas de extracción. La
velocidad de extracción depende del tamaño de partícula, sin embargo los pétalos sin
moler y molidos alcanzaron un contenido similar de luteína al final del proceso. Estos
resultados están de acuerdo con los reportados por Hojnik y cols. (2008).

Contenido (mg luteína/g pétalos secos sin moler)

Contenido (mg luteína/g pétalos secos molidos)
4,00

3,50

3,00
Contenido (mg/g)

2,50

2,00

1,50

1,00

0,50

0,00
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360
Tiempo (min)

Figura 4: Perfil cinético de extracción de luteína desde pétalos secos de tagetes

naranjo sin moler y molidos.

Se utilizó el modelo de difusión de extracción sólido-líquido derivado de la segunda

ley de Fick, que propone la presencia de dos procesos paralelos de difusión dentro de
los sólidos; uno rápido (D1) y uno lento (D2) como se muestra en la ecuación (3), en
donde el segundo término de la ecuación D2, es tan pequeño respecto a D1 que es
despreciable (Crank, 1975), (Anexo 6.5)

25
 El coeficiente de difusividad obtenido de la extracción de luteína de los pétalos de
flor de tagete (Tagete erecta) molidos (diámetro de partícula de 0,5 mm), fue de
6,35*10-06 cm2/seg, utilizando como solvente hexano. Un valor de coeficiente de
difusividad de 6,12*10-08 cm2/seg reportó Hojnik y cols., (2008) utilizando condiciones
experimentales semejantes a las de esta tesis.

En la Figura 5 (A, B, C) se presentan los cromatogramas obtenidos por HPLC para

la extracción y saponificación simultánea a los 4, 6 minutos y 24 h, respectivamente de
los pétalos de flores de tagete naranjas molidas. En estas figuras se observa que a
medida que transcurre el tiempo, los ésteres de luteína van desapareciendo y el peak
de luteína libre aparece, lográndose a las 24 h la total saponificación de los ésteres de
luteína.

En la Tabla 5 se presenta el contenido de luteína obtenido utilizando el método

tradicional de extracción con acetona y posterior saponificación (A) y el método de
extracción con saponificación simultánea utilizando hexano (B). Con el método (A) se
obtuvo una contenido de luteína de 9,98 ± 0,02 mg luteína/g pétalo seco,
significativamente mayor al obtenido por el método (B) de 4,01 ± 0,15 mg luteína/g
pétalo secos molidos. Esta diferencia puede estar relacionada con la polaridad del
solvente utilizado (acetona v/s hexano) y/o el tiempo de extracción, ya que un mayor
tiempo de exposición del pigmento carotenoide al solvente, al oxígeno y la luz produce
oxidación y degradación del mismo (Rodríguez-Amaya, 2001).

26
 0,35

0,30 A
0,25

0,20
AU

0,15

0,10

17,460
0,05

0,00
10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00
Minutes

0,35

0,30 B
0,25

0,20
19,669
AU

0,15

0,10

0,05

0,00
10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00
Minutes

0,35
18,905

0,30 C
0,25

0,20
AU

0,15

0,10

0,05

0,00
10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00
Minutes

Figura 5: Cromatograma por HPLC para la cinética de extracción-saponificación de

pétalos de tagetes naranjas molidos: 4 minutos (A); 360 minutos (B); 24 horas (C).

27
 Tabla 5: Comparación entre el método de extracción por
acetona y hexano.

Método A Método B Método B

pétalo seco pétalo seco pétalo seco
molido molido sin moler

Contenido de
luteina mg/g 9,98 ± 0,02a 4,01 ± 0,15
b b
3,15 ± 1,47
de pétalo seco
A: Extracción con acetona y posterior saponificación
B: Extracción y saponificación simultáneos
Letras diferentes indican diferencias significativas (p< 0,05)

En este contexto, se decidió utilizar el método (A), de extracción con acetona y

posterior saponificación, para extraer la luteína desde los pétalos de la flor de tagete
(Tagete erecta).

3.3 Composición en ácidos grasos de los aceites de girasol (AG) y girasol alto
oleico (AGAO), con y sin la adición de extracto de luteína (LUT).

La composición de ácidos grasos para AG, AG+LUT, AGAO, AGAO+LUT,

expresado en porcentaje de ésteres metílicos, se describe en la Tabla 6. En AG
predominaron los ácidos grasos poliinsaturados (59,8%), seguido por los
monoinsaturados (28,4%) y los saturados (11,9%), destacándose como componentes
principales en cada grupo, el acido linoleico (57,1%), oleico (26,2%) y (6,5%) palmítico,
respectivamente. El AGAO mostró un perfil de ácidos grasos preferentemente
monoinsaturado (83,0%), donde el ácido oleico fue el principal con un porcentaje de
81,8%. Los ácidos grasos poliisaturados y saturados presentaron valores de 7,7% y
8,7%, respectivamente. La composición en ácidos grasos para AG y AGAO, concuerda
con la descrita en la literatura (Lampi y Kamal-Eldin, 1998; Masson y Mella, 1985).

28
 La composición de ácidos grasos de AG y AGAO no se modificó con la adición del
extracto de luteína, esto se explica debido a que en el extracto de luteína adicionada a
los aceites (AG+LUT y AGAO+LUT) no se encontraba esterificada.

Tabla 6: Composición en ácidos grasos para el aceite de girasol (AG) y aceite girasol
alto oleico (AGAO) con y sin la adición de extracto de luteína (LUT).
Ácidos Grasos Nombre % Ésteres Metílicos ± DE
AG AG+LUT AGAO AGAO+LUT
Ácidos Grasos Saturados
C12:0 Ác, Láurico - - - -
C14:0 Ác. Mirístico 0,1 ± 0,01 0,1 ± 0,01 0,04 ± 0,01 0,04 ± 0,01
C15:0 Ác. Pentadecanoico - - 0,01 ± 0,01 -
C16:0 Ác. Palmítico 6,5 ± 0,1 6,0 ± 0,27 3,9 ± 0,01 4,0 ± 0,03
C17:0 Ac. Heptadecanoico - - 0,03 ± 0,003 0,05 ± 0,0
C18:0 Ác. Esteárico 3,9 ± 0,01 3,3 ± 0,17 3,5 ± 0,02 3,5 ± 0,0
C20:0 Ác. Eicosanoico 0,3 ± 0,01 0,3 ± 0,01 0,3 ± 0,01 0,3 ± 0,02
C22:0 Ác. Docosanoico 0,8 ± 0,01 0,7 ± 0,04 0,9 ± 0,01 1,1 ± 0,03
C24:0 Ác. Tetracosanoico 0,3 ± 0,01 0,3 ± 0,01 0,05 ± 0,002 0,4 ± 0,06
TOTAL 11,9 10,7 8,7 9,4

Ácidos Grasos Monoinsaturados

C16:1 Ác.Palmitoleico 0,1 ± 0,01 0,1 ± 0,0 0,1 ± 0,01 0,1 ± 0,0
C17:1 Ác. Heptadecaenoico - - 0,04 ± 0,004 0,04 ± 0,0
C18:1 trans Ác. Elaídico 0,9 ± 0,08 0,3 ± 0,25 0,5 ± 0,02 0,4 ± 0,1
C18:1w9 cis Ác. Oleico 26,2 ± 0,1 29,1 ± 0,1 81,8 ± 0,4 81,1 ± 0,25
C18:1 w7cis Ác. Octadecaenoico 0,8 ± 0,08 0,8 ± 0,01 0,8 ± 0,01 0,9 ± 0,01
C18:1isom Ác. Octadecaenoico 0,2 ± 0,01 - - -
C20:1 Ác. Eicosaenoico 0,2 ± 0,01 0,1 ± 0,0 0,3 ± 0,01 0,3 ± 0,02
TOTAL 28,4 30,4 83,5 82,9

Ácidos Grasos Poliinsaturados

C18:2 w9c, 13t 1,4 ± 0,01 - - -
C18:2 w9c, 12t 1,2 ± 0,01 - 0,1 ± 0,01 -
C18:2 w6 Ac. Linoleico 57,1 ± 0,3 57,4 ± 0,4 7,4 ± 0,06 7,7 ± 0,0
C18:3 w3 Ac. Linolénico 0,1 ± 0,01 0,2 ± 0,01 0,2 ± 0,01 0,2 ± 0,0
TOTAL 59,8 57,6 7,7 7,9
AG: aceite de girasol AG+LUT: aceite de girasol con luteína AGAO: aceite de girasol alto oleico AGAO+LUT: aceite de girasol
alto oleico con luteína DS: desviación estándar

29
3.4 Contenido de tocoferoles en los aceites de girasol (AG) y girasol alto oleico
(AGAO), con y sin la adición de extracto de luteína (LUT).

El contenido de tocoferoles para ambos aceites AG y AGAO, con y sin la adición de

luteína se detalla en la Tabla 7. El principal tocol presente en AG y AGAO fue el α-
tocoferol, con valores de 681±37 ppm y 597±13 ppm, respectivamente. Lampi y Kamal-
Eldin (1998) y Tasan y Demirici (2005) describieron valores de alfa-tocoferol de 526 y
523 ppm, respectivamente para el AG. Lampi y Kamal-Eldin (1998) encontraron valores
de 445 ppm de α-tocoferol para el AGAO.

La adición del extracto de luteína a AG y AGAO, modificó el perfil de tocoferoles

aumentando el contenido de α-tocoferol, también se detectó la presencia de los
isómeros β, γ y δ-tocoferoles. Los resultados obtenidos indican que al realizar la
extracción de luteína de los pétalos de flor de tagete (Tagete erecta), existió una
coextracción de tocoferoles. Este comportamiento se ha observado previamente en
extractos hexanólicos y supercríticos de hojas de olivo (Guinda y cols., 2002; Jiménez
y cols., 2011, respectivamente).

Tabla 7: Contenido de tocoferoles del aceite de girasol (AG) y aceite de

girasol alto oleico (AGAO), con y sin la adición de luteína (LUT).

AG AG+LUT AGAO AGAO+LUT

α - tocoferol* 681 ± 37 889 ± 1 597 ± 13 902 ± 15
β - tocoferol* nd 48 ± 11 nd 54 ± 1
γ - tocoferol* nd 110 ± 11 nd 148 ± 5
δ - tocoferol* nd 30 ± 1 nd 25 ± 5

* Valores expresados en ppm ± DS; AG: aceite de girasol; AG+LUT: aceite de girasol con
luteína; AGAO: aceite de girasol alto oleico; AGAO+LUT: aceite de girasol alto oleico con
luteína; nd: no detectado.

30
3.5 Microencapsulación

3.5.1 Encapsulación de aceite de girasol adicionado de extracto de luteína, con

inulina (AG+LUT)-INU.

Los resultados del diseño central compuesto 2 2 para el sistema (AG+LUT)-INU se

muestran en la Tabla 8. La eficiencia de encapsulación de luteína presentó un rango
entre 78,0% y 86,4%. En la tabla se observa que la eficiencia de encapsulación
aumenta a mayores relaciones de (AG+LUT)/INU, debido a que al utilizar una mayor
cantidad de agente encapsulante, aumenta el contenido de sólidos solubles, mejorando
la retención del material núcleo durante la encapsulación. Un mayor contenido de
inulina aumenta la velocidad de secado, formándose rápidamente una costra o
membrana en la superficie de la gota que permite la difusión del agua pero retienen la
luteína (Kenyon, 1995).

El análisis por Metodología de Superficie Respuesta para la eficiencia de

encapsulación (Anexo 6.6) indica que las variables relación (AG+LUT)/INU, como la
temperatura de aire de entrada al secador en su forma lineal, tienen un efecto
significativo (p ≤ 0,05) sobre la eficiencia de encapsulación de luteína. Por el contrario,
no se encontró un efecto significativo sobre la eficiencia de encapsulación para la
forma cuadrática y la interacción de las variables independientes estudiadas

En la Figura 6 se presenta el gráfico de superficie respuesta para el sistema

(AG+LUT)-INU. De acuerdo al gráfico de Pareto las variables relación (AG+LUT)/INU y
temperatura varían positivamente con respecto a la eficiencia de encapsulación. Las
condiciones óptimas para la microencapsulación del sistema (AG+LUT)-INU se
obtuvieron para una relación 1:3 (15 g de encapsulante) de (AG+LUT):INU y 180ºC de
temperatura de aire de entrada al secador.

31
 Tabla 8: Eficiencia de encapsulación de luteína,
para el sistema (AG+LUT)-INU.

Relación Temperatura
% EE ± DS
(AG+LUT)-INU (ºC)
1:1 140 78,0 ± 1,3
1:1 160 78,8 ± 2,5
1:1 180 80,1 ± 1,6
1:2 140 78,0 ± 0,6
1:2 160 80,6 ± 4,2
1:2 160 80,3 ± 0,1
1:2 180 83,0 ± 0,6
1:3 140 83,5 ± 0,6
1:3 160 86,4 ± 0,1
1:3 180 85,5 ± 0,4
AG+LUT: aceite de girasol con extracto de luteína INU: inulina LUT:
extracto de luteína EE: eficiencia de encapsulación de luteína; DS:
desviación estándar.

Superf icie de Respuesta estimada

% E fien cia En ca p su la ción

87

85

83

81

79 3
2,6
77 2,2
1,8
140 150 1,4 Relac ión AG LUT : INU
160 170 1
180

Temperatura ºC

Figura 6. Gráfico de superficie respuesta estimada para la optimización de la eficiencia

de encapsulación del sistema (AG+LUT)-INU, con respecto a la temperatura de aire de
entrada y la relación (AG+LUT)/INU.

32
3.5.2 Encapsulación de aceite de girasol alto oleico adicionado de extracto de
luteína, con inulina (AGAO+LUT)-INU.

Los resultados del diseño central compuesto 2 2 para el sistema (AGAO+LUT)-INU

se muestran en la Tabla 9. La eficiencia de encapsulación de luteína presentó un rango
entre 69,8% y 76,9%. En la tabla se observa que la eficiencia de encapsulación es
mayor a mayores relaciones de (AGAO+LUT)/INU, debido que al utilizar una mayor
cantidad de agente encapsulante resulta una microcápsula con un mayor recubrimiento
y protección de la luteína, obteniéndose una mayor eficiencia de encapsulación, como
se explicó previamente para el sistema (AG+LUT)-INU.

Tabla 9: Eficiencia de encapsulación de luteína,

para el sistema (AGAO+LUT)-INU.

Relación Temperatura
% EE ± DS
(AGAO+LUT)-INU (ºC)
1:1 140 69,8 ± 4,30
1:1 160 73,5 ± 0,98
1:1 180 73,7 ± 0,68
1:2 140 72,2 ± 1,28
1:2 160 73,8 ± 0,14
1:2 160 72,5 ± 2,47
1:2 180 73,5 ± 2,26
1:3 140 76,6 ± 3,79
1:3 160 76,9 ± 2,64
1:3 180 76,9 ± 0,52
AGAO+LUT: aceite de girasol alto oleico con extracto de luteína
INU: inulina LUT: extracto de luteína EE: eficiencia de
encapsulación de luteína; DS: desviación estándar.

El análisis por Metodología de Superficie Respuesta para la eficiencia de

encapsulación (Anexo 6.7) indica que la forma lineal de las variables relación
(AGAO+LUT)/INU, la temperatura de aire de entrada al secador y la forma cuadrática
de la relación (AGAO+LUT)/INU, tuvieron un efecto significativo (p ≤ 0,05) sobre la
eficiencia de encapsulación de luteína. Contrariamente, no se encontró un efecto
significativo sobre la eficiencia de encapsulación para la forma cuadrática de la

33
temperatura de entrada al secador y la interacción entre la temperatura y la relación
(AGAO+LUT)/INU.

En la Figura 7 se presenta el gráfico de superficie respuesta para el sistema

(AGAO+LUT)-INU. Las variables relación (AGAO+LUT)/INU y temperatura en su forma
lineal y la relación (AGAO+LUT)-INU en su forma cuadrática varían positivamente
respecto a la eficiencia de encapsulación, de acuerdo con el gráfico de pareto. Las
condiciones óptimas para la microencapsulación de (AGAO+LUT), utilizando inulina
como agente encapsulante se obtuvieron para una relación 1:3 (15 g de encapsulante)
de (AGAO+LUT)-INU y 180ºC de temperatura de aire de entrada al secador.

Superf icie de Respuesta estimada

% E ficie n cia E n ca p su la ció n

78

76

74

72
3
2, 6
70 2, 2
1, 8
140 1, 4 Relac ión AGAO LUT : INU
150
160 170 1
180

Temperatura ºC

Figura 7: Gráfico de superficie respuesta estimada para la optimización de la eficiencia

de encapsulación del sistema (AGAO+LUT)-INU, con respecto a la temperatura del aire
de entrada al secador y la relación (AGAO+LUT)/INU.

En estudios de encapsulación de carotenos utilizando secado por atomización se

encontraron resultados variables de eficiencia de encapsulación de pigmentos
carotenoides dependiendo del agente encapsulante empleado. Así comparado con
esta tesis la encapsulación de licopeno mostró valores mayores de eficiencia de
encapsulación (94-96%) con goma arábiga y sacarosa (Larroza y Mercadante, 2007),

34
mientras que con gelatina y sacarosa se obtuvo rangos similares para este pigmento
(52,3-82,2%) (Shu y cols., 2006). Por otro lado también se encontraron para
microcápsulas de β-caroteno eficiencias de encapsulación de 97% en un co-polímero
de β y κ carragenato (Furcellaran) (Laos y cols., 2007), de 87% en almidón hidrolizado
(Wagner y Warthesen, 1995) y de un 62% en maltodextrina ED 25 (Desobry y cols.,
1997). La encapsulación de astaxantina con quitosano mostró eficiencia de
encapsulación de 92% (Higuera-Ciapara y cols., 2004). Estos resultados muestran que
la interacción entre luteína y agente encapsulante juegan un papel muy importante
para tener una alta eficiencia de encapsulación.

En la literatura consultada no se encontraron trabajos en los que se utilice inulina

como agente encapsulante de carotenos. Sin embargo, para microcápsulas de
betalaínas con inulina se encontró valores de eficiencia de encapsulación sobre un
92% (Saénz y cols., 2009). Poulain y cols. (2003), encapsuló (E,E)-
bis(amidinobenzylidene) cycloheptanone con inulina, obteniendo una eficiencia de
encapsulación entre un 60 y 65%.

3.6 Recuperación de luteína en la encapsulación de luteína en los sistemas

(AG+LUT)-INU y (AGAO+LUT)-INU.

En la Tabla 10 se muestra el contenido de luteína antes y después del secado por

atomización de las microcápsulas obtenidas bajo condiciones óptimas, así como
también el porcentaje de recuperación de luteína en el proceso.

Se obtuvo un porcentaje de recuperación de un 42,6 y 39,2% para el diseño

(AG+LUT)-INU y (AGAO+LUT)-INU, respectivamente. Estos valores indican que hubo
una perdida cercana al 60% de luteína en las microcápsulas durante el proceso de
secado para ambos diseños. Recuperaciones mayores obtuvieron Robert y cols.,
(2003) durante la encapsulación por secado spray de una oleorresina de Rosa

35
mosqueta usando como agente encapsulante almidón de papa, con valores de 71, 54 y
57% para β-caroteno, licopeno y rubixantina, respectivamente. Loksuwan (2007)
reportó recuperaciones de alrededor de un 82% para la encapsulación de β-caroteno
con almidón modificado de yuca. En otro estudio donde se evaluó el efecto del secado
sobre la recuperación de β-caroteno de la microalga (Dunaliella salina) se observaron
recuperaciones superiores de un 93% (Orset y cols., 1999) a las de esta tesis. Esta
diferencia se debería a que la encapsulación fue de alga, sin previa extracción del β-
caroteno.

El bajo porcentaje de recuperación obtenido en esta tesis se explica principalmente

por las condiciones de elaboración de las emulsiones y el proceso de secado. Los
pigmentos carotenoides son susceptibles a condiciones ambientales, debido a que son
moléculas altamente insaturadas (Rodriguez-Amaya, 2001). La exposición a oxígeno y
altas temperaturas de secado (140-180ºC) produciría oxidación e isomerización, con la
consecuente degradación de los carotenoides, aun considerando el bajo tiempo de
residencia en el secador. Otro factor de pérdida de luteína sería la formación de
espuma en la emulsión. La homogeneización a altas presiones de las emulsiones,
previo al secado por atomización ha mostrado un aumento de la eficiencia de
encapsulación porque disminuye el tamaño de gota. A medida que se aumenta la
presión de homogeneización, se incrementan las fuerzas de corte y la turbulencia o
cavitación producida durante la homogenización que permite una reducción en el
tamaño de gota (Tan y Nakajima, 2005).

36
 Tabla 10: Recuperación de luteína en las microcápsulas obtenidas bajo
condiciones óptimas después del secado por atomización.

Luteína antes Luteína después

Porcentaje de
del secado por del secado por
Diseño recuperación
atomización (μg atomización (μg
(X±DS)
luteína/g polvo) luteína/g polvo)

(AG+LUT)-INU 274,83 117,0 ± 5,0 42,6 ± 1,81a

(AGAO+LUT)-INU 239,35 93,9 ± 8,0 39,2 ± 3,33a
(AG+LUT)-INU: aceite de girasol con luteína encapsulado con inulina (AGAO+LUT)-INU: aceite
de girasol alto oleico con luteína encapsulado con inulina X: promedio DS: desviación estándar.
Letras diferentes indican diferencias significativas (p< 0,05) entre sistemas

No se observó diferencias significativas para el porcentaje de recuperación de

luteína (p>0,05) entre las microcápsulas de los sistemas (AG+LUT)-INU y
(AGAO+LUT)-INU, mostrando que no hay un efecto de la insaturación del aceite sobre
la recuperación de la luteína.

3.7 Caracterización de las microcápsulas obtenidas bajo condiciones óptimas.

En la Tabla 11 se observa el contenido de luteína superficial, total y eficiencia de

encapsulación para las microcápsulas obtenidas bajo condiciones óptimas. Para los
sistemas (AG+LUT)-INU y (AGAO+LUT)-INU, el contenido de luteína superficial fue de
30,2 ± 1,7 y 24,0 ± 2,5 µg luteína/g polvo, respectivamente; el contenido de luteína total
fue de 117,0 ± 5,0 y 93,9 ± 8,0 µg luteína/g polvo, respectivamente.

No se observó diferencias significativas para la luteína superficial, la luteína total y

la eficiencia de encapsulación de luteína (p>0,05) entre las microcápsulas de los
sistemas (AG+LUT)-INU y (AGAO+LUT)-INU, mostrando que no hay un efecto de la
insaturación del aceite sobre la eficiencia de encapsulación de luteína.

37
 Tabla 11: Contenido de luteína superficial, total y eficiencia de
encapsulación de luteína para las microcápsulas, obtenidas bajo
condiciones óptimas.

Luteína
Luteína total Eficiencia de
superficial exp.
Diseño exp. (μg encapsulación
(μg luteína/g
luteína/g polvo) (% X±DS)
polvo)
(AG+LUT)-INU 30,2 ± 1,7a 117,0 ± 5,0a 74,2 ± 0,4a
(AGAO+LUT)-INU 24,6 ± 2,5a 93,9 ± 8,0a 73,6 ± 5,0a

(AG+LUT)-INU: aceite de girasol con luteína encapsulado con inulina (AGAO+LUT)-INU: aceite de
girasol alto oleico con luteína encapsulado con inulina X: promedio DS: desviación estándar. Letras
diferentes indican diferencias significativas (p< 0,05) entre sistemas.

3.8 Contenido de humedad de las microcápsulas obtenidas bajo condiciones

óptimas.

En la Tabla 12 se señala el contenido de humedad de las microcápsulas obtenidas

bajo condiciones óptimas para los sistemas (AG+LUT)-INU y (AGAO+LUT)-INU, con
valores de 6,1% para ambos sistemas. Este contenido de humedad fue similar a los de
la literatura para microcápsulas de pulpa de tuna con inulina (5,12 %) Saénz y cols.
(2009) y mayor a los reportados por Robert y cols. (2003) para microcápsulas de
pigmentos carotenoides de rosa mosqueta con gelatina y almidón de papa (4,4 y 2,8%,
respectivamente)

De acuerdo a la literatura, la humedad final del polvo obtenido después del secado
por atomización depende principalmente de la relación temperatura de
entrada/temperatura de salida del secador y la velocidad de alimentación (Gharsallaoui
y cols., 2007).

38
 Tabla 12: Contenido de humedad en las
microcápsulas, obtenidas bajo
condiciones óptimas.

Contenido
Diseño de humedad
(% X±DS)

(AG+LUT)-INU 6,1 ± 0,01

(AGAO+LUT)-INU 6,1 ± 0,1

(AG+LUT)+INU: aceite de girasol con luteína

encapsulado con inulina, (AGAO+LUT)+INU: aceite
de girasol alto oleico con luteína encapsulado con
inulina X: promedio DS: desviación estándar.

3.9 Morfología de las microcápsulas obtenidas bajo condiciones óptimas.

En la Figura 8 (A, B, C y D) se muestran las microfotografías obtenidas mediante

microscopía electrónica de barrido (SEM) de las micropartículas obtenidas bajo
condiciones óptimas para los sistemas (AG+LUT)-INU (Fig 8 A, C) y (AGAO+LUT)-INU
(Fig 8 B, D). En ambos sistemas se observan micropartículas de forma y superficie
irregular, con tendencia a la aglomeración. Ronkart y cols. (2007) señaló que la
obtención de polvos de inulina por secado por atomización pueden ser amorfos o
cristalinos, dependiendo de la temperatura de la solución de alimentación. Además no
se observan diferencias en la morfología de las microcápsulas entre los sistemas
estudiados.

(A) (B)

39
 (C) (D)

Figura 8. Fotografías obtenidas mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) de

las microcápsulas obtenidas bajo condiciones óptimas: (A) (AG+LUT)-INU y (B)
(AGAO+LUT)-INU, amplitud x 45; (C) (AG+LUT)-INU y (D) (AGAO+LUT)-INU, amplitud
x 450.

(A) (B)

40
 CAPÍTULO IV

CONCLUSIONES

1.- El método de extracción de luteína desde pétalos de la flor de tagete (Tagete

erecta) con acetona y posterior saponificación presentó un rendimiento de luteína
mayor (9,98 ± 0,02 mg de luteína/g de pétalo) con respecto al método de extracción y
saponificación simultánea en hexano (4,01 ± 015 mg de luteína/g de pétalo).

2.- La adición de extracto de luteína obtenido de pétalos de la flor de tagete (Tagete

erecta), no varió la composición en ácidos grasos del aceite de girasol y aceite de
girasol alto oleico. Sin embargo, la composición en tocoferoles mostró un incremento
principalmente de alfa-tocoferol debido a su co-extracción durante la preparación del
extracto.

3.- El análisis de superficie respuesta para la encapsulación de luteína en los diseños

estudiados ((AG+LUT)-INU y (AGAO+LUT)-INU) mostró que las principales variables
independientes que influyen significativamente (p<0,05) sobre la eficiencia de
encapsulación de luteína fueron la temperatura de aire de entrada al secador y la
relación (AG o AGAO+LUT)/INU.

4.- Después del proceso de secado por atomización la recuperación de luteína en las
micropartículas fue de 42,57 y 39,23% para el diseño (AG+LUT)-INU y (AGAO+LUT)-
INU, respectivamente.

41
5.- El grado de insaturación de los aceites en estudio, (AG y AGAO) utilizados en la
preparación de oleorresinas de luteína, no fue significativo (p<0,05) sobre la eficiencia
de encapsulación de luteína, utilizando inulina como agente encapsulante.

42
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46
 ANEXOS

6.1 Determinación de carotenoides en los pétalos de flor de tagete (Tagete

erecta).

Los pétalos (1 g) se extrajeron con acetona fría, para lo cual se formó una pasta con
celite en un mortero. Esta pasta se filtró al vacío en un embudo Büchner y el filtrado se
recibió en una matraz de Kitasato, simultáneamente se agregó pequeños volúmenes
de acetona a la torta de filtrado hasta obtener una torta blanca.

Posteriormente, se realizó una partición del extracto de acetona a éter de petróleo.

En un embudo de decantación que contenía 50 mL de éter de petróleo y 50 mL de
agua destilada, se adicionó una porción del filtrado de pigmento, se dejó separar las
fases, se descartó la parte inferior (agua) y se repitió el proceso hasta que todo el
extracto de pigmento se transfirió a éter de petróleo, luego se lavó 4 veces con agua.

Se adicionó un igual volumen de hidróxido de potasio en metanol 10% p/v a la

solución de pigmentos y se mezcló, se cubrió el frasco con papel aluminio durante 12
hrs. a temperatura ambiente. A continuación se lavó la solución con agua destilada
para remover el álcali, se adicionó una pequeña porción de pigmentos cada vez al
embudo de decantación para evitar emulsificaciones. Cuando todo el pigmento está en
el embudo de decantación se lavó con agua, hasta que el agua de lavado no estuvo
alcalina.

La fase orgánica con la luteína se filtró por sulfato de sodio anhidro para eliminar el
agua remanente.

47
6.2 Curva de calibración de la luteína.

Para la confección de la curva de calibración se utilizó luteína extraída de los

pétalos de las flores de tagete (Tagete erecta), la cual fue aislada por cromatografía en
columna abierta, con fase MgO:celite (1:1), de acuerdo al método descrito por
Rodriguez-Amaya et al. (1976).

Tabla 13: Valores de concentración y

área para la confección de la curva de
calibración.

Concentración (μg/mL) Área

1 281930
5 1228869
10 2762197
15 4110414
22,4 6105210

7
Millones

3
Área

2 y = 27517x - 41148
R² = 0,999
1

0
0 5 10 15 20 25
Concentración (μg/mL)

Figura 9: Curva de calibración para luteína.

48
6.3 Composición en ácidos grasos

1.- Se pesan 100 mg del aceite.

2.- Agregar 5 mL de solución de NaOH 0,5 N

3.- Calentar por 5 minutos, luego enfriar.

4.- Agregar 5 mL de trifloruro de boro en metanol y calentar por 3 minutos.

5.- Enfriar y agregar NaCl saturado

6.- Agregar 1,5 mL de éter de petroleo y agitar suavemente.

7.- Agregar carbón activado a esta solución y retirar la fase hexano, filtrándola en
embudo con papel filtro y recolectándola en un tubo con tapa. Repetir este proceso 3
veces.

49
6.4 Efecto de la molienda de los pétalos de tagete (Tagete erecta) sobre la
cinética de extracción de luteína por el método de extracción y saponificación
simultáneos.

Tabla 14: Contenido de luteína obtenida de la cinética de extracción de los pétalos

secos sin moler y los pétalos secos molidos.

Contenido ± DS (mg luteína/g Contenido ± DS (mg luteína/g

Tiempo (min)
pétalos seco sin moler) pétalos secos molidos)
0 0,044 ± 0,013 0,711 ± 0,210
0,5 0,062 ± 0,026 1,015 ± 0,799
1 0,063 ± 0,022 1,466 ± 0,715
1,5 0,088 ± 0,037 1,650 ± 0,170
2 0,084 ± 0,028 1,977 ± 0,402
3 0,100 ± 0,016 2,430 ± 0,262
4 0,107 ± 0,008 2,497 ± 0,188
15 0,128 ± 0,016 3,260 ± 0,286
30 0,140 ± 0,004 2,813 ± 0,525
60 0,160 ± 0,012 3,480 ± 0,511
90 0,200 ± 0,022 3,440 ± 0,259
120 0,233 ± 0,029 3,300 ± 0,529
180 0,331 ± 0,075 3,113 ± 0,549
360 1,070 ± 0,415 3,612 ± 1,310
∞ 3,155 ± 1,478a 4,010 ± 0,156a
DS: Desviación estándar. Letras diferentes indican diferencias significativas (p< 0,05).

50
6.5 Cálculo del coeficiente de difusividad.

El modelo de difusión de extracción solido-liquido es derivado de la segunda ley de

Fick, (Crank 1975), que propone la presencia de dos procesos paralelos de difusión
dentro de los sólidos; uno rápido (D1) y uno lento (D2) en donde se considera la
transferencia de masa de las partículas de materia, el cual se describe por la siguiente
ecuación:

(1)

donde C y C∞ son las concentraciones del extracto en la solución en el tiempo t y en el

tiempo infinito, respectivamente. R es el radio de la partícula esférica y 6f1/π y 6f2/π es
la fracción del soluto, que se extraen con coeficientes de difusión D1 y D2,
respectivamente. En la figura 10 se ilustra la gráfica de la curva Ln[C∞/C∞-C] en función
del tiempo t en su parte lineal, que se obtiene de las etapas de inicio de la extracción,
con lo que se puede determinar D1 y f1. El parámetro D1 es obtenido de la pendiente y
el parámetro f1 del intercepto de la curva.

1,00
0,90
0,80
0,70
ln (C∞/C∞-C)

0,60
0,50
0,40
0,30 y = 0,0042x + 0,1761
0,20 R² = 0,994
0,10
0,00
0 50 100 150 200

Tiempo (seg)

Figura 10. Gráfica de Ln[C∞/C∞-C] en función del tiempo t en las

etapas de inicio de la extracción.

51
 Se obtuvo la pendiente K=4,2*10 -03 y el intercepto de la curva n=0,1761, con lo que
se obtuvo un valor de 2,66*10-07 cm2/seg para D1 y 0,1761 para f1.

En las etapas posteriores de la extracción, el segundo término de la ecuación D2, es

tan pequeño respecto a D1 que es despreciable.

52
6.6 Análisis de la varianza para eficiencia de encapsulación del diseño
experimental (AG+LUT)-INU
--------------------------------------------------------------------------------
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado medio F-Ratio P-Valor
--------------------------------------------------------------------------------
A:Temperatura 14,9689 1 14,9689 12,51 0,0241
B:Relación AG LUT : INU 54,2162 1 54,2162 45,30 0,0025
AA 0,290166 1 0,290166 0,24 0,6482
AB 0,097969 1 0,097969 0,08 0,7890
BB 6,66311 1 6,66311 5,57 0,0777
Error Total 4,7871 4 1,19677
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corr.) 80,7454 9

R-cuadrado = 94,0714 por ciento

R-cuadrado (ajustado para g.l.) = 86,6606 por ciento
Error Estándar de Est. = 1,09397
Error absoluto de la media = 0,580671
Estadístico Durbin-Watson = 2,90723 (P=0,1019)
Autocorrelación residual Lag 1 = -0,466646

Gráfico de Pareto estandarizado para Ef iencia Encapsulación

B:Relac ión AG LUT : INU +

-
A:Temperatura

BB

AA

AB

0 2 4 6 8

Ef ectos es tandarizados

53
6.7 Análisis de la varianza para eficiencia de encapsulación del diseño
experimental (AGAO+LUT)-INU
--------------------------------------------------------------------------------
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado medio F-Ratio P-Valor
--------------------------------------------------------------------------------
A:Temperatura 5,1245 1 5,1245 8,93 0,0404
B:Relación AGAO LUT : INU 29,9848 1 29,9848 52,24 0,0019
AA 1,15503 1 1,15503 2,01 0,2290
AB 3,19158 1 3,19158 5,56 0,0778
BB 6,58112 1 6,58112 11,47 0,0276
Error Total 2,2958 4 0,573949
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corr.) 47,6085 9

R-cuadrado = 95,1778 por ciento

R-cuadrado (ajustado para g.l.) = 89,15 por ciento
Error Estándar de Est. = 0,757594
Error absoluto de la media = 0,403633
Estadístico Durbin-Watson = 1,38868 (P=0,2568)
Autocorrelación residual Lag 1 = 0,199797

Gráfico de Pareto estandarizado para Ef iciencia Encapsulación

B:Relac ión AGAO LUT : INU +

-
BB

A:Temperatura

AB

AA

0 2 4 6 8

Ef ectos es tandarizados

54