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CAMPUS TIMÓTEO
Princípio de separação
As substâncias a serem analisadas podem percorrer uma distância em cima de um suporte que
contém a fase estacionária. Dependendo da sua natureza química, uma substância fica mais
aderida em cima da fase estacionária polar ou então é levada para frente por um solvente
apolar que representa a fase móvel. Em qualquer momento a substância se encontra em um
equilíbrio entre ser levada para frente e ficar retida. Portanto, quanto maior a distância que o
solvente percorre a fase estacionária, maior será a distância entre duas substâncias diferentes.
Essa dependência, no entanto, elimina-se pela determinação do valor Rf (ver p. 7).
Fases estacionarias
A fase estacionária é aplicada em camada fina (= camada delgada), em cima de um suporte
inerte (folha de alumínio, chapa de vidro, etc.). O material da camada delgada pode variar, mas
o mais usado hoje e mais universal é, sem dúvida, a sílica. Segue uma tabela que representa
estes materiais e suas aplicações típicas.
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Alumina OH OH Aminas, álcoois, lipídeos, esteroides,
O O O aflatoxinas, vitaminas, alcalóides
Al Al
O O OH
O
Sílica Me3Si Ácidos graxos, lipídeos, esteroides,
O O SiMe3
hidrofobizada Si hormôneos, vitaminas lipossolúveis,
carotenoides.
O
O Si
O
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Quase sempre se obtém uma melhor separação cromatográfica ao usar uma mistura de dois
ou três destes solventes. Misturas típicas são: n-hexano / acetato de etila ou petroléter /
acetato de etila / ácido acético. Através dos volumes relativos destes solventes pode-se ajustar
a polaridade e assim a altura dos valores Rf.
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Preparo da plaquinha
Primeiro, deve-se recortar com uma boa tesoura a chapa de camada delgada que geralmente
se vende no tamanho de 25 x 25 cm. A tesoura deve ser aplicada de tal forma que a beirada da
sílica tenha um corte limpo, evitando a soltura da camada branca do suporte de alumínio. Para
um cromatograma simples com 4 manchas recomenda-se recortar uma plaquinha nas medidas
de 4 cm de largura e 8 cm de altura.
Cerca de 1 cm da beirada inferior deve-se marcar uma linha paralela de largada. Usar um lápis
macio, para que a camada delgada não seja danificada. Em cima desta linha marcar os pontos
onde serão aplicadas as substâncias. Deve-se manter as seguintes distâncias:
A primeira e a última mancha devem ser colocadas cerca de 0,5 cm da beirada lateral
da plaquinha.
A distância entre duas manchas deve ser cerca de 0,7 cm.
Além disso, recomenda-se anotar na beirada superior da plaquinha uma sigla que permite sua
identificação e facilita sua referência no caderno de laboratório.
As manchas serão aplicadas, por meio de capilares finas. Geralmente, as capilares de ponto de
fusão /ponto de ebulição são adequadas. Caso tiver dificuldade em controlar a quantidade da
solução, deve-se esticar a capilar em cima do bico de Bunsen para deixa-la mais fina.
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Preparo da cuba de cromatografia.
Uma cuba especial de cromatografia TLC pode ser tranquilamente substituída por um copo de
conserva de boca larga, com tampa roscada. A tampa deve fechar bem, não garrar e não
mostrar sinais de desgaste e ferrugem. A dimensão ideal do copo será um diâmetro de cerca
de 7 cm e uma altura de cerca de 10 cm. O fundo do copo, quanto mais plano, mais fácil será a
colocação da plaquinha de TLC.
Recortar um quadrado de papel de filtro de tamanho que ocupe a altura da cuba e encoste em
2/3 da sua parede interna.
O transporte das substâncias ocorrerá por meio de solventes cujo poder de solubilização não
deve ser muito bom nem muito ruim, para as substâncias a serem analisadas. Quase sempre se
obtém um resultado melhor ao usar-se uma mistura de dois ou três solventes diferentes,
geralmente líquidos voláteis cujo grau de pureza não precisa ser muito alto. Despejar então a
mistura dos solventes da fase móvel na cuba, para que forme uma poça de cerca de 0,5 cm de
altura.
Esperar o tempo necessário até que a frente do solvente chegue até alguns milímetros abaixo
da beirada superior da plaquinha. Atenção: uma vez que o solvente atingir a beirada superior,
a análise de TLC se torna inconfiável (manchas alargadas; distorção dos valores R f) e deve ser
repetida com outra plaquinha! Com a plaquinha ainda dentro da cuba, marcar imediatamente
a frente com lápis macio. Depois tirar da cuba, tocar sua beirada inferior num papel toalha
para tirar excesso de solvente e deixar secar a plaquinha completamente, na posição
horizontal em cima de um papel toalha.
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Esquema das etapas operacionais da TLC.
Fontes de erros
Embora a TLC seja um método simples e robusto, há vários pontos que o analista deve
obedecer, para se obter um resultado reproduzível. Os seguintes cromatogramas não
produziram resultados confiáveis, pelos seguintes motivos:
a) Plaquinha não tinha posição vertical na cuba ou caiu para o lado direito.
b) A corrida foi feita em uma cuba cuja atmosfera não foi saturada com os vapores dos
solventes.
c) Ao recortar a plaquinha com tesoura, a camada delgada se soltou do suporte de
alumínio, especialmente ao lado direito.
d) No ponto de partida foi aplicada substância em excesso.
Também pode-se cometer erros na escolha da fase móvel. Os melhores resultados geralmente
obtêm-se quando utilizar uma mistura de solventes cuja polaridade fica um pouco abaixo da
das substâncias a serem separadas. Nos seguintes cromatogramas pode-se constatar sobre os
solventes:
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e) Solventes muito polares
f) Escolha boa, tanto das polaridades como da proporção dos solventes.
g) Solventes muito apolares.
Os valores Rf são, com essa definição, sempre valores entre 0 e 1 e, o mais importante, são
independentes da altura do cromatograma. Isso presume que a atmosfera dentro da cuba
estava completamente saturada, ao longo da corrida cromatográfica. Por outro lado, os
valores Rf podem ser afetados pelos seguintes fatores: temperatura, qualidade do adsorvente
(fase estacionária), qualidade da mistura de solventes, concentração da substância no ponto
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de partida, impurezas, entre outros. Sendo assim, podem-se observar variações de até 10% em
um fator de retenção.
Aplicações da TLC:
A TLC é um método analítico, barato, rápido e ao mesmo tempo bastante sensível, usado na
química orgânica preparativa, principalmente para:
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Substâncias fluorescentes (raras) se evidenciam debaixo da lâmpada de UV como manchas
brilhantes. Mais comum e até procedimento padrão é o comportamento oposto, descrito a
seguir:
A maioria das substâncias pode ser visualizada por meio de uma lâmpada UV. A maioria das
placas de TLC vendidas hoje tem, além de uma camada uniforme de sílica ou alumina, certos
pigmentos minerais que espalham fortemente a luz UV: Silicato de zinco dotado por manganês
ou sulfeto de bário. Estas substâncias se evidenciam por alto brilho na região visível, quando
iluminados por UV do tipo C, de 254 nm (lâmpada de mercúrio de baixa pressão). Ao mesmo
tempo eles não afetam o comportamento cromatográfico das substâncias analisadas, nem
reage com reagentes que se aplicam pelo borrifador.
Substâncias orgânicas UV-ativas que foram usadas antigamente, são regressivas, devido a
problemas da sua fixação na fase estacionária: morina ou fluoresceína. Sua vantagem: estes
não requerem da luz UV tipo C (perigo!), mas apenas do tipo A, para as quais se oferecem as
lâmpadas UV mais baratas que emitem em 366 nm.
A maioria das substâncias orgânicas mostram absorção, parcial até forte, desta radiação. Em
cima de uma plaquinha aditivada por pigmentos fluorescentes, essas substâncias se
evidenciam então sob a lâmpada UV por manchas escuras num fundo brilhante.
Substâncias incolores que não se evidenciam abaixo da lâmpada UV, podem ser visualizadas
por vapores de iodo ou então por meio de reagentes específicos, conforme descrito logo
abaixo e na tabela. O procedimento com I2 é bastante simples: expor o cromatograma a
alguns cristais de iodo em um recipiente bem fechado. Atenção: não permite o contato direto
dos cristais de I2 com a camada delgada! Um possível arranjo é um copo de conserva grande,
neste colocar alguns cristais de iodo e depois um béquer pequeno que serve como suporte
para a plaquinha. Algumas substâncias se evidenciam como manchas marrons; se isso falhar é
somente aumentar o tempo da exposição aos vapores, daí revelam-se manchas claras num
fundo marrom. Vapores de bromo igualmente servem como revelador das manchas.
Outro método geral é borrifar a plaquinha seca com solução 2% de AgNO3 em NH3 / EtOH
(solução de Tollens), em seguir aquecer a plaquinha a 100 °C por 2 a 5 minutos, até que
manchas pretas aparecem em cima de um fundo escuro.
As soluções descritas a seguir são específicas para certas classes de substâncias; são aplicadas
em forma de solução diluída, pelo borrifador. A imersão da plaquinha em uma solução do
reagente, por outro lado, não é procedimento geral, já que as manchas geralmente se tornam
difusas ou até desaparecem completamente. Ao aplicar o reagente vale a regra: menos é mais;
usar apenas tanto reagente que for preciso para localizar a mancha. Às vezes ajuda um leve
aquecimento da plaquinha (pode-se usar um secador de cabelo), após o tratamento com o
reagente.
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mL de H2SO4 e 20 mL de etanol; esquentar a
120 °C.
Aminas 4- 1 g de 4-dimetilaminobenzaldeído dissolver
dimetilaminobenzaldeído em mistura de 25 mL de HCl conc. e 75 mL de
/ HCl (Reagente de metanol.
Ehrlich)
Ninhidrina 0,3 g de ninhidrina em 100 mL de butanol e 3
mL de ácido acético glacial.
Aminas aromáticas Ácido sulfanílico Diazotamento da anilina com solução de 1%;
(anilinas) diazotado pós-tratamento com Na2CO3 de 1%.
Aminoácidos, ésteres, Ninhidrina. Ver acima.
amidas, andidridos
Hidroxilamina / cloret Solução I: dissolver 2 g de NH2OH.HCl em 5 mL
férrico de H2O e diluir com 15 mL de EtOH.
Solução II: dissolver 5 g de KOH em pouca
água e completar com EtOH até 50 mL.
Borrifar I: juntar solução I e II e filtrar. Usar
imediatamente.
Borrifar II: dissolver 1 g de FeCl3 em 2 mL de
HCl conc. e 20 mL de dietiléter.
Procedimento: Borrifar I e deixar secar à temp.
amb. Depois borrifar II.
Cetonas o-dianisidina Solução saturada de 4,4´-dimaino-3,3´-
dimetoxidifenil (= o-anisidina)em ác. Acético
glacial.
Metilcetonas, 2,4-difenilhidrazina Ver “Aldeídos”
compostos com –CH2-
ativado Nitroprussiato / NaOH Dissolver 1 g de nitroprussiato de sódio em
uma mistura de 50 mL de EtOH e 50 mL de
NaOH 2M.
Hidrocarbonetos H2SO4 conc. Borrifar e aquecer a 150 °C.
Vanilina / H2SO4
Compostos Reagente de Dragendorff Solução I: dissolver 0,085 g de BiOH(NO3) em
nitrogenados uma mistura de 1 mL de AcOH e 4 mL de H2O.
Solução II: 2 g de KI em 5 mL de H2O.
Borrifar: 1 mL da solução I, depois 1 mL da
solução II em mistura de 4 mL de AcOH e 20
mL de H2O.
Insaturados e Permanganato Solução 0,5% de KMnO4 em 1 M NaOH ou
compostos redutores então
Solução 0,5% de KMnO4 em água.
Borrifar com solução 10% em EtOH e aquecer
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Ác. fosfomolíbdico a 120 °C até o desenvolvimento da mancha.
H3[PMo12O40]·28H2O
Açúcares Anisaldeído (= p- Dissolver 0,5 g de anisaldeído em 50 mL de
metoxibenzaldeído) AcOH e 1 mL de H2SO4, aquecer a 100 °C.
Para a detecção das substâncias recomenda-se primeiro usar a lâmpada UV. Marcar as
manchas com lápis. Somente depois aplicar reagente específico pelo borrifador. Neste caso
usar uma solução aquosa de hexacianoferrato(III) de potássio e cloreto férrico, K3[Fe(CN)6] e
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FeCl3, respectivamente, sob a qual o ácido acetilsalicílico forma uma mancha na tonalidade
marrom-cinza-violeta, enquanto a 4-hidroxiacetanilida fica azulada.
Literatura:
TLC e outras técnicas cromatográficas: Ana Luiza G. Degani, Quezia B. Cass, Paulo C. Vieira,
Cromatografia – um breve ensaio, Química Nova na Escola 7 (1998) 21-25.
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