INSTITUTO POLITÉCNICO

NACIONAL

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología

LABORATORIO DE BIOCONVERSIONES
Práctica 4: Determinación de las constantes cinética de la
invertasa libre

Participantes:
 Alcalá Arellano Luis Ángel
 Jiménez Espitia Jonatán Obed
 Rabago González Néstor
 Sánchez Olvera Gerardo Ulises
 Suarez Izquierdo Cinthia Mónica

Ciudad de México, 26 de septiembre de 2018.

1
Índice

Introducción....................................................................................................................................... 3
Cinética enzimática ....................................................................................................................... 3
Objetivos ............................................................................................................................................ 4
General:.......................................................................................................................................... 4
Específicos:..................................................................................................................................... 4
Metodología ....................................................................................................................................... 4
Determinación de las velocidades enzimáticas a diferentes concentraciones de sustrato. ...... 4
Resultados .......................................................................................................................................... 4
Discusión ............................................................................................................................................ 9
Conclusiones ...................................................................................................................................... 9
Referencias ....................................................................................................................................... 10

2
Introducción
Cinética enzimática
La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos
estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y
de la especificidad del enzima.
La velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad,
ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima. La medida se realiza
siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc., y se
utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de
reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien
midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos.
Al seguir la velocidad de aparición de producto (o de desaparición del sustrato) en función
del tiempo se obtiene la llamada curva de progreso de la reacción, o simplemente, la cinética
de la reacción. A medida que la reacción transcurre, la velocidad de acumulación del
producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reacción. Para evitar
esta complicación se procede a medir la velocidad inicial de la reacción (v0). La velocidad
inicial de la reacción es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero. De esta
forma, la medida de v0 se realiza antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, de
forma que pueda considerarse la [S] como esencialmente constante a lo largo del
experimento. Además, en estas condiciones no es necesario considerar la reacción inversa,
ya que la cantidad de producto formada es tan pequeña que la reacción inversa apenas ocurre.
De esta forma se simplifican enormemente las ecuaciones de velocidad.
Para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto de la concentración inicial de sustrato
sobre la velocidad inicial de la reacción, manteniendo la cantidad de enzima constante. Si
representamos v0 frente a [S]0 obtenemos una gráfica como la de la Figura. Cuando [S]0 es
pequeña, la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentración de sustrato, y,
por tanto, la reacción es de primer orden. A elevadas [S]0, el enzima se encuentra saturada
por el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S]0. En este punto, la reacción es de orden
cero y la velocidad es máxima (Vmax).

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Objetivos
General:
 Determinar por diferentes modelos las constantes cinéticas de la invertasa
Específicos:
 Obtener las constantes cinéticas, Km y Vmax de la invertasa.
 Determinar el efecto de la concentración del sustrato en la velocidad de las reacciones
enzimáticas.
 Determinar las velocidades iniciales de una reacción enzimática.

Metodología
Determinación de las velocidades enzimáticas a diferentes concentraciones de sustrato.
Se preparó un baño maría en ebullición y un baño de hielo, dos microtubos con 0.95 ml de
sacarosa a la concentración de 9 g/l en el regulador de acetatos. También seis microtubos de
1.5 ml con 0.1 ml de DNA.
Como blanco y testigo, se preparó una serie de microtubos de 1.5 ml con 0.1 ml de DNS y
0.1 ml de la solución de sacarosa a 9 g/l.
Posteriormente, se adicionó 0.05 ml de la solución de invertasa a 0.3 mg/ml en regulador de
acetatos a uno de los dos microtubos que contenía los 0.95 ml de sacarosa. Se siguió tomando
muestras de 0.1 ml de la mezcla de reacción a los tiempos de 0.1, 1.5, 2 y 2.5 minutos y se
transfirió cada muestra a un microtubo de 1.5 ml con 0.1 de DNS. Y se repitió el proceso del
tiempo cero, con sus respectivos tiempos con el microtubo restante que contenía los 0.95 ml
de sacarosa a la concentración que se ensayó y por cada concentración de sacarosa de 3, 9,
15, 30, 60 y 120 g/l.
Una vez que se terminó la cinética enzimática, se trataron los microtubos de las muestras con
el blanco con la técnica de azucares reductores.
Se interpolaron las absorbancias para calcular la concentración de glucosa y fructosa.

Resultados
Se obtuvieron las velocidades iniciales (Vo) con la pendiente de las rectas obtenidas al
graficar la concentración de sustrato consumido (g/L) en función del tiempo a las diferentes
concentraciones de sustrato (fig. 1)

4
 8

7 y = 2.7806x - 0.1675
R² = 0.9816
6
Sustrato consumido (g/L)

5 3 g/L
9 g/L
4
15 g/L
3 y = 1.3763x + 0.0829 30 g/L
R² = 0.972 y = 1.2432x + 0.031
2 R² = 0.9987 60 g/L
y = 1.0825x + 0.0226
R² = 0.9864 120 g/L
1 y = 0.8424x + 0.1119
R² = 0.9514
0 y = 0.3556x + 0.0245
0 R²0.5
= 0.9461 1 1.5 2 2.5 3
-1
Tiempo (min)

Figura 1. Cantidad de sacarosa consumida (g/L) con respecto del tiempo a distintas concentraciones de sustrato añadidas

Así pues, se graficaron los valores obtenidos de velocidad inicial con respecto de la
concentración de sustrato (tabla 1) y se obtuvo un comportamiento descrito por la cinética de
Michaelis-Menten (fig. 2), del cual se obtuvieron la velocidad máxima de reacción
(Vmax=1.4g/L*min), la constante de afinidad de la invertasa con el sustrato (Km= 9.5g/L) y
el número de recambio (Kcat=185.397s-1)

Tabla 1. Velocidades iniciales de reacción (g/L min) a diferentes concentraciones de sustrato (g/L)

Sustrato (g/L) V0 (g/L min)

0 0
3 0.3556
9 0.8424
15 1.0825
30 1.3763
60 2.7806
120 1.2432

5
 Vmax

Km

Figura 2 Velocidad de reacción inicial (V0) (g/L*min) en función de la concentración de sustrato (g/L)

En seguida, se obtuvo el gráfico de Lineweaver-Burk (fig. 3) con los inversos de la

concentración de sustrato y velocidad inicial (tabla 2), del cual se obtuvieron la velocidad
máxima de reacción (Vmax=2.19 g/Lmin), la constante de afinidad de la invertasa con el
sustrato (Km=15.45g/L) y el número de recambio (Kcat=290s-1).
Tabla 2. Inverso de velocidad inicial (L*min/g) y concentración de sustrato (L/g).

1/[S] 1/Vo
(L/g) (L*min/g)
0.3333 2.8121
0.1111 1.1871
0.0667 0.9238
0.0333 0.7266
0.0167 0.3596
0.0083 0.8044

6
 3.00
y = 7.0321x + 0.4553
2.50 R² = 0.9985

1/Vo 2.00

1.50

1.00

0.50

0.00
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35
1/[S]

Figura 3. Gráfico de Lineweaver-Burk; Inverso de la velocidad inicial con respecto del inverso de la concentración de
sustrato

Posteriormente se realizó el gráfico de Hanes–Woolf (fig. 4), cuya gráfica corresponde a la

concentración de sustrato dividida por la velocidad inicial con respecto de la concentración
de sustrato (tabla 3). obteniendo así, la velocidad máxima de reacción (Vmax=1.99 g/L min),
la constante de afinidad de la invertasa con el sustrato (Km=12.95g/L) y el número de
recambio (Kcat=262.68s-1).
Tabla 3. Concentración de sustrato dividida por la velocidad inicial (min) y concentración de sustrato (g/L)

[S] [S]/Vo
(g/L) (min)
3 8.4364
9 10.6838
15 13.8568
30 21.7976
60 21.5781
120 96.5251

7
 25

20

y = 0.5033x + 6.5216
[S]/Vo 15 R² = 0.9963

10

0
0 5 10 15 20 25 30
[S]

Figura 4. Gráfico de Hanes-Woolf; Concentración de sustrato dividida por la velocidad inicial en función de la concentración
de sustrato

Finalmente, se realizó el gráfico de Eadie-Hofstee (fig. 5), correspondiente a la velocidad

inicial de reacción con respecto de la velocidad inicial de reacción dividida por concentración
de sustrato (tabla 4), del cual se obtuvieron la velocidad máxima de reacción
(Vmax=2.06g/L*min), la constante de afinidad de la invertasa con el sustrato (Km=13.79g/L)
y el número de recambio (Kcat=271.47s-1).
Tabla 4. Velocidad inicial de reacción (g/L min), reciproco entre velocidad inicial de reacción y concentración de sustrato
(min)

Vo Vo/[S]
(g/L min) (min)
0.3556 0.1185
0.8424 0.0936
1.0825 0.0722
1.3763 0.0459
2.7806 0.0463
1.2432 0.0104

8
 1.6

1.4

1.2
y = -13.795x + 2.0529
1 R² = 0.9769
Vo
0.8

0.6

0.4

0.2

0
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14
Vo/[S]

Figura 5. Relación correspondiente a la velocidad inicial de reacción con respecto al reciproco entre velocidad inicial de
reacción y concentración de sustrato

Discusión
Con base en los parámetros cinéticos obtenidos en cada método, se eligieron los valores
obtenidos por la linealización de Lineweaver-Burk por tener la mayor correlación (𝑅 2 =
0.9985); así pues, se determinó que Km y Vmax son, 15.45g/L y 2.06g/L*min,
respectivamente. Por otro lado, en otros experimentos, se ha determinado que Km y Vmax
de la invertasa de Saccharomyces pastorianus a pH 5 y 47.5°C fueron 12.996g/L y
0.975g/L*min (Toda & Shoda, 1975), con valores similares a los obtenidos, comparando, ya
que existe un gran parecido entre Saccharomyces pastorianus y Saccharomyces cerevisiae
(Tamai, Momma, Yoshimoto, & Kaneko, 1998).

Conclusiones
 Se obtuvieron por 3 métodos de linealización los parámetros cinéticos; la mejor
correlación se obtuvo por el método de Lineweaver-Burke con Km=15.45 g/L y
Vmax=2.19 g/Lmin.

 La velocidad de reacción aumenta proporcionalmente con la concentración de

sustrato hasta un punto de saturación (Vmax).

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Referencias
Tamai, Y., Momma, T., Yoshimoto, H., & Kaneko, Y. (1998). Co-existence of two types of
chromosome in the bottom fermenting yeast, Saccharomyces pastorianus. Yeast,
14(10), 923–933. https://doi.org/10.1002/(SICI)1097-0061(199807)14:10<923::AID-
YEA298>3.0.CO;2-I

Toda, K., & Shoda, M. (1975). Sucrose inversion by immobilized yeast cells in a complete
mixing reactor. Biotechnology and Bioengineering, 17(4), 481–497.
https://doi.org/10.1002/bit.260170403

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