Guia de Practicas de Operaciones Unitarias II-completa

UNIVERSIDAD CATÓLICA DE SANTA MARÍA
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS

BIOQUIMICAS Y BIOTECNOLOGICAS
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA

BIOTECNOLÓGICA
GUIA DE PRACTICAS DE OPERACIONES

UNITARIAS II
2018
Ing. Cinthia Córdova Barrios

Ing. Pamela Manrique Pino
Ing. Keny Alvarado Quiroz
U.C.S.M. E.P. Ing. Biotecnológica VI - VIII Semestre
Prácticas de Operaciones Unitarias II
El término “biotecnología” es relativamente nuevo, sin embargo, la

biotecnología está presente en la vida cotidiana, siendo una actividad
antigua, que comenzó hace miles de años cuando el hombre descubrió la
obtención del pan, queso, vino, cerveza y yogurt por fermentación.
Por tanto, consideremos que la Biotecnología es la utilización de organismos

vivos como bacterias, hongos, plantas o animales, parte de ellos o los
productos de su metabolismo para la obte nción de un bien o servicio útil
para el hombre.
Al comprender mucho más cómo ocurren los procesos biológicos que

permiten la obtención de productos biotecnológicos, se han desarrollado
nuevas técnicas a fin de modificar o imitar algunos de esos procesos y lograr
una variedad mucho más amplia de productos, estos conocimientos, dieron
lugar al desarrollo de la biotecnología moderna, que utiliza técnicas de
ingeniería genética, para modificar y transferir genes de un organismo a
otro.
La Ingeniería Biotecnológica con su gran avance científico tecnológico,

actualmente está liderando el desarrollo socioeconómico, ya que conjuga los
principios básicos, técnicos y científicos de las ciencias físicas, químicas y
biológicas con la ingeniería, para la obtención de un bien o servicio útil para
mejorar la calidad de vida del ser humano.
Dentro de la industria biotecnológica, el bioproceso es una parte esencial

que utiliza sistemas biológicos para generar un producto de importancia
económica como proteínas, enzimas, ácidos orgánicos, polisacáridos,
vitaminas, biocombustibles y minerales; c on aplicación en la industria
farmacéutica, alimentaria, textil, papelera, de la biominería, de los
detergentes y en la generación de energía.
Esta asignatura pertenece al área de f ormación especializada, de naturaleza

teórico-práctica y que pretende explicar los principios básicos y
fundamentos de las operaciones unitarias que se llevan a cabo en los
procesos de recuperación, concentración, purificación y formulación de
productos biotecnológicos. La comprensión de dicho estudio, le permitirá
realizar el diseño y la configuración óptima de los bioprocesos implicados en
la obtención de productos de importancia económica con aplicación en la
Biotecnología ambiental, médica, animal, ind ustrial y vegetal.
SEGURIDAD EN EL LABORATORIO
El trabajo en el laboratorio por sus propias características, presenta una serie de riegos
de origen y consecuencias variadas, los cuales pueden estar relaciones con la
manipulación de reactivos, materiales y equipos (CSIC, 2007).
La manera más eficiente de poder trabajar con sustancias químicas y biológicas, es

aquella en la que se reduzca o minimice la probabilidad de que suceda un accidente o
exposiciones a compuestos (Sociedad Americana de Química, 2002). Para poder
reducir la probabilidad de accidentes deben tener en cuenta lo siguiente:
• Practicar el hábito de la prevención de accidentes (Infórmate sobre la peligrosidad

de las sustancias a utilizar).
• Utilizar equipo de protección personal (Ej.: mandil, guantes, barbijos, etc.) todo el
tiempo que se esté en el laboratorio.
• Si vas a hacer experimentos en lo posible utilizar la menor cantidad de reactivo.
• Si es posible sustituir un reactivo que representa mucho riesgo por otro de menor
riesgo, hazlo.
• Analizar siempre tu entorno de trabajo e identificar los posibles actos inseguros en
el laboratorio.
Al trabajar en un laboratorio, existe el peligro potencial de poder sufrir un accidente

durante el manejo de las sustancias y de los materiales que se utilizan, los cuales en
un porcentaje alto son producidos por los errores humanos (Figura 1.).
SUSTANCIA ERROR
ACCIDENTES
PELIGROSA HUMANO
Figura 1. Factor que produce un accidente en el laboratorio.

Fuente: Elaboración Propia
Es importante generar los lineamientos de seguridad para el trabajo en el laboratorio,

conociendo las precauciones y medidas generales que debemos conocer para el
adecuado trabajo al realizar nuestros experimentos.
“Realizar los procedimientos con seguridad no es solamente la manera correcta de

trabajar, es la única manera de hacerlo”. (Sociedad Americana de Química, 2002)
Por consiguiente, cuando se trabaja en el laboratorio, se debe tener presente una serie
de reglas o consejos que disminuyen y en algunos casos logran evitar los accidentes.
REGLAS Y CONSEJOS PARA EVITAR ACCIDENTES
PAUTAS EN EL TRABAJO DE LABORATORIO
ORDEN
El área de trabajo siempre debe estar limpia y con los materiales ordenados.
VENTILACIÓN
Conviene trabajar siempre en un lugar bien ventilado.
VESTIMENTA
Es necesario el uso de una vestimenta protectora adecuada.
ESTUDIE CADA EXPERIENCIA ANTES DE CLASE

Ahorrará tiempo y evitará errores y accidentes innecesarios. Siga todas las
indicaciones que le han sido designadas con seriedad.
NUNCA COMER, BEBER O FUMAR

Ni apoyar comida sobre la mesa del laboratorio.
NO INTERFERIR EL PASO
No se debe permitir el almacenamiento o disposición momentánea de elementos que
interfieran los corredores del laboratorio.
REGISTRAR LOS INCIDENTES

Comunicar inmediatamente para evitar accidentes posteriores
TRABAJANDO CON PRODUCTOS QUIMICOS
ROTULAR
Etiquetar cualquier recipiente que sea llenado.
CALENTAR UN LÍQUIDO EN UN TUBO DE ENSAYO

No mirar al interior del tubo durante el calentamiento y siempre mantenga este lejos
de los demás.
NUNCA ASPIRE A TRAVES DE UNA PIPETA CON LA BOCA

Para llenar la pipeta use una propipeta o perilla.
USO DE BURETA
Llenar la bureta a una altura en la cual pueda observarse sin dificultad.
OLOR DE LAS SUSTANCIAS GASEOSAS

Solo si fuera necesario, para percibirlo mueva lentamente la mano y aspire con
precaución, evitando el contacto directo.
LIQUIDOS VOLÁTILES
Los experimentos que producen gases deben ser realizados en una campana de
extracción.
LIQUIDOS INFLAMABLES
Mantener lejos de una fuente de encendido o llama abierta. Para calentarlo trabaje con
un baño de agua, aceite o vapor.
RECIPIENTES CON GRANDES VOLÚMENES DE SUSTANCIAS

No deben ser guardados en compartimientos ubicados en una altura superior a la
altura propia del personal del laboratorio.
TAPONES Y NEXOS DE GOMA EN MATERIAL QUEBRADIZO
Nunca fuerce dentro o fuera los nexos de goma de material que se pueda quebrar. La
glicerina o el detergente facilitan dicha tarea.
ARMADO DE EQUIPOS
Usar soportes que se apoyen bien en la mesa.
Vigilar continuamente los aparatos con centro de gravedad alto.
RESIDUOS QUIMICOS
Informarse sobre la forma adecuada de desechar los restos y residuos químicos.
LIMPIEZA DEL MATERIAL AL FINALIZAR EL TRABAJO

A fin de evitar contaminaciones y/o reacciones no deseadas en posteriores
experimentos.
PRIMEROS AUXILIOS
Contar con un adecuado equipo para primeros auxilios y conocer los pasos a seguir en
cada caso luego de un accidente.
PROTECCION
Vestimenta protectora
Mandil:
Absolutamente necesario.
Lentes de seguridad (goggles o safety glasses):

Lo recomendable es usar lentes de seguridad (goggles o safety glasses) y esto es
obligatorio cuando se lleven a cabo operaciones de laboratorio de alto riesgo, como por
ejemplo: destilaciones al vacío, destilación de grandes cantidades de líquidos
inflamables y experimentos que requieran gran cantidad de sodio metálico.
Calzado:
Debe poseer suela sólida y firme que asegure completa y totalmente el pie.
Guantes:
Deben utilizarse cuando se trabaja con químicos ácidos. Es importante tener en cuenta
si el material de los guantes es el apropiado para los químicos con los cuales se esté
trabajando, ya que algunos químicos pueden penetrar los guantes estándares con
mucha facilidad.
PRIMEROS AUXILIOS EN EL LABORATORIO
Quemaduras
Cualquiera que sea la causa de una quemadura, como por ejemplo con fuego, metal
caliente, líquidos calientes, ácidos, álcalis caústicos, etc. se debe:
1. Remover cualquier residuo de ropa empapado con ácido o álcali.

2. Lavar con agua helada completamente y de manera profusa el área quemada
por al menos 10 minutos.
3. Secar suavemente con un manta seca ó usar algodón.
4. Si es posible, cubrir el área afectada con gasa estéril.
5. Transferir inmediatamente al paciente al hospital y que el médico proporcione el
tratamiento más adecuado.
Casos especiales
Quemaduras con bromo: Cuando haya experimentos que involucren el uso de bromo
líquido se recomienda tener éter petróleo (80º-100º C) a la mano. Si el bromo salpica
a las manos, lavar el área afectada con el éter de petróleo y procure remover tanto
bromo como sea posible. Subsecuentemente, la piel, que ha estado en contacto con el
éter de petróleo, se vuelve suave y se puede sentir algo de picazón, se puede remover
una pequeña película de grasa y luego se puede aplicar aceite de oliva.
Quemaduras con sodio: Esto es frecuentemente causado por pequeñas lentejuelas

de sodio o de hidróxido de sodio. Remover con una pinza tanto sodio sea posible
usando unas pinzas, lavar bien con agua helada, luego añadir ácido acético al 1% y
finalmente cubrir con gasa empapada con aceite de oliva.
Quemaduras por fósforo: Lavar bien la zona afectada con agua helada y luego
empapar con solución de AgNO3 al 1%. Si la quemadura es seria, lavar nuevamente.
Accidentes en los ojos:
Cualquiera que sea el líquido (ácido o álcali) que haya penetrado a los ojos, lavar
inmediatamente de manera profusa y continuar con agua helada durante al menos 10
minutos, además debe limpiar las cejas y piel alrededor de los ojos, para asegurar que
el producto químico ha sido retirado, luego acuda inmediatamente a un oftalmólogo.
Si trozos de vidrio han penetrado, por ningún motivo se debe intentar remover los
trozos de vidrio, pues esto debe ser directamente hecho por el correspondiente médico
especialista. El daño puede ser peor si una persona sin la necesaria práctica lo hace.
Cortes
La mayoría de cortes en el laboratorio son causados por vidrio de laboratorio,

operaciones cuando se trata de abrir frascos que tienen su tapa demasiada ajustada,
o por tubos de ensayo u otro material de vidrio que se quiebra durante un
experimentos. Todos estos accidentes pueden evitarse si se trabaja con cuidado y
sobre todo si se aplica el sentido común.
Cuando ocurra un corte lo primero que se debe hacer es enjuagar la herida con
bastante agua, luego limpiarla con una solución antiséptica, secando la herida y los
alrededores de la parte afectada, para luego cubrirla con una curita esterilizada.
Venenos
Venenos líquidos y sólidos
1. Si se queda en la boca y no se ha tragado, escupirlo inmediatamente y lavar la

boca de manera repetida con agua.
2. Si se tragó, cualquiera que fuera la sustancia (ácido, álcali, arsénico o
compuestos mercuriales) diluirlo ingiriendo por lo menos 500 mL de leche o
agua.
3. No se debe hacer algún intento para que el paciente vomite, especialmente si
se ha ingerido álcalis o ácidos.
4. Luego solicitar atención médica urgente
Antes de usar cualquier producto químico, es importante informarse acerca de los
posibles peligros en su uso. Además del nombre y el símbolo de peligro que se
encuentra en la etiqueta del envase, también se puede encontrar información útil
sobre los riesgos específicos del producto, así como las precauciones a seguir en la
sección de guías de riesgos o guías R y guías de seguridad o guías S
Además, es importante consultar la ficha técnica de los productos químicos, las cuales
son de carácter obligatorio en todos aquellos laboratorios que se trabajan bajo las
normas de Buenas Prácticas de Laboratorio (Good Laboratory Practices, GLP). Estas
fichas se denominan usualmente Material Safety Data Sheet, MSDS o SDS, (Hoja
de Datos de Seguridad del material).
Las MSDS o SDS especifican los cuidados que se debe de tener, como por ejemplo
niveles de toxicidad, incompatibilidades, etc.
Las SDS pueden ser conseguidas a través de cualquier buscador en Internet.
PRACTICA Nº 1.
AISLAMIENTO Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES
1. OBJETIVOS:
1.1. Preparar el medio de cultivo 9K líquido y sólido.

1.2. Aislar microorganismos biolixiviantes en medio de cultivo 9K a partir de su
ambiente nativo.
1.3. Mantener el desarrollo de la biomasa en las condiciones de incubación.
1.4. Inculcar en el proceso enseñanza-aprendizaje valores de puntualidad,
responsabilidad, cooperación y perseverancia.
2. MARCO TEÓRICO:
La observación de las transformaciones naturales que sufrían diversos compuestos

de hierro y azufre, procedentes de la disolución de ciertos minerales, hizo que desde
principios del siglo XX se viniera postulando la presencia de microorganismos
quimiolitótrofos en ciertas aguas. Sin embargo, no se logró aislar un tipo de
bacterias del genero Acidithiobacillus de las aguas de drenaje de unas minas de
carbón bituminoso, ni se pudo dar una explicación clara de estos fenómenos, hasta
mediados del siglo XX.
En 1951, Temple y Colmer, comprobaron que una de estas bacterias era

responsable de la rápida oxidación del hierro ferroso y, en consecuencia, de la
acidez de estas aguas por la hidrólisis del ión férrico producido. La denominaron
Thiobacillus ferrooxidans, ya que presenta diferencias fisiológicas y morfológicas
respecto a otras bacterias de este mismo género. Esta bacteria ha sido aislada,
posteriormente, por numerosos investigadores, observándose una amplia
distribución en microambientes de naturaleza ácida, con la presencia de ión ferroso
o sulfuros metálicos, ricos en metales, convirtiéndose en una buena opción para su
lixiviación.
La lixiviación bacteriana, también conocida como Biolixiviación puede ser definida

como un proceso natural de disolución que resulta de la acción de un grupo de
bacterias específicas para lixiviar, o extraer, metales o concentrados minerales
presentes en las minas. El producto final de la biolixiviación es una solución ácida
que contiene el metal en su forma soluble.
La lixiviación bacteriana es un excelente ejemplo de cómo la actividad biológica
controlada puede servir al hombre en la explotación de los recursos naturales sin el
uso intensivo de energía.
Desde la década del 50, en que se descubrió que los responsables de la acidificación
de aguas de minas eran microorganismos, hasta hoy se ha avanzado mucho en el
entendimiento de los mecanismos a través de los cuales se llevan a cabo la
solubilización de las especies metálicas, y en la aplicación de estos principios en
desarrollos tecnológicos.
En la Industria minera se hace frecuente la búsqueda de métodos menos

contaminantes en la extracción de metales, ya que se ha visto que los métodos
convencionales generan alto costo en lo económico y ambiental, debido a la
utilización de procesos químicos que producen alto índice de contaminación.
Dependiendo de la composición del mineral sulfurado, la lixiviación bacteriana es
una alternativa biológica ventajosa a las tecnologías pirometalúrgicas por demandar
menores inversiones de capital y tener menores costos de operación. Por otra parte
la no emisión de SO2 la convierten en una tecnología más limpia, cuestión no menor
frente a la creciente preocupación pública por los efectos ambientales de
operaciones industriales. Esta tecnología permite además el beneficio de minerales
marginales y la exploración de botadores que en muchos casos constituyen hoy
pasivos ambientales, y al ser una tecnología de fácil aplicación es atractiva para ser
empleada en países en vías de desarrollo.
Desde el aislamiento de la primera cepa de Acidithiobacillus ferrooxidans han sido

muchos los medios propuestos para el cultivo de este microorganismo, siendo los
medios más conocidos como 9K y T&K, los que mejores resultados muestran en el
crecimiento microbiano. En cuanto al cultivo de Acidithiobacillus ferrooxidans en
medio sólido es fundamental para la purificación del mismo, para los estudios
genéticos, así como la estimación del tamaño de la población mediante el recuento
de microorganismos viables.
Las bacterias de este género se caracterizan por ser quimiolitoautótrofas, mesófilas

y acidófilas.
Entre los parámetros básicos que influyen sobre el comportamiento del
microorganismo, cabe destacar, el pH, temperatura, oxígeno y dióxido de carbono.
Sin embargo, se pueden producir efectos sinérgicos para el crecimiento de dichos
microorganismos.
3. MATERIALES:
3.1. Muestras:
Drenaje ácido de roca.
Drenaje ácido de mina.
Mineral.
Relaves.
3.2. Reactivos:
Agarosa.
Cloruro de potasio, KCl.
Fosfato ácido de potasio, K2HPO4.
Nitrato de calcio, Ca(NO3)2.
Sol. Ácido sulfúrico 5N (H2SO4).
Sol. Etanol 70%.
Sulfato de amonio, (NH4)2SO4.
Sulfato de magnesio heptahidratado, MgSO4.7H2O.
Sulfato ferroso heptahidratado, FeSO4.7H2O.
3.3. Material de vidrio:

Baguetas.
Balones, 500 mL.
Beakers, 250 y 400 mL.
Fiolas, 100, 250 y 500 mL.
Matraces, 250 mL.
Placas petri.
Probetas, 100 mL.
Pipetas, 10 mL.
Pipetas Pasteur.
3.4. Otros:
Cinta universal de pH.
Espátula.
Filtro millipore whatman (0,2 um)
Jeringa, 20 mL.
Mecheros.
Micropipeta, p20.
Parafilm.
Piceta.
Plastic wrap.
Tijeras.
Tips.
Tubos de centrifuga.
3.5. Aparatos:
Autoclave.
Balanza analítica.
Centrífuga.
Cocina eléctrica.
Potenciómetro.
Shaker.
Ultrasonido.
4. METODOLOGÍA:
4.1. Toma de muestra:

Se ubicó geográficamente el lugar donde se tomaron las muestras con un GPS
(Sistema de posición geográfica) en las siguientes coordenadas.
Se realizó la caracterización morfológica de la muestra.
4.2. Preparación del medio 9K líquido y sólido:
El medio 9K se preparó según la formulación propuesta por Silverman y
Lundgren (1959).
4.4. Aislamiento de microorganismos biolixiviantes:

Se inoculo la muestra en medio 9K líquido y sólido. Se mantuvo las
condiciones de incubación establecidas.
5. PROCEDIMIENTO DETALLADO:
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN:
7. CONCLUSIONES:
8. SUGERENCIAS:
9. CUESTIONARIO:
¿Qué estrategias se utiliza para preparar o procesar la muestra?

¿Qué métodos se utilizan para la determinación de la oxidación del medio de
cultivo?
¿Cómo optimizar el crecimiento de microorganismos biolixiviantes?
¿Qué microorganismos seleccionaría para conformar un consorcio microbiano con el
propósito de mejorar un proceso de lixiviación?
Haga un comentario sobre las oportunidades de la Biotecnología en la Biominería?
10. BIBLIOGRAFÍA:
11. ANEXOS:
PRACTICA Nº 2.
CARACTERIZACIÓN DE MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES
1. OBJETIVOS:
1.1. Caracterizar macroscópicamente el cultivo de los microorganimos

biolixiviantes aislados de su ambiente nativo en medio 9K sólido y líquido.
1.2. Caracterizar microscópicamente los microorganimos biolixiviantes aislados a
través de una preparación simple y una tinción diferencial.
1.3. Enfatizar en el proceso enseñanza-aprendizaje valores de puntualidad,
2. MARCO TEÓRICO:
La observación al microscopio óptico con distintas coloraciones de los cultivos

bacterianos, el conocimiento de la composición bioquímica de las diferentes
estructuras bacterianas, así como su metabolismo, tienen un rol importante en la
identificación de las bacterias y su ubicación taxonómica.
Recientemente, los avances de la genética bacteriana hicieron posible el desarrollo
de técnicas de biología molecular con aplicaciones a nivel de la investigación
científica y la industria.
Las bacterias que intervienen en los procesos de lixiviación son generalmente

aeróbicas, mesófilas, acidófilos y quimiolitoautótrofas, lo que implica que obtienen
las energía necesaria para su funcionamiento mediante la oxidación de compuestos
inorgánicos, utiliza C02 como única fuente de carbono para todas sus necesidades
metabólicas, no requiere de nutrientes orgánicos y es capaz de desarrollarse a
valores de pH muy bajos, en el rango de 1 a 3.
Acidithiobacillus ferrooxidans, ha sido la bacteria más estudiada, tiene forma

bacilar, es gramnegativa y mide aproximadamente 0.5 µm de diámetro y 2 µm de
longitud. Otras importantes bacterias lixiviantes son Acidithiobacillus thiooxidans y
Leptospirillum ferrooxidans. Estas tres especies son las más frecuentemente
encontradas en operaciones mineras y tienen un papel directo en las reacciones de
biolixiviación.
En los últimos años han despertado gran interés microorganismos termófilos

extremos, capaces de crecer a temperaturas de 65 y 80 °C, que presentan buenas
características lixiviantes sobre sulfuros reconocidamente recalcitrantes. Estos
organismos pertenecen al dominio de la arqueas, las cuales han sido
mayoritariamente aisladas de aguas termales y géiseres.
3. MATERIALES:
3.1. Materia prima:

Cultivos de microorganismos biolixiviantes.
3.2. Reactivos:
Aceite de inmersión.
Alcohol isopropílico.
Sol. Etanol 70%.
Tinción de Gram.

Cubreobjetos.
Portaobjetos.
3.4. Otros:
Algodón.
Asa de Kolle.
Mechero.
Micropipeta, p20.
Soporte de tinción.
Tips.
3.5. Equipos:
Microscopio óptico compuesto.
4. METODOLOGÍA:
4.1. Caracterización macroscópica:

Se caracterizó la morfología de las colonias y los cambios característicos del
medio 9K líquido.
4.2. Caracterización microscópica:

Se realizó una preparación simple o en fresco y la tinción diferencial de
Gram.
4.3. Caracterización fisicoquímica:

Se realizó la determinación del pH, temperatura y potencial redox.
Registrar los cambios característicos del medio de cultivo 9K líquido.

Describir las características morfológicas de las colonias de los microorganismos
biolixiviantes aislados.
Evaluar las características microscópicas de los microorganismos biolixiviantes
aislados a través de una preparación simple y la tinción diferencial de Gram.
7. CONCLUSIONES:
8. SUGERENCIAS:
9. CUESTIONARIO:
Caracterizar a las arqueas como organismos biolixiviantes.

Utilizando las herramientas de la Biología molecular, describe ¿Qué métodos se
utilizan para identificar microorganismos biolixiviantes?
Describe ¿Qué métodos se utilizan para medir la actividad microbiana en los
procesos de biolixiviación?
Explica las tecnologías desarrolladas por BioSigma para la biolixiviación:
Explica los métodos utilizados para la identificación y biocaracterización de
microorganismos biolixiviantes propuestos por BioSigma
¿En qué consiste la técnica de epifluorescencia directa en filtro (DEFT)?
¿En qué consiste el método de bioluminiscencia – LixKit?
¿Qué factores fisicoquímicos se deben evaluar en un proceso biolixiviación? ¿Cómo?
y ¿Porque?
10. BIBLIOGRAFÍA:
11. ANEXOS:
PRACTICA Nº 3.
TALLER
REVISION DE ARTICULOS CIENTÍFICOS
Para el presente taller, leer el Artículo científico:

Bioleaching of a chalcopyrite concentrate with moderate
thermophilic microorganisms in a continuous reactor system
L. Cancho, M.L. Blázquez, A. Ballester, F. González, J.A. Muñoz
Department of Materials Science and Metallurgical Engineering, Universidad Complutense, Madrid, Spain
Received 28 June 2006; received in revised form 14 December 2006; accepted 19 February 2007
Available online 21 March 2007
ACTIVIDADES:
1. Formule el Objetivo general y tres Objetivos específicos para el presente

Artículo científico.
2. Formule una hipótesis para el presente Artículo científico.
3. Mencione las ventajas y desventajas del uso de reactores en la biolixiviación.
4. Mencione tres antecedentes en el uso de reactores en el proceso de
biolixiviación.
5. ¿Cuál es el principal objetivo de las recientes investigaciones y que soluciones
plantean?
6. ¿Qué aspecto es el más importante en la selección y diseño del reactor?
7. ¿Cómo interactúan los iones de Ag y los microorganismos en el proceso de
biolixiviación?
8. ¿En qué consistió la muestra?
9. ¿En qué consistió el cultivo de microorganismos? y ¿Cuáles fueron las
condiciones de incubación?
10. Explica ¿Cómo está conformado el sistema continuo de reactores?
11. ¿Qué parámetros de control se establecieron en el sistema continuo de
reactores?
12. ¿Cómo se monitoreó el proceso de biolixiviación en el sistema continuo de
reactores?
13. ¿Cómo se determinó el tiempo de residencia en el estado continuo del sistema?
14. Explica ¿En qué consistió la prueba preliminar?
15. En la prueba preliminar ¿Por qué hay un incremento del metal en solución en el
reactor 3?
16. ¿Qué diferencias destacan en el monitoreo, entre la prueba preliminar y la
prueba de biolixiviación continua?
17. Según su criterio ¿Cuál es el principal cambio introducido para mejorar la
biolixiviación en el sistema continuo?
18. Defina las variables independientes de la investigación:
19. Defina las variables dependientes de la investigación:
20. Formule cuatro conclusiones obtenidas en el estudio.
PRACTICA Nº 4.
BIOXIDACIÓN DEL ION FERROSO POR MICROORGANISMOS

BIOLIXIVIANTES
1. OBJETIVOS:
1.1. Evaluar la Biooxidación del ion ferroso por los microorganismos biolixiviantes
aislados.
1.2. Determinar la concentración del ion ferroso en solución.
1.3. Explicar la importancia de la Biooxidación del ion ferroso en el proceso de
Biolixiviación de minerales refractarios.
2. MARCO TEÓRICO:
Los microorganismos son los responsables directos del reciclaje de los elementos en
la biosfera, llevando a cabo, gracias a su extraordinaria diversidad metabólica,
muchas de las transformaciones de compuestos tanto orgánicos como inorgánicos
que resultan esenciales en los ciclos de la materia.
El hierro es un elemento muy abundante en la tierra y se encuentra principalmente
en dos estados de oxidación: Fe (II) y Fe (III).
Gracias al alto potencial del par Fe (II)/Fe (III), 0.76 V, el único aceptor electrónico
capaz de oxidar el Fe (II) es el oxígeno. Por ello, a un pH neutro, el Fe (II) se oxida
espontáneamente a Fe (III), que forma compuestos insolubles por lo que precipita
rápidamente. Sin embargo, si el pH es acido, el hierro puede permanecer en la
forma más reducida, Fe (II).
La mayoría de las reacciones de oxidación/reducción que sufre el hierro a lo largo de
su ciclo, son catalizadas biológicamente bajo distintas condiciones. En condiciones
de anaerobiosis, el Fe (II) puede ser reducido por microorganismos como
Shewanella putrefaciens al usarlo como aceptor de electrones. En presencia de
oxigeno el Fe (II) puede oxidarse espontáneamente; sin embargo algunos
microorganismos tienen mecanismos capaces de aprovechar el Fe (II) antes de sus
oxidación como fuente de energía disponible. Estos incluyen representantes del
genero Acithiobacillus, organismos adaptados a ambientes acidófilos done el Fe (II)
es más abundante.
Hasta hace poco tiempo la Biooxidación de Fe (II) solo se había utilizado
industrialmente en hidrometalurgia, en procesos de biolixiviación y tratamiento de
las aguas de drenaje acidas de minas. Actualmente, debido a la atención que se
presta a los problemas medioambientales que acarrea la utilización de gases y
carbón con un alto contenido de azufre, se ha incrementado el interés por estos
procesos biológicos para la desulfuración de estos.
La industria metalúrgica está reconociendo que el uso de microorganismo en ciertos
procesos hidrometalúrgicos en una solución potencial a los problemas presentados
en muchas minas, donde las escasez de minerales de alta ley incrementa la
necesidad de desarrollar métodos aceptables económicamente, para recuperar los
metales a partir de minerales de baja ley. Así en la actualidad, la biolixiviación se
está utilizando para la obtención de elementos tales como uranio, zinc, níquel,
cobalto, pero especialmente para el cobre.
3. MATERIALES:
3.1. Muestras:
Medio del cultivo 9K.
3.2. Reactivos:
Solucion de Etanol 70%.
Solución extractiva.
Solución de Dicromato de potasio 0.01N.
Solución de Difenilamina acida 1%.

Buretas, 25 mL.
Beakers, 100 mL.
Pipetas, 10 mL.
Pipetas Pasteur.
3.4. Otros:
Jeringas hipodérmicas, 5 mL.

Soporte universal.
Pinzas.
Algodón.
Mecheros. (2)
Micropipeta, P20.
Plastic wrap.
Picetas.
Tips estériles.
4. METODOLOGÍA:
4.1. Toma de muestra:

Tomar 5 mL de la muestra, añadir la solución Extractiva y la solución de
Difenilamina acida 1%.
4.2. Determinación del ion ferroso:

Titular la muestra por Dicromatometría.
Determinar la concentración del ion ferroso en la muestra.
7. CONCLUSIONES:
8. SUGERENCIAS:
9. CUESTIONARIO:
Además de la biolixiviación ¿Qué otras alternativas se han desarrollado como

aplicación de la biooxidacion del ion ferroso?
¿Por qué es importante la biooxidación en el tratamiento de minerales de oro?
10. BIBLIOGRAFÍA:
11. ANEXOS:
PRACTICA Nº 5.
TALLER

Purification of Anti-Japanese Encephalitis Virus Monoclonal
Antibody by Ceramic Hydroxyapatite Chromatography Without
Proteins A and G.
Maiko Saito,1 Yae Kurosawa,1 and Tsuneo Okuyama2
1
R&D Department, Pentax New Ceramics Division, Hoya Corporation, Akishima-shi, Tokyo, Japan.
2
Protein Technos Institute, Atsugi-shi, Kanagawa, Japan 2012
ACTIVIDADES:
1. ¿Dónde y cuándo se realizó el presente trabajo de investigación?

2. ¿Qué pretende realizar el presente trabajo de investigación?
5. ¿Cómo se denomina la tecnología de obtención de MAb? ¿Explica en qué
consiste?
6. ¿Qué operaciones unitarias se incluye en el DSP para la obtención del MAb?
7. ¿En qué consiste la etapa de purificación convencional de MAb del virus de la
encefalitis? ¿Cuál es su desventaja?
8. ¿En qué consiste la etapa de purificación que sugiere el presente trabajo de
investigación?
9. ¿Qué métodos se utilizaron para identificar y cuantificar al producto
biofarmacéutico? ¿En qué consisten?
10. Defina las variables independientes y dependientes de la investigación:
11. Formule tres conclusiones obtenidas en el estudio.
Purification and characterization of Extracellular Protease from
Halotolerant Bacterium Virgibacillus dokdonensis VITP14
V. Devi Rajeswari, G. Jayaraman and T.B Sridharan
Industrial Biotechnology Division, School of Biosciences and Technology, VIT University, Vellore, Tamil Nadu, India.
ACTIVIDADES:

2. ¿Qué pretende dar a conocer el presente trabajo de investigación?
4. ¿Cuál es la importancia de las proteasas en la industria?
5. ¿Qué género microbiano es generalmente fuente de proteasas?
6. ¿A través de qué estrategia se realizó la caracterización molecular de la bacteria
halotolerante aislada?
7. ¿Qué operaciones unitarias se incluye en cada etapa del DSP para la obtención
de la proteasa extracelular?
8. ¿Explica en qué consiste la etapa de purificación para la obtención de la
proteasa extracelular?
9. ¿Qué métodos se utilizaron para evaluar actividad proteolítica? ¿En qué
consisten?
10. ¿Qué es un zimograma?
11. ¿Qué métodos se utilizaron para evaluar el peso molecular y la pureza del
producto? ¿En qué consisten?
12. ¿Qué variables se evaluaron en la determinación de su actividad proteolítica? y
¿Cuáles fueron las condiciones óptimas reportadas?
14. Formule tres conclusiones obtenidas en el estudio.
PRACTICA Nº 6.
EXTRACCIÓN Y DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD INVERTASA DE

Saccharomyces cerevisiae
1. OBJETIVOS:
1.1. Explicar la recuperación de la invertasa a partir de Saccharomyces

cerevisiae.
1.2. Comprender los principios básicos de la hidrólisis enzimática de la sacarosa.
1.3. Determinar la actividad invertasa analizando la cantidad de azucares
reductores formados.
1.4. Explicar la importancia de la hidrólisis de la sacarosa en los procesos
biotecnológicos.
2. MARCO TEÓRICO:
El consumo de azúcar en el mundo aumenta cada vez más, aunque la remolacha

azucarera y la caña de azúcar constituyen la fuente de materia prima más utilizada
para la industria de la sacarosa, hoy en día se buscan otras alternativas para su
obtención u otros azúcares con mayor efecto edulcorante como la fructosa, que está
cobrando inusitado interés.
La hidrólisis (inversión) de la sacarosa, sea de manera completa o parcial a glucosa

y fructosa, provee jarabes de mayor poder edulcorante, que son más dulces, más
estables, es decir con menos probabilidad de cristalización que jarabes puros de
sacarosa. El más popular “Jarabe Dorado” se produce por hidrólisis ácida en algunos
ingenios azucareros; sin embargo, hay otros tipos de jarabe que son producidos
usando invertasa de Saccharomyces cerevisiae, levadura panaria, lo que constituye
tecnología de enzimas. Aunque esta enzima tiene la particularidad en que sufre la
inhibición del sustrato a altos niveles de sacarosa (> 20%, p/p), esto no significa su
uso comercial.
La invertasa (β-D-fructofuranosidasa, EC 3.2.1.26), cataliza la hidrólisis de

sacarosa, a glucosa y fructosa, es por ello, que la enzima se designa con el nombre
de sacarasa. La denominación trivial de invertasa, hace referencia al hecho de que
la sacarosa desvía la luz polarizada a la derecha, por eso se le denomina que es
dextrorotatoria, mientras la fructosa muestra una acción levorotatoria de mayor
magnitud comparada con la glucosa que es dextrorotatoria, por eso es que mientras
se produce la hidrólisis de la sacarosa, la dextrorotación gradualmente cae a zero y
la solución finalmente muestra una desviación a la izquierda. Por eso es que este
tipo de hidrólisis algunas veces se llama “inversión”.
En la práctica se realizará la recuperación de la invertasa a partir de Saccharomyces
cerevisiae, Para la determinación de la actividad invertasa se utilizará un ensayo
indirecto en el que los productos de reacción serán detectados
espectrofotométricamente tras su conversión en derivados coloreados. En concreto,
la hidrolisis enzimática de sacarosa en glucosa más fructosa, se valorará mediante
el método del ácido 3,5–dinitrosalicílico (DNS), el cual se basa en la reducción del
DNS (de color amarillo) por la glucosa u otro azúcar reductor al ácido 3-amino-5-
nitrosalicílico (color rojo), cuya presencia puede detectarse por lectura de la
absorbancia a 570 nm.
3. MATERIALES:
3.1. Insumos:
Sacarosa.
Levadura liofilizada.
3.2. Reactivos:
Reactivo DNS.
Solución de glucosa.
Buffer acetato 0.1 M pH 5.

Beakers, 100 mL.
Celdas del espectrofotómetro.
Matraces, 100 mL.
Pipetas, 1, 5 y 10 mL.
Probetas, 100 mL.
Tubos de ensayo.
Tubos de centrífuga.
3.4. Otros:
Espátulas.
Gradilla para tubos.
Hielo.
Micropipeta, P200.
Morteros.
Picetas.
3.5. Equipos:
Balanza analítica.
Baño de ultrasonido.
Baño termostático.
Centrífuga.
Espectrofotómetro.
4. METODOLOGÍA:
4.1. Extracción de la invertasa:
Recuperar la invertasa cruda a partir de la lisis o disrupción celular de

Saccharomyces cerevisiae.
4.2. Elaboración de la curva de calibración:
A partir de una solución stock de glucosa, preparar una gama de

soluciones de diferentes concentraciones, añadir el reactivo DNS y
determinar la absorbancia a 570 nm.
4.3. Inversión de la sacarosa:
Establecer las condiciones favorables para la hidrólisis de la sacarosa

utilizando la invertasa recuperada.
Analizar el contenido de azucares reductores por el método DNS.
Graficar la curva de calibración de azucares reductores por el método de DNS.

Determinar la actividad invertasa del extracto.
Describe las operaciones unitarias utilizadas en cada etapa del DSP para la
extracción de invertasa de Saccharomyces cerevisiae.
7. CONCLUSIONES:
8. SUGERENCIAS:
9. CUESTIONARIO:
¿Cuál es el fundamento de la reacción de Fehling?

Explica el método del DNS para la determinación de azúcares reductores.
Describe la etapa de concentración y purificación de la invertasa.
Describe tres aplicaciones de la invertasa en la industria biotecnológica.
¿Qué productos desarrolla Megazyme?
10. BIBLIOGRAFÍA:
11. ANEXOS:
PRACTICA Nº 7.
SEPARACIÓN, CONCENTRACIÓN, PURIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN

DEL PRINCIPIO ACTIVO DE LA FUROSEMIDA
1. OBJETIVOS:
1.1. Comprender los principios básicos de la extracción sólido-líquido,

precipitación y cristalización como operaciones unitarias.
1.2. Explicar el método de extracción solido-líquido por soxhlet en el aislamiento
del principio activo.
1.3. Explicar el método de extracción acido-base por extracción asistida por
ultrasonido (EAU) en la precipitación del principio activo.
1.4. Realizar la purificación de la furosemida impura por cristalización.
1.5. Identificar el principio activo por determinación del punto de fusión.
1.6. Comparar y evaluar el rendimiento de los métodos de extracción en la
obtención del principio activo puro.
2. MARCO TEÓRICO:
Actualmente la Ingeniería Biotecnológica está en auge y se aplica a prácticamente

todos los sectores, incluso en la elaboración de medicamentos. Se estima que un
50% de todos los medicamentos nuevos proceden de biotecnologías, y la proporción
aumenta al tratarse de los tratamientos más innovadores.
La "biotecnología blanca o química sostenible" permite a las compañías
farmacéuticas llevar a cabo métodos de producción que se adaptan a la nueva
normativa sobre desarrollo sostenible.
Mediante la biotecnología y la genómica se pueden diseñar fármacos a medida,
medicamentos que sean más eficaces con nuestra fisiología y nuestra bioquímica.
En la literatura se reportan varios métodos para el aislamiento y purificación de los
principios activos de un producto, que se fundamentan principalmente en la
extracción solido-líquido, precipitación y cristalización.
Extracción Sólido−Líquido:
Consiste en la disolución de un soluto, principio activo u analito que forman parte de
una matriz sólida, empleando un solvente adecuado en el que es insoluble el resto
del sólido.
La disolución separada se denomina extracto y el resto de sólido se denomina inerte
Extracción por Soxhlet:

Es un tipo de extracción semicontinua, pues una de las fases, el sustrato se agrega
solo al principio, mientras que el solvente de extracción cumple un ciclo de
extracción y purificación continua.
La purificación se realiza en forma paralela por destilación del solvente, de manera
que el sustrato siempre está en contacto con el solvente puro y frío.
El soxhlet funciona cíclicamente, para extraer las concentraciones necesarias de
algún determinado compuesto.
La extracción con soxhlet presenta las siguientes ventajas:
La muestra está en contacto repetidas veces con porciones frescas de
disolvente.
La extracción se realiza con el disolvente caliente, así se favorece la
solubilidad de los analitos.
No es necesaria la filtración después de la extracción.
La metodología empleada es muy simple.
Permite la recuperación del disolvente.
Extracción asistida por ultrasonido (EAU):

La extracción asistida por ultrasonido (EAU) permite extraer las sustancias de
interés utilizando sonidos de alta frecuencia, con el fin de desprender el compuesto
buscado. Las partículas sólidas y líquidas vibran y se aceleran ante la acción
ultrasónica, como resultado el soluto pasa rápidamente de la fase sólida al solvente.
El proceso de extracción es significativamente más eficiente utilizando el baño de
ultrasonido, el cual es capaz de generar ondas ultrasónicas con la finalidad de
provocar una microagitación muy energética y útil para la disolución rápida de los
principios activos, ya que las ondas acústicas aumentan la interacción del solvente
con las superficies del sólido por un fenómeno mecánico denominado cavitación.
El mecanismo de extracción involucra dos fenómenos físicos: difusión a través de la
pared celular y el lavado de los contenidos celulares, una vez que las paredes se
han lisado.
El baño de ultrasonido requiere de un medio líquido y un generador de energía,
capaz de transmitir una corriente eléctrica a un sistema mecánico que la convertirá
en energía acústica o vibraciones de alta intensidad generándose ondas de
ultrasonido que generan millones de burbujas microscópicas, las cuales se
expanden y colapsan contra las células causando la ruptura de su membrana.
Esta técnica es la más económica, productiva y amigable con el medio ambiente,
que los métodos tradicionales, además tiene los requerimientos instrumentales más
bajos entre las últimas técnicas de extracción desarrolladas.
Precipitación:
La precipitación es una operación unitaria de separación que se produce cuando
tenemos una sustancia en disolución que por algún factor externo, forma el
precipitado, sustancia sólida que se forma en el interior de una disolución. Es un
método sencillo y directo para purificar solutos.
Cristalización:
La cristalización es una operación de transferencia de materia en la que se produce
la formación de un sólido (cristal o precipitado) a partir de una fase homogénea
(soluto en disolución o en un fundido).
3. MATERIALES:
3.1. Materia prima:

Tabletas de furosemida (40mg).
3.2. Reactivos:
Etanol.
Metanol.
Solucion de Hidroxido de sodio (NaOH).
Solucion de acido clorhidrico (HCl).

Beakers, 250 mL.
Capilares.
Matraces 250 mL.
Pipetas, 5 y 10 mL.
Probeta, 100 mL.
Termometro.
3.4. Otros:
Espátula.
Papel filtro.
3.5. Equipos:
Balanza analítica.
Hotplate.
Equipo de filtración al vacío.
Equipo de reflujo.
Equipo Soxhlet.
Baño de ultrasonido.
4. METODOLOGÍA:
4.1. Preparación de la materia prima:

Pulverizar la materia prima y registrar el peso.
4.2. Separación y concentración del principio activo:

Aislar el principio activo de la furosemida utilizando el equipo del soxhlet.
Aislar el principio activo de la furosemida a través de una extracción
acido base, utilizando el equipo del ultrasonido.
4.3. Purificación del principio activo:

Reflujar el sólido suspendido en una mezcla que permita su posterior
cristalización.
Obtener los cristales del principio activo de la furosemida.
4.4. Identificación del principio activo:
Determinar el punto de fusión de los cristales obtenidos.
Describe las operaciones unitarias utilizadas en cada etapa del DSP para la
obtención de cristales de furosemida.
Reportar el rendimiento de los métodos de extracción en la obtención de cristales de

furosemida.
Determinar el punto de fusión del principio activo.
Reportar el volumen de etanol utilizado en la cristalización.
Comparar los métodos de aislamiento del principio activo de la furosemida.
7. CONCLUSIONES:
8. SUGERENCIAS:
9. CUESTIONARIO:
Diseña un diagrama de flujo para la obtención de un principio activo a partir de un

medicamento producto de la síntesis química.
Diseña un diagrama de flujo para la obtención de un principio activo a partir de un
medicamento producto de la biotecnología.
Enumera cinco diferencias entre los medicamentos convencionales y los
biotecnológicos.
Describe las operaciones unitarias más utilizadas en la etapa de concentración de
productos biofarmacéuticos.
Describe dos tipos de cromatografía para la obtención de productos
biofarmacéuticos.
¿Qué empresas biotecnológicas destacan en la producción de biofarmacéuticos?
Realiza un breve comentario sobre las actividades que realizan.
10. BIBLIOGRAFÍA:
11. ANEXOS:
PRACTICA Nº 8.
CRISTALIZACIÓN DE LA SACAROSA
1. OBJETIVOS:
1.1. Comprender los principios básicos de la cristalización como operación

unitaria.
1.2. Cristalizar azúcar rubia comercial con adición de carbón activado y tierra de
diatomeas.
1.3. Explicar la importancia de la cristalización como operación unitaria de
purificación y formulación de productos en el DSP biotecnológico.
2. MARCO TEÓRICO:
Cristalización:
La cristalización es una operación de transferencia de materia en la que se produce

la formación de un sólido (cristal o precipitado) a partir de una fase homogénea
(soluto en disolución o en un fundido).
La cristalización es un proceso de separación que purifica fluidos por la formación de
sólidos.
La cristalización es también un proceso de formación de partículas por el cual
moléculas en solución o vapor son transformadas a una fase sólida.
La cristalización se basa en la mayor solubilidad que suelen presentar los sólidos en
un disolvente en caliente que en frío, el modo más frecuente es preparar una
disolución saturada en caliente del sólido a purificar, utilizando un disolvente
adecuado; filtrar para eliminar las impurezas insolubles que se hallen presentes y
dejar que se separe por enfriamiento la sustancia que estaba disuelta, cristalizada y
en un mayor estado de pureza.
El proceso desarrollado en este trabajo se basa en la baja solubilidad de la sacarosa
en etanol en comparación con el agua, por tanto, la solución hidroalcohólica
azucarada permite realizar la filtración en carbón activado o tierra de diatomeas
para remover impurezas y color.
Métodos de cristalización:
Cristalización por enfriamiento:

Este método sólo puede utilizarse con aquellas sustancias que tienen una curva de
solubilidad que desciende apreciablemente con la temperatura. Este es el tipo
normal de curva de solubilidad para la mayor parte de las sustancias. Por lo tanto
fue el primer método de cristalización que se empleó y que aún es muy usado.
Cristalización por evaporación del disolvente:
Este método sólo puede utilizarse con aquellas sustancias cuya solubilidad depende
poco de la temperatura o el rendimiento en sólidos por enfriamiento sería
despreciable. En éste método se evapora una parte del disolvente, hasta que la
cantidad de sustancia disuelta en la solución restante supere la concentración de
saturación. Encuentra su principal aplicación en la producción de la sal corriente.
Cristalización por evaporación al vacío:

Es el método más importante para producciones a gran escala. Si una solución
caliente se introduce en un recinto que tenga una presión total menor que la presión
de vapor del disolvente a la temperatura a que se introduce, el disolvente se
evaporará rápidamente y la eliminación del calor necesario enfría además la
solución. Este método es ventajoso, ante todo, para los casos de sustancias
sensibles a la temperatura, ya que la evaporación en vacío tiene lugar a
temperaturas más bajas.
Cristalización por adición de una tercera sustancia:

La adición de una tercera sustancia que reduce la solubilidad de tal forma que
cristaliza el soluto que se desea. La tercera sustancia en altas concentraciones
reduce la solubilidad del soluto, de tal manera que, a medida que la concentración
del componente muy soluble aumenta, la solubilidad del componente menos soluble
disminuye hasta el punto de que se efectúa la cristalización. Ej. Evaporación de las
soluciones electrolíticas de sosa caustica y en la evaporación de las lejías de los
jabones de glicerina.
3. MATERIALES:
3.1. Materia prima:

Azúcar rubia.
Carbón activado.
Tierra de diatomeas.
3.2. Reactivos:
Etanol.

Baguetas.
Embudos con vástago corto.
Equipo a reflujo.
Matraces, 250 mL.
Pipetas Pasteur.
Probeta, 50 y 100 mL.
3.4. Otros:
Espátula.
Papel filtro.
Pinzas.
Soporte universal.
3.5. Equipos:
Balanza analítica.
Estufa.
Hotplate.
4. METODOLOGÍA:
4.1. Prueba preliminar:
Reflujar 25 g de azúcar rubia con 50 mL de etanol por unos 10 minutos

con agitación constante en el hotplate.
Con una pipeta pasteur añadir por la parte superior del refrigerante cada
2 min, 5 mL de agua destilada, hasta observar la disolución total de la
sacarosa.
Filtrar rápidamente la mezcla por gravedad y en caliente.
Dejar enfriar en reposo el filtrado y observar la formación de los cristales
de sacarosa.
Después de obtener los cristales por precipitación, filtrar al vacío.
Determinar el volumen final de agua destilada necesario para lograr la

disolución total de la sacarosa.
4.2. Purificación de la azúcar rubia con carbón activado:
Reflujar 25 g de azúcar rubia, 1g de carbón activado con 50 mL de

etanol por unos 15 minutos.
Añadir por la parte superior del refrigerante el volumen de agua
destilada necesario para lograr la disolución total de la sacarosa.
Filtrar por gravedad y en caliente.
Dejar enfriar en reposo el filtrado y observar la formación de los cristales
de sacarosa.
Después de obtener los cristales por precipitación, filtrar al vacío.
4.3. Purificación de la azúcar rubia con tierra de diatomeas:
Reflujar 50 g. de azúcar rubia, 1g de tierra de diatomeas con 50 mL de

etanol por unos 15 minutos. Proceder según el tratamiento anterior.
Determinar y comparar el tiempo requerido para la formación de los cristales en la

prueba preliminar y en cada tratamiento.
Reportar y comparar la cantidad de cristales de sacarosa obtenidos en la prueba
preliminar y en cada tratamiento.
Identificar a qué tipo de cristales corresponde los de sacarosa.
Reportar y comparar las características de los cristales obtenidos en cada

experiencia.
7. CONCLUSIONES:
8. SUGERENCIAS:
9. CUESTIONARIO:
¿Cuáles son las ventajas de la cristalización como operación unitaria?

¿Por qué es importante la filtración en caliente?
Determinar la solubilidad de la sacarosa en etanol y agua
Describa Ud. el proceso de reflujo y sus características
Describir el proceso de producción de azúcar refinada.
¿Qué productos se obtienen por cristalización, según el tipo: por enfriamiento, por
evaporación y la adición de una tercera sustancia?
10. BIBLIOGRAFÍA:
11. ANEXOS:
PRACTICA Nº 9.
FERMENTACION ALCOHOLICA PARA LA OBTENCIÓN DE ETANOL

MEDIANTE Saccharomyces cerevisiae INMOVILIZADA
1. OBJETIVOS:
1.1. Comprender los principios básicos de la inmovilización de células.

1.2. Explicar la inmovilización de Saccharomyces cerevisiae por el método de
entrampamiento por gelificación.
1.3. Comprender los principios básicos de las operaciones unitarias utilizadas en
la obtención de etanol a partir de materia prima fermentable y levaduras
inmovilizadas.
1.4. Evaluar por refractometría el grado alcohólico del producto de la
fermentación.
2. MARCO TEÓRICO:
La tecnología de fermentación es el más antiguo proceso biotecnológico conocido,

en el cual, los microorganismos responsables de este proceso, catalizan la
conversión de la materia prima inicial en productos biotecnológicos, como por
ejemplo el etanol mediante un proceso conocido como fermentación alcohólica.
Una fermentación alcohólica consiste en la degradación anaerobia de la glucosa a

etanol y dióxido de carbono. Tras la glucólisis, el ácido pirúvico se descarboxila
pasando a acetaldehído, éste se reduce mediante el NADH + H+ generado en la
glucólisis, gracias a la enzima alcohol deshidrogenada, y como producto final se
obtiene etanol.
Los microorganismos o biocatalizadores de la fermentación alcohólica tienen la

función de procesar los hidratos de carbono (Ej. Glucosa, fructuosa, etc.) para
obtener como productos etanol (CH 3-CH2-OH), dióxido de carbono (CO2 (g)) y una
molécula de ATP, la cual es consumida por los mismos microorganismos en su
metabolismo celular energético anaeróbico.
El uso de biocatalizadores para llevar a cabo biotransformaciones es un área de la

Ing. Biotecnológica en continua expansión. Un aspecto clave del proceso es
extender el uso de los mismos en un sistema continuo dando como resultado una
disminución de los costos del proceso y otras ventajas como una mayor pureza del
producto y mayor productividad.
Para lograr este objetivo los biocatalizadores se inmovilizan, según la European

Federation of Biotechnology (1983) define a los biocatalizadores inmovilizados como
células, organelos u enzimas (o combinación de ellos) confinados o localizados en
cierta región definida del espacio, con retención de su actividad catalítica, que
pueden ser usados de modo repetido y continuo, y que además permite obtener el
producto final deseado exento de sustancias biológicas y células, excluyendo
algunas etapas de purificación.
En algunos casos, los biocatalizadores se encuentran unidos a materiales de soporte

insolubles (carriers) y en otros casos se encuentran confinados por atrapamiento.
Uno de los procedimientos biotecnológicos más útiles es inmovilizar las levaduras en
diferentes soportes como agar, alginato de calcio, carragenatos, colágeno, almidón,
etc., obteniéndose pellets, que permiten la difusión de los sustratos (glucosa) y
productos (etanol y dióxido de carbono). Por tanto, las instalaciones piloto producen
durante meses continuamente etanol a partir de glucosa con la ayuda de células
inmovilizadas.
Las levaduras del género Saccharomyces cerevisiae han sido utilizadas

tradicionalmente en la industria de la producción de etanol, con el propósito de
incrementar los niveles productivos. En condiciones anaerobias Saccharomyces
cerevisiae reduce el piruvato a etanol con emisiones de CO2, obteniendo un
rendimiento estequiométrico teórico de 0.511 g de etanol y 0.489 g de CO2, por
cada gramo de glucosa metabolizada. Sin embargo, se ha observado que a nivel
experimental e industrial sólo se alcanza entre el 87% y el 95% del rendimiento
teórico para el etanol, ya que esta levadura también utiliza la glucosa en la
producción de otros subproductos.
A nivel industrial, el proceso fermentativo se lleva a cabo en fermentadores

industriales de gran tamaño, también conocidos como Biorreactores.
El objetivo es incrementar la producción de etanol, simultáneamente con el
mantenimiento del nivel proteico mediante la utilización de las técnicas de
inmovilización. La cristalización es una operación de transferencia de materia en la
que se produce la formación de un sólido (cristal o precipitado) a partir de una fase
homogénea (soluto en disolución o en un fundido).
3. MATERIALES:
3.1. Material biológico:

Levadura liofilizada, Saccharomyces cerevisiae.
3.2. Reactivos:
Alginato de sodio.
Solución de Cloruro de calcio al 2% (CaCl2).

Baguetas.
Beakers, 250 mL.
Embudos de vidrio.
Pipetas Pasteur.
Probetas, 100 mL.
3.4. Otros:
Embudo Buchner.
Espátulas.
Gasa.
Jeringa hipodérmica (20 mL).
Matraz Kitasato.
Mortero.
Papel filtro.
Parafilm.
Picetas.
3.5. Equipos:
Balanza analítica.
Bomba al vacío.
Hotplate.
Refractómetro.
4. METODOLOGÍA:
4.1. Obtención de la materia prima fermentable:
Obtener por prensado materia prima fermentable.

Filtrar con una gasa el jugo obtenido.
Tomar una alícuota, considerando la muestra a tiempo cero y leer los
grados Brix o porcentaje de azúcar en el refractómetro.
4.2. Inmovilización de la levadura
Solubilizar la levadura liofilizada en agua destilada.

Disolver el Alginato de sodio en la suspensión de levadura. Homogenizar
Tomar en una jeringa hipodérmica 20 mL de la mezcla y dejar caer gota
a gota en un beaker que contiene la Solución de Cloruro de calcio al 2%.
Repetir el paso anterior hasta agotar la mezcla.
Separar los pellets por filtración al vacío y lavarlos con la Solución de
Cloruro de calcio al 2%.
4.3. Purificación de la azúcar rubia con tierra de diatomeas:
En un beaker, colocar los pellets y la materia prima fermentable. Agitar

la mezcla en un hot plate.
Tomar alícuotas y leer los grados Brix en el refractómetro, cada día
durante una semana.
Reportar la variación en grados Brix o el porcentaje de azúcar de la materia

fermentable a través del tiempo.
Reportar el grado alcohólico del producto fermentado.
7. CONCLUSIONES:
8. SUGERENCIAS:
9. CUESTIONARIO:
¿Cuáles son las ventajas de la inmovilización de células?

¿Qué otros método se utiliza para inmovilizar células?
¿En qué consiste la fermentación alcohólica?
En esta práctica se usó la levadura Saccharomyces cerevisiae, ¿Que otros
microorganismos son utilizados para las fermentaciones alcohólicas y que productos
se obtienen de dichas fermentaciones?
¿Cuál es el fundamento del refractómetro?
¿Cómo se obtiene el Bioetanol?
10. BIBLIOGRAFÍA:
11. ANEXOS:
PRACTICA Nº 10.
TALLER
Información Tecnológica Vol. 22(6), 3-14 (2011)
Fermentación de los fructanos del Agave tequilana

Weber Azul por Zymomonas mobilis y Saccharomyces
cerevisiae en la producción de Bioetanol
José L. Montañez (1), Juan C. Victoria (1), Rebeca Flores (1) y María Á. Vivar (2)
(1) Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional, Justo Sierra 28, C.P. 59510, Jiquilpan, Mich.-México.
(2) Instituto Tecnológico de Tuxtepec, Av. Dr. Víctor Bravo Ahuja S/N. Col. 5 de Mayo,Tuxtepec, C.P. 68350, Oaxaca-México
ACTIVIDADES:

4. ¿Cuáles son las ventajas de utilizar Zymomonas mobilis en la producción de
Bioetanol en vez de Saccharomyces cerevisiae? ¿Por qué?
5. ¿Cuáles son las ventajas de utilizar hojas de Agave tequilana Weber Azul?
6. ¿Qué motiva a la búsqueda de fuentes alternas de energía renovable?
7. ¿Qué materia prima destaca para la producción de bioetanol?
8. ¿Qué son los fructanos? ¿Cuál es su fuente de obtención?
9. ¿Cuáles son las estrategias utilizadas para la obtención de Bioetanol a partir de
fructanos?
10. ¿Cuáles son las etapas del Upstream Processing que se consideraron en el
presente estudio?
12. Formule las conclusiones obtenidas en el estudio.
PRACTICA Nº 11.
OBTENCIÓN DE BIODIESEL
1. OBJETIVOS:
1.1. Comprender los principios básicos de las operaciones unitarias utilizadas en

el proceso previo y posterior a la transesterificación.
1.2. Obtener biodiesel a partir de aceite de origen vegetal por transesterificación.
1.3. Explicar la importancia de la obtención de biodiesel como alternativa
energética.
2. MARCO TEÓRICO:
La creciente demanda energética mundial, el agotamiento y elevado costo de los

combustibles fósiles y el cambio climático son problemas que deben ser
solucionados con urgencia. Para mitigar estos problemas, se debe ampliar la matriz
energética utilizando fuentes renovables para la obtención de biocombustibles.
El Biodiesel es un biocombustible que está constituido por ésteres de metilo de

ácidos grasos de cadena larga derivado de diversos tipos de aceite de origen
animal, vegetal, microbiano e incluso de microalgas, por transesterificación para ser
utilizado como sustituto o aditivo del diesel convencional
El termino bio hace referencia a su naturaleza renovable y biológica en contraste
con el combustible diesel tradicional derivado del petróleo; por su parte, diesel
alude a su uso en motores de este tipo.
El biodiesel es un líquido amarillo ámbar claro con una viscosidad similar al diesel de
petróleo. Con el punto de inflamación de 150 °C, el biodiesel no es inflamable ni
explosivo.
El diésel y el biodiésel, a lo largo de todo su ciclo de vida, producen cantidades

similares de CO2. La gran diferencia radica en que la mayor parte del CO 2 emitido
por el segundo ha sido fijado previamente por las plantas oleaginosas utilizadas
para su producción, que a lo largo de su vida han consumido mayor cantidad de
CO2 que la que emitirán una vez convertidas en biodiesel. Incluso, diversos estudios
señalas que el biodiesel emite finalmente, menos CO2 que el fijado mediante el
proceso de fotosíntesis por estas mismas plantas oleaginosas. Por ello, es posible
afirmar que sustituyendo o complementado diesel con el biodiesel se poder ayudar a
combatir uno de los principales efectos del uso de combustibles fósiles: el problema
del cambio climático.
El biodiésel, al ser un combustible oxigenado y no contener azufre, tiene una

combustión más completa que su antecesor y, por ello, una composición
notoriamente mejor en sus emisiones. Asimismo, el biodiesel, aun usado en mezclas
de solo 10% por 90% de diesel convencional, reduce notablemente las emisiones de
monóxido de carbono (CO), óxidos de azufre (SOx), compuestos aldehídicos como
el formaldehido y acetaldehído y, prácticamente, elimina las emisiones de benceno,
que es un peligroso compuesto cancerígeno. La combustión del biodiesel produce
menos humo visible y menos olores desagradables que su antecesor derivado del
petróleo, por lo que su uso como sustituto o complemento del diesel puede
contribuir a disminuir la polución del aire y los riesgos a la salud pública
relacionados con ello.
3. MATERIALES:
3.1. Insumos:
Aceite de origen vegetal o usado.
3.2. Recativos:
Etanol.
Hidroxido de potasio.
Metanol.

Beakers, 250 mL.
Bureta, 10 mL.
Matraces, 250 mL.
Pera de decantacion.
Probetas, 100 mL.
Termómetro.
3.4. Otros:
Agitador magnético.
Espátulas.
Picetas.
Pinzas.
Soporte universal.
3.5. Equipos:
Balanza analítica.
Hotplate.
4. METODOLOGÍA:
4.1. Preparación de la materia prima:

Eliminar los sólidos gruesos y finos por sedimentación, filtración y
centrifugación.
Determinar la humedad de la materia prima y si es necesario, proceder
al secado.
Determinar la acidez de la muestra por titulación.
4.2. Transesterificación:
Preparar el metóxido y añadir a la materia prima.

Calentar la mezcla a 50 ºC por 60 minutos.
Reposar por 8 horas.
Separar y caracterizar los productos obtenidos.
Reportar las condiciones del proceso de transesterificación.

Reportar el volumen de biodiesel y glicerina obtenido
Reportar las características de los productos obtenidos (pH, color, aspecto)
7. CONCLUSIONES:
8. SUGERENCIAS:
9. CUESTIONARIO:
Describe el DSP para la obtención de biodiesel a partir de microalgas.

¿Cuáles son las ventajas de la producción de biodiesel a partir de microalgas
oleaginosas en vez del cultivo de plantas terrestres?
Describe los métodos para caracterizar fisicoquímicamente el biodiesel.
Investiga sobre los países de Latinoamérica que producen biodiesel como alternativa
de energía renovable. Describe brevemente las actividades que realizan.
10. BIBLIOGRAFÍA:
11. ANEXOS:
PRACTICA Nº 12.
DESTILACIÓN SIMPLE, AL VACÍO Y POR ARRASTRE DE VAPOR
1. OBJETIVOS:
1.1. Comprender los principios básicos de la destilación como operación unitaria.

1.2. Aplicar la destilación simple en la separación y purificación de etanol a partir
de un producto fermentado.
1.3. Aplicar la destilación a presión reducida en el secado al vacío de un producto
termolábil.
1.4. Aplicar la destilación por arrastre de vapor en la obtención de aceites
esenciales.
2. MARCO TEÓRICO:
Destilación es una operación unitaria de separación y purificación de los

componentes de una mezcla liquida o las disoluciones de dos o más líquidos por
vaporización parcial de la misma y condensación del vapor generado.
Es un proceso que consiste en calentar un líquido hasta que sus componentes más
volátiles pasan a la fase de vapor y, a continuación, enfriar el vapor para recuperar
dichos componentes en forma líquida por medio de la condensación.
El objetivo principal de la destilación es separar una mezcla de varios componentes
aprovechando sus distintas volatilidades, o bien separar los materiales volátiles de
los no volátiles y así, obtener el componente más volátil en forma pura.
Destilación simple:
Se aplica en la separación de líquidos con punto de ebullición inferior a 150ºC.
Implica la separación de impurezas no volátiles solubles e insolubles y de aquellos
líquidos cuyos puntos de ebullición difieren extraordinariamente en
aproximadamente 25 °C.
Se trabaja de forma discontinua en una sola etapa, la sustancia impura se calienta
en un recipiente hasta que sus componentes más volátiles se evaporan, los vapores
producidos son inmediatamente canalizados hacia un condensador hasta obtener el
producto destilado.
Destilación al vacío:
El punto de ebullición de las sustancias varía en relación directa con la presión. La
relación entre la presión aplicada y la temperatura de ebullición de un líquido está
determinada por su comportamiento presión de vapor-temperatura. Un líquido
alcanza su punto de ebullición cuando su presión de vapor iguala a la presión
atmosférica o de operación, por lo tanto, al reducir la presión de operación, la
temperatura de ebullición disminuirá.
Muchos líquidos orgánicos no pueden ser destilados a presión atmosférica debido a
que se descomponen al llegar a su punto de ebullición o por debajo de éste, esto es
frecuente en compuestos con punto de ebullición superior a 150 ºC, estas
sustancias se purifican o separan por una destilación a presión reducida para evitar
su descomposición. En otros casos se prefiere la destilación al vacio por el ahorro en
el suministro de energía.
Destilación por arrastre de vapor:

Se utiliza para separar aceites, sustancias insolubles en agua y literalmente volátiles
de otros productos no volátiles. Se aplica principalmente para la obtención de
productos naturales. En el proceso de destilación predomina un sistema de dos
fases inmiscibles a lo largo de la destilación.
Destilación fraccionada:
Si la diferencia que hay entre los puntos de ebullición es demasiado pequeña para
que una destilación simple resulte eficiente, es necesario recurrir a destilaciones
repetidas. Se trabaja en forma continua con una columna fraccionadora, a través de
la cual la fase de vapor y la fase condensada fluyen en direcciones opuestas. La
eficiencia de tales columnas se expresa en platos teóricos, definido como la unidad
de la columna que tiene la misma eficacia en la separación que una destilación
simple y se expresa a menudo en cm de altura de la columna. Se utiliza una
columna de fraccionamiento entre el recipiente que calienta la sustancia y el
condensador, desde el piso inferior el vapor asciende por los distintos niveles
formados por platos teóricos donde tienen lugar sucesivas evaporaciones y
condensaciones de la mezcla en función del punto de ebullición; en los platos
inferiores quedan retenidos los líquidos menos volátiles, y en los superiores los más
volátiles.
3. MATERIALES:
3.1. Material vegetal:

Flores, hojas, corteza, frutos o semillas de plantas aromáticas.
3.2. Insumos:
Muestra termolábil.
Producto fermentado.

Equipo de destilación simple.
Equipo de destilación al vacío.
Equipo de destilación por arrastre de vapor.
Probetas, 100 mL.
3.4. Otros:
Agitador magnético.
Conectores.
Espátulas.
Papel filtro.
Picetas.
Pinzas.
Soporte universal.
3.5. Equipos:
Balanza analítica.
Bomba al vacío.
Hotplate.
4. METODOLOGÍA:
4.1. Destilación simple:
Destilar el etanol de un producto fermentado.
4.2. Destilación al vacío:
Secar al vacío un producto termolábil.
4.3. Destilación por arrastre de vapor
Obtener aceites esenciales a partir de material vegetal.
Montar los diferentes equipos de destilación e identificar sus partes.
Registrar la temperatura a la cual se inicia la destilación en cada tipo de destilación.

Reportar el volumen de destilado obtenido en cada tipo de destilación.
Reportar las condiciones de cada tipo de destilación.
¿Qué aceite esencial está presente en la materia prima utilizada?
Graficar en el eje de las abscisas el tiempo vs en el eje de las ordenadas la
humedad en base seca o húmeda del producto termolábil.
7. CONCLUSIONES:
8. SUGERENCIAS:
9. CUESTIONARIO:
¿Por qué las fracciones de destilado se dividen en cabeza, cuerpo y cola?

¿Explica cómo optimizar el proceso de destilación?
¿Qué son los aceites esenciales? Enumera y describe las principales aplicaciones de
10 aceites esenciales.
Diseña un diagrama de flujo para la obtención de un producto en el cual se utiliza la
destilación simple, al vacío o por arrastre de vapor como operación unitaria.
Investiga sobre las empresas de destilación que existen en nuestro país, describe
brevemente el rubro al que se dedican.
10. BIBLIOGRAFÍA:
11. ANEXOS:
BIBLIOGRAFÍA
1. Acevedo BF, Gentina MJ. Fundamentos y perspectivas de las tecnologías

Biomineras. Chile: Ediciones universitarias de Valparaíso; 2005.
2. Aehle W. Enzymes in Industry: Production and Applications. Third Edition.

Germany: WILEY-VCH; 2007.
3. Flickinger M. Downstream Industrial Biotechnology: Recovery and Purification

USA: John Wiley & Sons; 2013.
4. Jaqnow G, Dawid W. Biotecnología. Introducción con experimentos Modelo.

España: Editorial Acribia; 2000.
5. Misari F. Biolixiviación. Tecnología de la Lixiviación bacteriana de minerales. 1era

Ed. Perú: OSINERGMIN; 2016.
6. Renneberg R. Biotecnología Para Principiantes. España: Editorial Reverté; 2008.

7. Smith J. Biotecnología. España: Editorial Acribia; 2006.
8. Thieman W, Palladino M. Introduction to Biotechnology. Third Edition. USA:

Pearson Education; 2013.
9. Wankat P. Ingeniería De Procesos De Separación. 2da Edición. México: Editorial

Pearson Educación; 2008.

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