Pencegahan Asma oleh Lactobacillus Rhamnosus pada Model

Mencit Berhubungan dengan Sel T CD4+ CD25+ FoxP3

Seong-Ok Jang, Ha-Jung Kim, Young-Joon Kim, Mi-Jin Kang, Ji-Won Kwon, Ju-Hee Seo, Hyung Young Kim,
Byoung-Ju Kim, Jinho Yu, Soo-Jong Hong

Tujuan: Bakteri probiotik dapat memicu regulasi omun atau toleransi imun pada penyakit alergi.
Mekanisme dibaliknya telah diteliti baru-baru ini, tetapi masih belum jelas. Tujuan penelitian ini adalah
untuk menilai efek protektif probiotik Lactobacillus rhamnosus (Lc35) pada model mencit asma dan
mengidentifikasi mekanisme aksinya. Metode: Lcr35 dibeirkan setiap hari melalui rute oral pada dosis
1x109 CFU/Mencit pada Mencit BALB/c selama 7 hari sebelum sensitisasi pertama. Parameter klinis dan
sel T regulatorik (Treg) juga dinilai. Peran dari sel Treg CD4+CD25+Foxp3+ dianalisis menggunakan antibody
monoclonal anti-CD25 penurun sel Treg (mAb). Hasil: Hiperresponsitifitas jalan nafas, total produksi IgE,
Inflamasi eosinofilik paru, dan proliferasi limfosit limpa tersupresi setelah perlakuan Lcr35. Sitokin Th1
(IFN-y) dan Th2 (IL-4,IL-5,dan IL-3) pada serum telah tersupresi, dan prosentase sel Treg CD4+CD25+Foxp3+
pada limpa meningkat signifikan pada kelompok perlakuan Lcr35. Pemberian anti-CD25 mAb menurunkan
efek protektif Lcr35, mengindikasikan bahwa sel Treg CD4+CD25+Foxp3+ penting dalam mengatur aktivitas
Lcr35. Kesimpulan: Pemberian oral Lcr35 meringankan ciri-ciri asma alergi pada model mencit dan
memicu regulasi imun oleh mechanisme yang dimediasi sel Treg CD4+CD25+Foxp3+.

Kata Kunci: Asma; probiotik; mencit; Limfosit-T; Regulatorik.

Pendahuluan diduga secara umum bahwa efek

Probiotik adalah mikroorganisme non patogenik
yang memberikan manfaat kesehatan pada
penjamu dengna meningkatkan keseimbangan
microflora usus dan mungkin dengan cara
mengatur pertahanan penjamu. Beberapa
penelitian telah mencirikan kemampuan strain
probiotik untuk mempengaruhi produksi sitokin
pada usus dan jaringan limfoid yang terkait,
memperagakan efek immunomodulatorik dari
beberapa penyakit alergi. Perlakukan probiotik
yang berhasil pada model asma hewan telah
dilaporkan baru-baur ini, dan kami menemukan
bahwa perlakuan Lactobacillus rhamnosus oral
(Lcr35) sebelum sensitisasi alergi dapat
meringankan peradangan jalan nafas dan
hiperreaktifitas apda model mencit inflamasi
jalan nafas alergi. Walau demikian, efek
bermanfaat dari probiotik terhadap
perkembangan asma alergi dan rhinitis alergi
pada uji klinis manusia masih kontroversial.
Walaupun terdapat hasil yang bertentangan,
immunomodulatorik dari probiotik terhadap
penyakit alergi adalah daerah penelitian yang
menjanjikan.
Sejumlah penelitian telah mensugesti bahwa
sitokin immunosupresif Interleukin-10 (IL-10)
dan transforming growth factor (TGF)-b bersama
dengan sel T regulatorik (Treg) adalah
mekanisme utama dimana probiotik mensupresi
peradangan alergi. Walau demikian, terdapat
beberapa penelitian mekanistik aktivitas
probiotik pada penyakit alergi. Pada penelitian
ini, kami bertujuan untuk mengkonfirmasi
terlibatnya sel Treg untuk efek protektif lcr35
pada model mencit asma alergi.
Bahan dan Metode
Mencit
Mencit BALB/c dengan berat badan 20-25 g
(berumur 4 minggu) dibeli dari Orient Bio dan
diberi perlakukan sesuai guideline Komite
perawatan dan penggunaan hewan (IACUC)
pada pusat medis Asan dan Ulsan University
College of Medicine.
Persiapan probiotik
Lcr35 yang digunakan di penelitian ini didapat
dari laboratorium Lyocentre, dan dikultur pada
broth steril Lactobacillus MRS di suhu 37OC
selama 24 jam. Setelah kultivasi, sel
dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 5,000 x g
selama 10 menit, dicuci dua kali dengan saline
buffered fosfat/Phosphate buffered saline(PBS),
dan di-liofilisasi. Bubuk yang diliofilisasi diberi
ulang saline steril sebelum penggunaan.
Penetapan Asma Alergi dan perlakuan
probiotik
Mencit BALB/c berumur enam minggu (N=7 per
kelompok) disensitisasi melalui pemberian
intraperitoneal (ip) ovalbumin (OVA; 10 ug,
grade V) dan campuran alum (2,25 mg). Satu
minggu setelah sensitisasi, campran diberikan
kedua kalinya. Tujuh hari kemudian, mencit
menghirup 1% OVA melalui sprayer ultrasonic
selama 30 menit sehari selama 3 hari berturut-
turut. Mencit mendapat lcr35 (1x109 colony-
forming units/600 ul/mencit/hari) secara oral
dari satu minggu sebelum sensitisasi primer
hingga titik akhir penelitian. Kontrol negative
mendapat hanya saline, bukan OVA pada kedua
sensitisasi dan tantangan jalan nafas. Kontrol
positif tidak mendapat apa-apa lagi setelah
sensitisasi OVA
Penilaian klinis in vivo
Hiperresponsitifitas jalan nafas/Airway
Hyperresponsiveness (AHR) terhadap metakolin
yang dihirup, diberikan 24 jam setelah tantangan
OVA, diukur pada mencit yang sadar dan tidak
ditahan menggunakan plethismograf whole-
body. Sekilas, mencit diletakkan pada ruangan
while-body, dan pembacaan basal didapat
selama 3 menit dan dirata-rata. Saline dengan
aerosol diikuti oleh 5-50mg/ml MeCh dihirup
selama 3 menit setelah setiap inhalasi MeCh.
Sel Treg diturunkan menggunakan antibody
monoclonal anti-CD25 (mAb). Sekilas, mencit
mendapat 250 ug CD25 mAb anti-mencit i.p.
pada 400 ul saline normal satu hari sebelum 1%
tantangan OVA. Mencit control diinjeksi dengna
250 ug IgG1 tikus.
Lavase bronkoalveolar
Setelah pengukuran AHR, mencit dianestesi oleh
pemberian i.p. ketamine-xylazine, dan trakea
langsung dipaparkan. Jalan nafas dilavase
melalui kanul trakeal, dua kali dengan 1 ml
aliqueot saline bebas pyrogen yang dihangatkan
ke 37OC. Cairan lavase yang didapat
dikumpulkan, dan sel dikumpulkan oleh
sentrifugasi (5,000 rpm, 4OC, 5 menit) dan
diresuspensi pada 100 ml PBS dingin. Sel
diwarnai dengan tripan blue untuk menentukan
viabilitas, total sel ternukleasi dihitung
menggunakan hemositometer.
Untuk hitung sel BAI differential, preparasi
sitospin dibuat dan diwarnai dengan Diff-Quik.
Setelah sampel dikoding, semua preparasi
sitospin dinilai oleh satu pengamat
menggunakan mikroskop imersi minyak
(pembesaran x 1000). Setidaknya 200 sel
dihitung per preparasi, dan jumlah absolut setiap
tipe sel telah dihitung.
Analisis serum Ig
Serum didapat dari darah yang diambil saat
ekstrasanguinisasi mencit setelah pengukuran
jalan nafas, dan 100 Ul (1/10 dilusi pada buffer
karbonat-bikarbonat) diberikan pada setiap
sumur piringan 96-well. Suatu enzyme linked
immunosorbent assay (ELISA) spesifik IgE
digunakan untuk mengkuantifikasi total IgE pada
serum, menggunakan pasangan antibody yang
cocok menurut instruksi pabrik. Untuk ELISA,
piringan 96-well pertama-tama dilapisi
sepanjang malam dengan IgE ant-menti (10 ul
pada 100 ul PBS), igG1 anti-mencit (20 ug pada
100 Ul PBS), atau igG2a anti mencit (20 ug pada
100 uL PBS). Tempat pengiaktan sisa diblok, dan
piringan diinkubasi dengan 100 uL serum yang
terdilusi (1:5 untuk igE, 1:10 untuk IgG1 atau
IgG2a). Setelah piringan dicuci, diinkubasi, dan
dibersihkan melalui mencuci: OVA (1ug / 100 ul),
ig anti-OVA kelinci terlabel peroksidase (240
ng/100 Ul), dan larutan 3,3,5,5
tetrametilbenzidine. Densitas optic diukur pada
450 nm dan kadar Ig ditentukan relatif terhadap
serum referensi dari mencit BALB/c yang
tersensitisasi OVA ( Diberikan nilai 100 unit
eksperimental/ml). Penentuan dilakukan dalam
duplikat.
Assay Sitokin
Preparat komersil dari antibody berpasangan
dan standar protein untuk pengukuran mencit
IL-4, IL-5, IL-3 Dan IFN-y pada serum digunakan
untuk mengembangkan ELISAs menurut
petunjuk pabrik. Penentuan dilakukan dalam
duplikat.
Assay proliferasi sitokin
Setelah BAL, limpa mencit direseksi. Splenosit
mencit dipisahkan pada gradien Histopaque, dan
sel yang dikoleksi dicuci dengna PBS. RBCs dilisis
dengan cara mencampur sel dengan lembut
dengan 3,6 ml 0,24% NaCL selama 20 detik,
diikuti dengan pemberian cepat 0,3 ml 8,7%
NaCL dan dilusi lebih lanjut dengan PBS. Pellet
disuspensi pada medium Dulbecco termodifikasi
Iscove (IMDM), dan disimpan sepanjang malam
pada suhu 4OC. Di pagi setelahnya, sel
disentrifugasi pada 4OC, disuspensi pada PBS
dingin, diwarnai dengan tripan blue, dan
dihitung menggunakan hemositometer.
Sel T limpa dikultur pada IMDM yang
disuplementasi dengan HEPES 25 Mm, 10%
serum fetal sapi/Fetal Bovine Serum (FBS)
terinaktivasi suhu, 60 mg/L (100 U/ml) penisilin,
100 mg/L streptomisin, dan 0,29 g/L L-glutamin.
Sel T limpa dissuaikan menjadi 1x105sel/200
Ul/sumur, ditransfer ke piringan 96-sumur, dan
diinkubasi pada 37OC pada incubator CO2 5%
yang dilembabkan selama 72 jam. Sel distimulasi
dengan perlakuan OVA (100 ug/ml) selama 72
jam. Pada jam ke-12 sebelum akhir inkubasi, 1
uCi dari H2-timidin diberikan ke setiap sumur. Sel
dipanen ke filter microfiber felas, dan
radioaktivitas diukur pada hitung skintilasi cair.
Onkorporasi selama 12 jam terakhir kultur
(hitung per menit) digunakan sebagai indeks
proliferasi. Semua kultur diuji dalam triplikat.
Flow Cytometry
Sel Treg mencit didapat dari limpa dan dianalisis
untuk ekspresi CD4+CD25+Fop3+ menggunakan
kit perawrnaan sel Treg mencit yang
mengandung anti-CD4 terlabel FITC, anti-CD25
yang terlabel APC, dan anti-Foxp3 yang terlabel
Pe menurut instruksi pabrik. Sekilas, sel yang
dipreparasi (1x106) dicuci dnenga sentrifugasi
dengan PBS dingin, diresuspensi pada 1 ml
larutan fiksasi/permeabilisasi, dan diinkubasi
dalam kegelapan pada 4OC selama 30-60 menit.
Sel dicuci setelah buffer 2 ml permeabilisasi,
dicatat oleh sentrifugasi, diresuspensi pada 20
ml agen pengahmabt dengan 2% (2 ml) serum
mencit normal pada buffer permeabilisasi dan
diinkubasi pada suhu 4OC selama 15 menit.
Selanjutnya, 20 ml antibody terkonjugasi
fluorokrom atau control isotype pada buffer
permeabilisasi ditambahkan, diikuti oleh
inkubasi di kegelapan pada 4OC selama 30 menit.
Akhirnya, sel dicuci dengan 2 ml buffer
permeabilitasi, diresuspensi pada buffer flow
cytometry (PBS dengan 2% FBS), dan dianalisis
menggunakan flow cytometry menggunakan
FACSalibur dengan software CellQuest.
Penentuan dilakukan dalam duplikat.
Histopatologi paru-apru
Untuk setiap penilaian histologi dari jaringan
paru, paru kiri dari setiap mencit
ditenggelamkan dalam parafin, dipotong
menadji ketebalan 5 um, dan diwarnai dengan
hematoksilin dan eosin (H&E) untuk menilai
infiltrasi eosinofilik. Peradangan dinilai oleh dua
pengamat indenden, blinded. Derajat inflamasi
peribronkial dan perivascular dinilai pada skala
subjektif 0-3, seperti yang dideskripsikan.
Infiltrasi seluler pada lima daerah yang
ditentukan secara acak dinilai dibawah
mikroskop Axiophot Zeiss (pembesaran, x100;
Carl Zeiss inc.).
Analisis Statistik
Kami menganalisis hubungan antar kelompok
dan control positif menggunakan uja Mann-
Whitney. Data diekspresikan sebagai error
standar+- rata-rata. Semua analisis statistic
dilakukan menggunakan SPSS versi 18.0 untuk
Windows. Nilai P < 0,05 mengindikasikan
signifikansi
Efek perlakukan Lcr35 terhadap eosinophilia
maksimal Penh dan jalan nafas.
Pemberian Lcr35 terhadap menict alergi secara
signifikan mensupresi AHR, sampai kadar
kelompok control negative pada dosis
maksimum MeCH (Kontrol negative: 4,72 +-
2,19; Perlakuan-Lcr35: 4,75+- 1,56; control
positif: 9,00 +- 2,87; P <0,01).
Mencit yang diberi perlakuan Lcr35
menunjukkan supresi signifikan hitung sel total
cairan BAL dibandingkan dengan control positif
(perlakuan Lcr35: 4,77 x 105 sel/ml; control
positif: 8,29 x 105 sel/ml; p < 0,05). Pemberian
oral Lcr35 secara signifikan menurunkan jumlah
eosinophil pada cairan BAL dibandingkan dengan
control positif (Perlakuan Lcr35: 3,79 +- 0,29%;
control positif: 13,60 +- 3,00%; P<0,05)
Peradangan paru setelah inhalasi OVA berkurang
signifikan setelah pemberian oral Lcr35
(Perlakuan Lcr35L 2,16 +- 0,55; control positif:
0,92+- 0,52; P <0,05). Pemeriksaan jaringan paru
untuk mencit control positif menunjukkan
infiltrate peribronkial dan perivaskuler;
Perlakuan lcr35 menghasilkan penurunan
infiltrasi seluler dan perubahan inflamatorik,
seperti yang ditemukan pada histopatologi.
Maka, perlakuan Lcr35 menghambat
peradangan paru yang dipicu alergen, termasuk
influx eosinophil.
Mekanisme efek Lcr35 terhadap respon alergi.
Pemberian Lcr35 secara signifikan menurunkan
kadar IgE total dibandingkan dengan control
positif, tetapi tidak mempunyai efek signifikan
terhadap igE, IgG1, atau IgG2a spesifik OVA.
Serum IL-4, IL-5, dan IL-13 menurun signifikan
dengan lcr35 yang diberikan secara oral. Kadar
IFN-y juga berkurang pada mencit yang diberi
perlakuan Lcr35, tetapi perbedaannya tidak
signifikan. Hasil ini mensugesti bahwa perlakuan
Lcr35 mensupresi sitokin dependen Th2.
Proliferasi yang dipicu OVA lebih rendah
signifikan pada mencit yang diberi perlakuan
Lcr35 dibandingkan dengan mencit control
positif. Maka, Lcr35 secara efektif menginhibisi
respon sel T splenik spesifik OVA.
Perlakuan LCR35 berujung ke peningkatan
signifikan sel Treg CD4+CD25+FoxP3+,
dibandingkan dengan prosentase pada mencit
kontorl positif (Perlakuan Lcr25: 17,6 +- 0,49%;
control positif 15,2 +- 0,44%; P < 0,05). Hal ini
mensugesti bahwa atenuasi yang dipicu Lcr35
respon alergi pada model mencit asma
berhubungan dengan peningkatan populasi sel
Treg CD4+CD25+Foxp3+. Untuk emngkonfirmasi
keterlibatan sel Treg CD4+CD25+Foxp3+, depresi
sel Treg dicapai dengan perlakuan CD25 mAb.
Perlakuan anti-CD25 mAb sebelum tantangan
OVA meningkatkan signifikan AHR pada dosis
maksismum MeCH, dibandingkan dengan AHR
pada mencit yang diberi perlakuan Lcr35 (Yang
diberi perlakuan anti-CD25: 8,16 +- 1,63; Yang
diberi perlakuan Lcr35: 3,30 +- 0,57; P <0,05).
AAIR
Mencit IgG control isotip tidak mempunyai
pengaruh terhadap AHR. Perlakuan anti-CD25
juga menurunkan signifikan populasi sel Treg
CD4+CD25+Foxp3+. Pada mencit yang diberi
perlakuan Lcr35 (Perlakuan anti-CD25: 1,00 +-
0,08%; Perlakian Lcr-35: 15,53 +- 0,10%; P<0,05).
Hasil ini mensugesti bahwa sel Treg CD4+
CD25+FoxP3+terlibat dalam supresi AHR yang
diatur oleh pemberian oral Lcr35.
Skor peradangan paru juga lebih tinggi signifikan
pada mencit Lcr35 yang diberi perlakuan mAb
anti-CD25 dibandingkan dengan mencit yang
diberi perlakuan Lcr-35 yang tidak mendapat
mAb anti-CD25 (Perlakuan anti-CD25: 2,28 +-
0,19; Perlakuan Lcr35: 1,32 +- 0,20; P < 0,01).
Pemeriksaan histopatologi menemukan
penungkatan peradangan eosinofilik pada paru
dari mencit lcr35 yang diberi anti-CD25
dibandingkan dengan mencit Lcr35 yang tidak
diberi anti-CD25 mAb. Data mengindikasikan
bahwa pemberian anti-CD25 memutarbalikkan
efek dari perlakukan Lcr35 oral dari peradangan
paru dan sel Treg mengatur efek Lcr35.
Pembahasan
Penelitian ini meneliti efek dari lcr35 oral
terhadap model mencit asma alergi. Temuan
utama adalah bahwa lcr35 mensupresi
parameter alergi, termasuk AHR, peradangan
jalan nafas, dan total IgE, dengan dara mengatur
aktivitas sel Treg CD4+CD25+Foxp3+. Selebihnya,
efek ini dibalik dengan cara pemberian mAb anti-
CD25.
Efek probiotik terhadap sitokin Th1 masih
kontroversial, karena probiotik tampak
mempromosi, menghambat, dan bisa tidak
berpengaruh terhadap produksi sitokin Th1.
Pada penelitian kami, kadar serum sitokin Th2
bekrurang oleh perlakuan Lcr35, diamna kadar
sitoin Th1 tidak menurun signifikan. Kami tidak
menentukan kadar sitokin pada organ target
atau cairan BAL; terdapat keterbatasan dari
penelitian ini.
Untuk menguji hipotesis ini, jumlah sel Treg
CD4+CD25+Foxp3+ pada limpa telah dinilai. Kadar
sel Treg lebih tinggi signifikan setelah perlakuan
Lcr35. Eksaserbasi asma setelah depresi Treg
memperagakan pentingnya sel Treg padal efek
protektif Lcr35. Hal ini mensugesti bahwa sel
Treg terlibat dalam perlindungan yang diberikan
oleh Lcr35 oral pada model mencit asma. Walau
demikian, mekanisme potensial lain seperti
sitokin immunosupresif (IL-10 dan TGF-b) tidak
dinilai. Sepengetahuan kami, ini adalah
penelitian pertama yang mengidentifikasi
mekanisme aksi probiotik menggunakan deplesi
sel Treg CD4+CD25+Foxp3+ pada model mencit
asma.
Beberapa laporan telah mensugesti bahwa
keterlibatan dari sel Treg natural yang berasal
dari Thymus mengekspresikan Foxp3 dan CD25
dalam hal toleransi alergen, mungkin tidak
terjadi, dan ekspresi Foxp3 dan CD25 pada sel
Treg masih kontroversial. Penelitian lebih lanjut
dibutuhkan untuk mengkonfirmasi mekanisme
dibalik efek protektif Lcr35. Banyak penelitian
telah mencoba untuk mengidentifikasi
mekanisme aksi probiotik pada penyakit alergi.
Beberapa penelitian mengimplikasi bahwa
terdapat aktivtitas sel Treg dalam aktivitas
probiotik, tetapi penelitian ini tidak meneliti
perubahan pada respon inflamasi setelah deplesi
sel Treg. Penelitian kami penting karena
mengkonfirmasi hipotesis penelitian
sebelumnya bahwa sel Treg berkontribusi dalam
efek protektif probiotik.
Pemberian oral Lcr35 sepenuhnya menghambat
proliferasi spesifik OVA pada sel T limpa di
penelitian inii. Hal ini mensugesti bahwa Lcr35
mengatur respon imun sistemik pada mencit
yang disensitsasi dan ditantang OVA. Pemberian
oral probiotik memicu sel dendritik regulatorik,
yang mempromosikan munculnya sel Treg
CD4+Foxp3+ pada nodus limfe mesenteric. Sel
Dendritik dapat secara langsung memberikan
antigen dari bakteri komensal ke nodus limfe
mesenteric dan berinteraksi dengan sel T dan sel
B untuk mempertahankan respon imun non-
inflammatorik.
Kontras terhadap infiltrasi eosinofilik masif pada
daerah peribronkial dan perivaskuler mencit
control positif. Hewan yang diberi perlakuan
lcr35 menunjukkan peradangan eosinofilik yang
kurang secara signifikan. Hal ini bersamaan
dengan produksi menurun sel yang berasal dari
Th2 IL-4, IL-5, da IL-13 pada kelompok perlakuan
Lcr35.

Tedapat bukti kuat mengimplikasikan sel Treg

CD4+CD25+ dalam pengendalian penyakit alergi.
Sebagai contoh, transfer sel Treg CD4+CD25+ ke
mencit tersensitisasi menurunkan AHR,
peradangan eosinofilik, dan induksi sitokin Th2
pada paru, dalam sifat dependen IL-10. Telah
diperacaya secara laus bahwa deplesi mAb anti-
CD25 berujung ke deplesi cepat dan efisien sel
Treg CD4+CD25+, dan hal ini telah dikonfirmasi
dengan pewarnaan sekunder dengan mAb yang
diarahkan melawan epitop CD25 yang berbeda.
Penelitian sebelumnya telah menunjukkan
bahwa jumlah sel Treg CD4+CD25+ berkurang
signifikan dalam waktu 3 hari perlakuan mAb
anti-CD25, tetapi telah kembali ke kadar normal
pad ahari ke-10. Maka, pada penelitian ini, kami
memberikan mAb anti-CD25 sehari sebelum
tantangan OVA. Sesuai dengan yang diharapkan,
efek anti-alergi Lcr35menghilang, dan populasi
sel Treg CD4+CD25+ bekrurang signifikan. Hal ini
memperagakan bahwa efek bermanfaat dari
Lcr35 terhadap asma alergi pada mencit diatur
oleh sel Treg CD4+CD25+Foxp3+.

Kesimpulannya, kami memperagakan bahwa

supresi respon alergi dan immunomodulasi dari
probiotik Lcr35 pada model mencit asma diatur
oleh aktivitas sel Treg CD4+CD25+Foxp3+.