INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

INGENIERÍA EN SISTEMAS AMBIENTALES

PRÁCTICA 3,4,5,6 y 7

“CINETICA ENZIMATICA”
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

EQUIPO NO. 1 SECCION: 1 Grupo: 4AV1

 Alcántara Campos Daniel

 Aparicio Almazán Brenda Guadalupe

PROFESOR(ES):

 QFI Roció del Carmen Guzmán Ibarra

 M. en C. Pedro Antonio Loyola Abitia
 Dra. Doris Neri Cortés
 Dr. Carlos Wong Baeza

FECHA DE ENTREGA: 12 de Abril del 2018

INTRODUCCIÓN.

Las enzimas son moléculas de naturaleza

proteica, que catalizan una gama amplia de
reacciones biológicas. Estas moléculas aumentan
considerablemente la velocidad de reacción,
disminuyendo la energía de activación y
facilitando la transformación de sustrato en uno
o varios productos.

Las enzimas poseen una selectividad a un

sustrato específico y la actividad de éstas se
puede modificar con diversos factores como la
temperatura, el pH, la concentración de la enzima Fig.1 Reacción entre una enzima y su sustrato.
y del sustrato, utilizando inhibidores, etc.

La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas y las condiciones que las
modifican, así como sus mecanismos de reacción.

Azúcares reductores se define como aquellos azúcares que presentan un grupo carbonilo intacto, y que a través
de este pueden reaccionar y reducir, en determinadas condiciones, a las sales cúpricas.

La velocidad de una reacción puede ser modificada por factores como:

 La temperatura: La velocidad de una reacción enzimática varía al aumentar la temperatura. Esto es, la
velocidad de una reacción enzimática se incrementa al aumentar la temperatura dentro de un
determinado rango, alcanzando un valor máximo a la denominada temperatura óptima. A valores
superiores la actividad disminuye debido a que la enzima, como cualquier otra proteína, sufre procesos
de desnaturalización y, por lo tanto, de inactivación.
 El pH: Todas las enzimas poseen un valor de pH óptimo en el cual la actividad es máxima; por encima o
por debajo de este pH la actividad disminuye bruscamente. Los efectos son: desnaturalización proteica,
cambio en la ionización de grupos de residuos de aminoácidos implicados en la catálisis, cambio en la
ionización de grupos del sustrato, modificación en la afinidad de la enzima y el sustrato.
 La concentración de enzima: La velocidad de una reacción enzimática es directamente proporcional a la
concentración de la enzima a cualquier concentración de sustrato. Cuando aumenta la cantidad de
enzima, las moléculas actuarán independientemente en solución para transformar más sustrato en un
intervalo de tiempo.
 La concentración de moléculas de sustrato: Una enzima funciona de manera más eficiente cuando la
concentración de sustrato está en exceso en relación con la concentración de enzima. Esto se debe a que
las colisiones exitosas con el reactivo son más frecuentes, asegurando así que la mayor cantidad de
enzima se encuentre activa
 La presencia de inhibidores: Una de las formas de regulación de la actividad de una enzima es a través
de moléculas que disminuyen su velocidad de reacción, llamadas inhibidores

Equipo 1. Cinética Enzimática Página 1

OBJETIVOS.

1. Determinar el efecto de la variación del pH sobre la velocidad de la reacción catalizada por la invertasa.
2. Demostrar que la velocidad de la reacción enzimática es directamente proporcional a la concentración
de enzimas.
3. Demostrar que las reacciones enzimáticas son afectadas por la temperatura.
4. Calcular el valor de la energía de activación de la reacción catalizada por la invertasa.
5. Demostrar que la velocidad de la reacción enzimática es directamente proporcional a la
concentración de enzima.
6. Observar el efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción.
7. Determinar la constante de Michaelis-Menten por los métodos conocidos, así como su
aplicación.

RESULTADOS.

P.4 Efecto del pH sobre la velocidad de reacción

Se realizo procedimiento para observar el efecto del pH en la velocidad de reacción de hidrolisis de la

sacarosa por la enzima invertasa.

Fig.2 Reacción de hidrolisis de sacarosa con enzima invertasa.

Tabla 1. EFECTOS DEL pH SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCION

Absorbencia μM AR Vo (VI) pH

0 0.1169 0.01169 3
0.385 8.9063 0.89063 4.5
0.574 13.2214 1.3221 5
0.432 9.9794 0.99794 6.5
0.199 4.6598 0.46598 7.5
Fig.3 Serie de tubos antes de leer en espectrofotómetro.

Equipo 1. Cinética Enzimática Página 2

El valor que se obtiene de la lectura de absorbencia en cada tubo corresponde a un valor específico de
concentración de micromoles de azúcar reductor producido por la acción de la enzima invertasa. Dicho valor de
concentración es calculado al interpolar los valores de absorbencia de esta práctica con los obtenidos en la
practica 2 Curva Tipo de Azucares Reductores, donde la gráfica obtenida corresponde a una tendencia lineal
entre los valores de absorbencia y concentración de azúcares reductores [AR], la ecuación empírica
correspondiente es la siguiente:

[𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎] = [(0.0438)(μM AR/2ml)] − 0.0051

Despejamos (μM AR/2ml) y utilizamos la siguiente ecuación para obtener nuestras concentraciones:

𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 + 0.0051
= μM AR/2ml
0.0438

Finalmente, para calcular la velocidad en Unidades de Invertasa (U.I.) se aplica la siguiente formula:

μM AR/2ml
𝑉𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 (𝑈. 𝐼. ) = .
10

1.4 1.3221

1.2
0.99794
1 0.89063

0.8
VO (UI)

0.6 0.46598

0.4
y = -0.1947x2 + 2.1467x - 4.6924
0.2 R² = 0.9595
0.01169
0
3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8
-0.2
PH

Grafica 1. Velocidad inicial de reacción de la reacción de hidrolisis de sacarosa en función del pH.
En la Grafica 1 se observa el efecto del pH sobre la velocidad inicial de reacción de hidrolisis de sacarosa
comprobando que la enzima invertasa trabaja bajo ciertas condiciones, pasando el limite la actividad enzimática
desciende hasta desnaturalizar la enzima como se observa en el valor más alto de pH donde la velocidad bajo
considerablemente 0.46598 UI.

Todas las enzimas tienen un valor de pH óptimo en el cuál su actividad es máxima, la invertasa presenta esta
actividad máxima con pH a 4.5, en la gráfica se observa la mayor actividad en pH de 5 con la mayor velocidad de
reacción 1.3221 UI, siendo un valor aceptado de pH optimo ya que la zona en forma de campana muestra el
rango óptimo y la zona máxima de la actividad de la invertasa, en el lado izquierdo de la campana, de forma
ascendente se encuentra el pH subóptimo y en el lado derecho se observa un declive, que indica que la actividad
de la invertasa disminuye después del valor óptimo, debido a la ionización y a cambios estructurales en la enzima
y el sustrato.

Equipo 1. Cinética Enzimática Página 3

Las enzimas, al ser moléculas de naturaleza proteica, están susceptibles a los cambios de pH, el cuál puede influir
en las interacciones iónicas de la proteína. Las enzimas poseen un sitio activo, el cual es específico para un
sustrato, y en él actúan una serie de residuos de aminoácidos que, al sufrir una protonación o una desprotonación
pueden cambiar su arreglo espacial y ya no tener la afinidad por el sustrato o no permitir la unión entre la enzima
y el sustrato.

P5. Efecto de la concentración de enzima sobre velocidad de reacción

Se desarrollo procedimiento para observar el efecto de la concentración de enzima sobre la reacción de hidrolisis
de la sacarosa con invertasa

TABLA 2. RESULTADOS OBTENIDOS DE VELOCIDAD DE REACCIÓN CON DIFERENTES

CONCENTRACIONES DE ENZIMA.
Absorbencia μM AR/2ml Vo (VI) µg Enzima/2ml

0.055 1.3732 0.1372 1

0.181 4.2512 0.42512 2

0.439 10.1443 1.01443 3

0.534 12.3143 1.23143 4

0.784 18.0247 1.80247 5

0.952 21.8620 2.18620 6

Fig.4 Serie de tubos antes de leer con espectrofotómetro

Para calcular la concentración de enzima utilizamos la siguiente ecuación

10μ𝑔 𝐸𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 1𝑚𝑙

X 0.1 (tubo 1) tiene 2ml.

2.5
2.1862

2 1.80247

1.5
1.23143 y = 0.417x - 0.3266
VO UI

1.01443 R² = 0.9898
1

0.42512
0.5
0.1372

0
1 2 3 4 5 6
ΜG ENZIMA/2ML

Grafica 2. Velocidad inicial en función de la concentración de la enzima

Equipo 1. Cinética Enzimática Página 4

En esta experiencia (Grafica 2), se observa el efecto que tiene la concentración de la enzima sobre la velocidad
de reacción de hidrolisis de la sacarasa con invertasa. La velocidad de la reacción enzimática va a estar
condicionada por la concentración de la enzima, debido a que cuando se presentan más moléculas de este
catalizador biológico en solución que contiene sustrato, cada molécula va a actuar independientemente y van a
transformar una mayor cantidad de sustrato en productos, en una menor cantidad de tiempo. Si la concentración
de enzima se eleva al doble, la velocidad lo hará también, así respectivamente. Se observa la mayor velocidad
2.18620 en la mayor concentración de enzima 6 µg /2ml.

Gráficamente se observa un comportamiento ascendente, con tendencia lineal, que muestra claramente que, al
aumentar la concentración de enzima de 1 a 6 6 µg /2ml, aumenta la velocidad de reacción de 0.1372 a 2.18620.
Por lo tanto: La concentración de enzima es directamente proporcional a la velocidad de la reacción. Este
comportamiento ascendente va a estar condicionado igualmente por la concentración del sustrato, debido a que
mientras exista sustrato en solución la velocidad aumentará (por la concentración de enzima), en tanto que, si
ya no hay sustrato para la reacción, la velocidad va a descender de una manera brusca.

P6. Efecto de la concentración del sustrato e inhibidor sobre la velocidad de reacción.

Se desarrollaron 2 procedimientos para observar el efecto de la concentración de sustrato y presencia de

inhibidor sobre la reacción de hidrolisis de la sacarosa con invertasa.

Tabla 4. Resultados obtenidos en diferentes concentraciones de sustrato e inhibidor analina

sobre la velocidad de reacción.
[SUSTRATO] CONCENTRACION DEL INHIBIDOR

Absorbencia μM AR/2ml Vo (U.I) Absorbencia μM AR/2 ml Vo (U.I.) [S] (mM)

0.055 1.3721 0.13721 0.036 0.9383 0.09383 5

0.075 1.8288 0.18288 0.052 1.3036 0.13036 10

0.101 2.4224 0.24224 0.081 1.9657 0.19657 15

0.253 5.8927 0.58927 0.187 4.6141 0.46141 30

0.338 7.8333 0.78333 0.250 5.8242 0.58242 50

0.425 9.8196 0.98196 0.368 8.5183 0.851883 80

Para calcular la concentración de sustrato se realizaron los siguientes cálculos:

0.2 moles Sac. 1000ml

X 0.05m

X= 1x10-5 moles Sac.2 ml

X 1000ml

X= 5x10-3M= 5mM

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 1.2

0.8 y = 0.4698ln(x) - 0.029

R² = 0.7841
VO UI

0.6

y = 0.3961ln(x) - 0.0482
0.4 R² = 0.769

0.2

0
5 10 15 30 50 80
[S]MM

sin inhibidor con inhibidor Log. (sin inhibidor) Log. (con inhibidor)

BIBLIOGRAFÍA.

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