Influencia Excipientes em Sist Conservantes PDF

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PRISCILA DE OLIVEIRA SCHMITT
INFLUÊNCIA DE EXCIPIENTES FARMACÊUTICOS SOBRE A

EFICÁCIA DE SISTEMAS CONSERVANTES
Itajaí
2015
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
PRISCILA DE OLIVEIRA SCHMITT

Dissertação submetida à Universidade do Vale do

Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção
do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Alexandre Bella Cruz

Co-orientadora: Profa. Dra Ruth Meri Lucinda da
Silva
Itajaí (SC)
agosto de 2015
FICHA CATALOGRÁFICA
S56i Schmitt, Priscila de Oliveira, 1987-

Influência de excipientes farmacêuticos sobre a eficácia de sistemas
conservantes / Priscila de Oliveira Schmitt, 2015.
91f. ; il.; fig.; quad.
Anexos, Apendice
Cópia de computador (Printout(s)).

Dissertação (Mestrado) Universidade do Vale do Itajaí,
Mestrado em Ciências Farmacêuticas.
“Orientador: Prof . Dr. Alexandre Bella Cruz ”
“Co-orientadora: Profª Drª Ruth Meri Lucinda da Silva”
Bibliografia: p. 77-84
1. Conservantes Farmacêuticos. 2. Excipientes Farmacêuticos.

3. Conservantes. 4. Eficácia – Testes. 5. Efetividade Antimicrobiana.
I. Título.
CDU: 615.1
Josete de Almeida Burg – CRB 14.ª 293
CDU: 612.78
Dedicatória
A Deus, minha família, amigos, colegas de trabalho e orientadores

pelo apoio, força, incentivo, companheirismo e amizade.
Sem eles nada disso seria possível.
AGRADECIMENTOS
A minha família por me amparar nos momentos difíceis, me dar força para superar
as dificuldades, mostrar o caminho nas horas incertas e me suprir em todas as
minhas necessidades. O meu amor eterno.
Ao meu marido Leandro pelo amor, paciência e companheirismo que foram

fundamentais para o meu sucesso nessa caminhada.
Ao meu orientador Alexandre e co-orientadora Ruth pelos conhecimentos

adquiridos, confiança, paciência, atenção e amizade.
As professoras Tania e Angélica pelas contribuições desde o começo, quando esta

dissertação ainda era um projeto.
As minhas amigas e profissionais Daniela, Melissa, Sabrina, Amanda, Helen, Laís,

Eliziane e Ana Flávia pelo grande apoio e disposição em ajudar nessa realização.
Aos meus amigos que sempre estiveram ao meu lado nessa jornada, me apoiando e
entendendo meus momentos de ausência.
A todos os professores do mestrado que de alguma forma contribuíram para a minha

formação, em especial para a professora Rosana Bella Cruz.
Aos funcionários da UNIVALI, em especial os funcionários da secretaria e vigilantes

pelo suporte acadêmico, sempre dispostos e prestativos.
A Deus que está comigo em todos os momentos, me carregando e iluminando

quando falta forças e me protegendo todos os dias.
“Faça o melhor que puder. Seja o melhor que puder.
O resultado virá na mesma proporção do seu esforço."
Renato Russo
Priscila de Oliveira Schmitt

Ago/2015
Orientador: Alexandre Bella Cruz, Doutor.

Co-orientadora: Ruth Meri Lucinda da Silva, Doutora.
Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas.
Número de Páginas: 91.
Devido a natureza dos excipientes que as compõem, as formulações farmacêuticas

são particularmente susceptíveis à contaminação microbiana. Falhas nas medidas
preventivas e/ou de controle de processos durante a fabricação e armazenamento
podem resultar em produtos inadequados ao consumo. Sabe-se que os
conservantes são usados para aumentar a vida útil dos produtos, porém sua eficácia
pode ser comprometida por interações com os excipientes interferindo na sua
solubilidade e/ou disponibilidade, fazendo com que sua concentração não alcance a
ação antimicrobiana desejada. O presente estudo teve como objetivo avaliar a
influência de excipientes farmacêuticos na eficácia dos conservantes utilizados em
formulações semissólidas. A metodologia consistiu na inoculação de população
conhecida de cinco suspensões diferentes de micro-organismos patogênicos, em
misturas com os excipientes óleo de rícino hidrogenado polietoxilado [ALKEST ®
CSO 400 H (A)], polissorbato [Tween® 80 (T)], carboximetilcelulose sódica (CS) e
goma xantana (GX), todos em diferentes concentrações com a mesma quantidade
pré-fixada de sistemas conservantes metilparabeno (M), Phenonip ® (P), Verstatil® BP
(BP) e Verstatil® PC (PC). Após a análise da eficácia das misturas excipiente-
conservante, os conservantes foram adicionados em micro e namoemulsão. Os
estudos de influência dos tensoativos não iônicos A e T na ação antimicrobiana dos
sistemas conservantes mostraram que o M e o P foram inativados independente da
concentração, o BP foi eficaz em todas as condições testadas, exceto para Candida
albicans a 40 g/L, enquanto PC se mostrou eficaz somente para o Aspergillus niger,
C. albicans e Escherichia coli. Os sistemas conservantes foram eficazes frente ao
fungo e a levedura quando na presença de CS, porém sem eficácia frente à
Staphylococcus aureus. Os conservantes incorporados em GX também foram
eficazes para o fungo e a levedura e, na presença das bactérias, os conservantes P
e PC foram inativados. Os conservantes M e BP incorporados em formulações
nanoemulsionadas foram eficazes somente para o A. niger. O sistema conservante
P mostrou-se eficaz quando incorporado nas formulações, exceto para C. albicans.
Os resultados demonstram que embora a ação conservante esteja descrita na
literatura, o potencial de inativação mostrou depender do tipo de excipiente, da
composição dos sistemas conservantes, da proporção entre excipiente e
conservante e da disponibilidade destes na formulação.
Palavras-chave: Conservantes. Controle de qualidade microbiológico. Teste de

Eficácia.
THE INFLUENCE OF PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS ON THE
EFFECTIVENESS OF PRESERVATIVE SYSTEMS.
Priscila de Oliveira Schmitt

Aug/2015
Supervisor: Alexandre Bella Cruz, Doctor.

Co-supervisor: Ruth Meri Lucinda da Silva, Doctor.
Concentration Area: Natural Products and Bioative Synthetic Substances.
Number of pages: 91.
Due to the nature of the excipients that compose them, pharmaceutical formulations
are particularly susceptible to microbial contamination. Failures in preventive
measures and/or process control during manufacture and storage can result in
products that are unfit for consumption. It is known that preservatives are used to
increase the shelf life of products, but their effectiveness can be compromised by
interactions with excipients that interfere in their solubility and/or availability, so that
their concentration does not achieve the desired antimicrobial effect. This study
aimed to evaluate the influence of pharmaceutical excipients in the effectiveness of
preservatives used in semi-solid formulations. The methodology consisted of
inoculating the known population with suspensions of five different pathogenic micro-
organisms, in mixtures with the excipients polyethoxylated hydrogenated castor oil
[ALKEST® CSO 400 H (A)], polysorbate [Tween® 80 (T)], carboxymethylcellulose
sodium (CS) and xanthan gum (GX), all at different concentrations with the same
prefixed amount of preservative systems methylparaben (M), Phenonip ® (P)
Verstatil® BP (BP) and Verstatil® PC (PC). After analyzing the efficacy of the
excipient-preservative mixtures, the preservatives were added in micro and
namoemulsion. Studies of the influence on the nonionic surfactants A and T on the
antimicrobial action of the preservative systems showed that M and P were
inactivated, independent of concentration; the BP was effective in all the tested
conditions, except for Candida albicans at 40 g/L, while PC was effective only for
Aspergillus niger, C. albicans and Escherichia coli. The preservative systems were
effective against fungus and yeast in the presence of CS, but ineffective against
Staphylococcus aureus. The preservatives incorporated into GX were also effective
for fungi and yeast, and in the presence of bacteria, the preservatives P and PC had
its antimicrobial actions inactivated. The preservatives M and BP incorporated into
nanoemulsioned formulations were effective only for A. niger. Preservative system P
was effective when incorporated into the formulations, except for C. albicans. The
results demonstrate that although the preservative action is described in the
literature, the potential for inactivation depended on the the type of excipient, the
composition of the preservative systems, the ratio of excipient to preservative, and
their availability in the formulation.
Keywords: Preservatives. Microbial quality control. Challenge test.

LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Etapas da produção e respectivas estratégias para garantir a

qualidade microbiológica de preparações farmacêuticas..................... 26
Figura 2 Estrutura molecular dos parabenos...................................................... 32
Figura 3 Estrutura molecular do fenoxietanol..................................................... 34
Figura 4 Estrutura molecular do Tween® 80………………………………………. 41
Figura 5 Estrutura molecular da carboximetilcelulose sódica............................ 42
Figura 6 Estrutura molecular da goma xantana................................................. 42
Figura 7 Efeito da redução do crescimento microbiano em UFC/mL na
combinação entre conservante metilparabeno (M) (0,2%) e
Phenonip® (P) (0,2%) e os tensoativos não iônicos ALKEST ® CSO
400 H (A) e Tween® 80 (T) nas concentrações (5, 10, 20 e 40 g/L),
frente aos cinco micro-organismos testes, após 28 dias de
incubação.............................................................................................. 58
combinação entre conservante Verstatil® BP e PC (0,5%) e os
tensoativos não iônicos ALKEST® CSO 400 H (A) e Tween® 80 (T),
nas concentrações (5, 10, 20 e 40 g/L), frente aos cinco micro-
organismos testes, após 28 dias de incubação.................................... 61
combinação entre os conservantes metilparabeno (M) (0,2%),
Phenonip® (P) (0,2%), Verstatil® BP e PC (0,5%) e
carboximetilcelulose sódica nas concentrações 2 e 4 g/L, frente aos
cinco micro-organismos testes após 28 dias de
incubação.............................................................................................. 63
combinação entre conservante metilparabeno (M) (0,2%) e
Phenonip® (P) (0,2%) e goma xantana, nas concentrações (1, 3, 5 e
7 g/L), frente aos cinco micro-organismos testes, após 28 dias de
incubação.............................................................................................. 65
combinação entre conservante Verstatil® BP e PC (0,5%) e goma
xantana nas concentrações (1, 3, 5 e 7 g/L), frente aos cinco micro-
organismos testes, após 28 dias de incubação.................................... 67
Figura 12 Testes de eficácia do conservante metilparabenos (M) na
concentração de 0,2% em micro e nanoemulsão, frente aos cinco
micro-organismos testes....................................................................... 70
Figura 13 Testes de eficácia do conservante Verstatil® BP (BP) na
concentração de 0,5% em micro e nanoemulsão, frente aos cinco
micro-organismos testes....................................................................... 71
Figura 14 Testes de eficácia do conservante Phenonip ® (P) na concentração
de 0,2% em micro e nanoemulsão, frente aos cinco micro-
organismos
testes.................................................................................................... 73
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 Exemplos de micro-organismos e suas prováveis fontes de

contaminação........................................................................................ 26
Quadro 2 Exemplos de conservantes farmacêuticos comumente utilizados e
seus prováveis modos de ação............................................................ 29
Quadro 3 Exemplos de conservantes permitidos para produtos cosméticos
com a máxima concentração autorizada.............................................. 31
Quadro 4 Solubilidade dos parabenos em água e coeficiente de partição
óleo:água.............................................................................................. 33
Quadro 5 Alguns solventes e a solubilidade do Fenoxietanol.............................. 34
Quadro 6 Tamanho e aspecto dos componentes dos sistemas emulsionados.... 39
Quadro 7 Principais conservantes utilizados na indústria cosméticas e seus
inativantes............................................................................................. 48
Quadro 8 Condições para reconstituição das cepas de micro-organismos para
o estudo de eficácia do conservante.................................................... 49
Quadro 9 Composição das formulações emulsivas.............................................. 53
Quadro 10 Categoria de produtos e critérios para a eficácia antimicrobiana......... 54
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 21
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 23
2.1 Objetivo Geral .......................................................................................... 23
2.2 Objetivos Específicos ............................................................................. 23
3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 25
3.1 Contaminação microbiana ...................................................................... 25
3.2 Sistema Conservantes ............................................................................ 28
3.2.1 Parabenos ....................................................................................................... 31
3.2.2 Fenoxietanol ................................................................................................... 34
3.2.3 Outros conservantes...................................................................................... 35
3.3 Cosméticos .............................................................................................. 36
3.4 Excipientes farmacêuticos em produtos semissólidos ................. 39
3.4.1 Tensoativos ................................................................................................. 40
3.4.2 Macromoléculas ................................................................................. 41
3.5 Interações entre conservantes e demais excipientes .................... 43
3.6 Teste de Eficácia de Conservantes – Challenge test ...................... 45
3.6.1 Micro-organismos testes ................................................................... 45
3.7 Neutralização do Sistema Conservante ........................................... 47
4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 49
4.1 Seleção de conservantes e excipientes para o estudo ....................... 49
4.2 Micro-organismos padrões..................................................................... 49
4.2.1 Preparação do inóculo ......................................................................... 50
4.2.1.1 Bactérias ...................................................................................................... 50
4.2.1.2 Fungos leveduriformes ............................................................................... 50
4.2.1.3 Fungos filamentosos .................................................................................. 50
4.3 Análise de compatibilidade entre conservantes e excipientes........... 51
4.4 Análise de eficácia dos conservantes incorporados em formulações
emulsivas (micro e namoemulsão) .............................................................. 52
4.4.1 Formulações ................................................................................................... 52
4.4.2 Inoculação dos micro-organismos padrões ................................................ 53
4.4.3 Contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) ........................... 54
4.5 Categoria de produto, critérios para a eficácia antimicrobiana e
análise dos resultados .................................................................................. 54
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 57
5.1 Análises de compatibilidade entre conservantes e excipientes ........ 57
5.2 Teste de Eficácia do Sistema Conservante – Teste do Desafio ......... 68
6 CONCLUSÕES ..................................................................................................... 75
REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 77
ANEXO A ................................................................................................................. 85
APÊNDICE A............................................................................................................ 87
APÊNDICE B ............................................................................................................ 88
APÊNDICE C ............................................................................................................ 89
APÊNDICE D ............................................................................................................ 90
APÊNCIDE E ............................................................................................................ 91
21
1 INTRODUÇÃO
A qualidade microbiológica de produtos constitui um dos atributos essenciais

para o seu desempenho adequado, principalmente em relação à segurança, eficácia
e aceitabilidade. Nos últimos anos houve um crescimento na fabricação de produtos
farmacêuticos, com ênfase para os cosméticos e medicamentos, sendo uma das
razões o aumento da expectativa de vida da população, o que tem levado ao maior
consumo de produtos cosméticos, bem como de medicamentos. Outro fator
relevante é o aumento do consumo dos produtos farmacêuticos por uma maior
parcela da população brasileira (DANA, 2013).
O aumento do consumo e consequente crescimento dos setores de
cosméticos e medicamentos demanda maior cumprimento, pelo setor produtivo, das
boas práticas de fabricação e atendimento às especificações de qualidade a fim de
garantir a qualidade, segurança e eficácia do produto final, o que muitas vezes exige
contínua inovação e investimento no desenvolvimento de novos insumos e
processos (LIZÁRRAGA, 2014).
Falhas nas medidas preventivas e de controle de processos de fabricação
podem resultar em produtos inadequados ao consumo. A contaminação microbiana
tem sido um dos problemas mais importantes da indústria cosmética, pois estes
produtos são reconhecidos por serem substratos para a sobrevivência e
desenvolvimento de uma ampla variedade de micro-organismos, já que possuem
alguns nutrientes que facilitam o crescimento (MOAT; FOSTER, 1988; YAMAMOTO
et al., 2004; HERRERA, 2004). As principais fontes de contaminação microbiana são
a água e as matérias-primas de origem natural. A água é muitas vezes a matéria-
prima utilizada em maior volume na produção cosmética (PARKER, 2005; PAYNE,
2007; ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE COSMETOLOGIA, 2014).
No processo de fabricação de formulações semissólidas deve haver o
cumprimento das Boas Práticas de Fabricação (BPF), para que sejam fabricados de
forma consistente com a qualidade apropriada para minimizar a possibilidade de
contaminação (RODFORD, 1997; PINTO; KANEKO; OHARA, 2003; PARKER, 2005;
VILLANOVA; SÁ, 2009). Esses produtos precisam ser preservados com a presença
de conservantes que aumentam a vida útil dos produtos, impedindo o
desenvolvimento de bactérias, fungos filamentosos e leveduriformes que podem
22
causar doenças ou simplesmente produzir enzimas oxidativas e/ou hidrolíticas

capazes de promover modificações nas características físicas, químicas e
farmacológicas (CAVALCANTI, 2008).
Há muitos fatores relacionados às formulações que afetam a ação do
conservante, como o pH do produto, a absorção pelo material de acondicionamento,
o coeficiente de partição, a presença de tensoativos e agentes umectantes, a
temperatura de fabricação e estocagem, que podem afetar a concentração inicial do
conservante (SANTOS, 2007).
Em função desses fatores, torna-se imprescindível que o teste de eficácia de
conservante seja seguido para cada tipo de formulação com a finalidade de
assegurar a confiabilidade e um menor índice de contaminação microbiana. Neste
contexto, os testes poderão ser estabelecidos com base na Farmacopeia Brasileira
(BRASIL, 2010), que descreve os parâmetros e os micro-organismos que devem ser
utilizados no teste.
Desse modo, o objetivo do presente trabalho foi conhecer as concentrações
de excipientes (Alkest®, Tween® 80, carboximetilcelulose sódica e goma xantana)
que afetam a atividade dos agentes antimicrobianos (parabenos e livre de
parabenos) bem como as possíveis interações entre conservantes e outros
componentes de formulações farmacêuticas semissólidas (micro e nanoemulsões).
23
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Estudar a influência de excipientes farmacêuticos na eficácia dos

conservantes (parabenos e livres de parabenos) utilizados em formulações
semissólidas.
2.2 Objetivos Específicos
- Identificar o efeito de tensoativos não iônicos (ALKEST® CSO 400 H e

Tween® 80) na eficácia dos conservantes com parabenos (metilparabeno e
Phenonip®) e livres de parabenos (Verstatil® BP e PC);
- Identificar o efeito entre conservantes parabenos (metilparabeno e
Phenonip®) e livres de parabenos (Verstatil® BP e PC) e macromoléculas (goma
xantana e carboximetilcelulose sódica);
- Realizar teste de eficácia dos conservantes em formulações emulsivas
(micro e nanoemulsão).
24
25
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Contaminação microbiana
A contaminação microbiana tem sido um dos problemas mais importantes da

indústria cosmética, pois estes produtos são reconhecidos por serem substratos
para a sobrevivência e desenvolvimento de uma ampla variedade de micro-
organismos, já que possuem alguns nutrientes que facilitam o crescimento, tais
como: lipídios, polissacarídeos, álcoois, proteínas, aminoácidos, glicosídeos,
esteroides, peptídeos e vitaminas. Bactérias, bolores e leveduras são capazes de se
multiplicarem em produtos farmacêuticos aquosos quando as condições adequadas
de oxigenação, valor de pH, temperatura, grau osmótico, atividade superficial,
perfume, óleos essenciais estão disponíveis (HERRERA, 2004; MOAT; FOSTER,
1988).
O controle de qualidade para produtos não estéreis deve assegurar que a
carga microbiana presente, tanto no aspecto qualitativo quando no quantitativo, não
comprometa a qualidade final do cosmético e a segurança do usuário. Cargas
microbianas elevadas comprometem a estabilidade do produto, uma vez que o
fármaco pode ser degradado, o pH da formulação pode ser alterado e a aparência
pode ser prejudicada (VILLANOVA; SÁ, 2009).
Morse, et. al. (1967) já afirmava que um produto contaminado por micro-
organismos apresenta um risco potencial à qualidade do produto e à saúde do
consumidor. A contaminação acarreta, entre outras alterações, a separação das
fases emulsionadas, mudança de coloração, pois alguns micro-organismos
produzem pigmentos ou ácidos que alteram o pH e afetam os próprios pigmentos
adicionados à formulação, formação de odores, em virtude da produção de
compostos sulfurados responsáveis pelo odor desagradável e liberação de gases,
em função do metabolismo microbiano.
Para atingir um nível aceitável e seguro de qualidade microbiana nos produtos
cosméticos é imprescindível possuir o conhecimento das fontes e mecanismos
responsáveis por esta contaminação (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE
COSMETOLOGIA, 2014). Os micro-organismos constituem uma parte integrante do
nosso ambiente e podem ser encontrados no ar, no solo e na água (PARKER,
26
2005). Muitos fatores contribuem para o grau de contaminação presente em

preparações farmacêuticas, desde a matéria-prima até o envase do produto final. No
quadro 1 e na figura 1 estão listados os micro-organismos mais comumente
relacionados como fonte de contaminação e aspectos da manufatura higiênica.
A fonte de contaminação da matéria-prima depende da sua origem.
Clostridium spp são encontradas em talcos, a Salmonella spp e Coliformes em
produtos de origem animal e vegetal.
Quadro 1: Exemplos de micro-organismos e suas prováveis fontes de contaminação.

Micro-organismos Fonte de contaminação
Pseudomonas spp, Xantomonas spp, Flavobacterium
spp, Achromobacter. Água
Esporos de fungos Penicillium spp, Mucor spp,
Aspergillus spp, leveduras. Esporos bacterianos: Ar
Bacillus spp, e Micrococos.
Clostridium spp; Salmonella spp; Coliformes. Matéria-prima
Coliformes, Staphylococcus spp, Streptococcus spp Pessoal
Fonte: PARKER, 2005.
Figura 1: Etapas da produção e respectivas estratégias para garantir a qualidade microbiológica de

preparações farmacêuticas.
Fonte: PARKER, 2005.

27
A capacidade do micro-organismo promover o processo de deterioração

depende da sua capacidade em produzir enzimas adequadas, e o risco maior, no
caso de produtos cosméticos, reside na extrema versatilidade de rotas bioquímicas
dos micro-organismos, possibilitando a síntese de enzimas degradativas.
Dependendo da natureza das moléculas, das características do produto, do número
e tipo de organismos, o processo degradativo pode demandar horas, meses ou
mesmo anos (PINTO; KANEKO; PINTO, 2015).
Diversos estudos da década de 60 e 70 relataram o isolamento de micro-
organismos patogênicos em matérias-primas e produtos manufaturados
farmacêuticos. Esses estudos mostraram a necessidade de um melhor controle de
qualidade microbiológica, que durante o processo de fabricação do produto deve ser
executado com o cumprimento das Boas Práticas de Fabricação (BPF), enfatizando
o princípio de que os produtos sejam fabricados de forma consistente com a
qualidade apropriada para minimizar a possibilidade de contaminação. O uso pode
contribuir para o crescimento microbiano no produto, quando a forma de
administração e armazenamento incorretos pelo consumidor (PARKER, 2005;
PINTO; KANEKO; PINTO, 2015; RODFORD, 1997; VILLANOVA; SÁ, 2009).
As regulamentações acerca das BPF são estabelecidas pelas agências
regulatórias, como a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) para
assegurar que padrões mínimos de qualidade sejam seguidos na produção de
produtos farmacêuticos. As empresas brasileiras devem atender os requisitos legais
estabelecidos pelas RDC 48/2013 (cosméticos e produtos de higiene), RDC
67/2007 e RDC 87/2008 (BPM em farmácias magistrais) e RDC 17/2010
(medicamentos) incluindo todo o processo produtivo de controle de qualidade,
sistema de água, produção, envase, entre outros (BRASIL, 2013; BRASIL, 2007;
BRASIL, 2008; BRASIL, 2010).
As principais fontes de contaminação microbiana são a água e as matérias-
primas de origem natural. A água é muitas vezes a matéria-prima utilizada em maior
volume na produção cosmética, contaminando o produto diretamente da água de
processo ou indiretamente através da limpeza ou por contaminação cruzada das
áreas molhadas de pisos, pias e ralos dos equipamentos utilizados durante o
processo (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE COSMETOLOGIA, 2014; PARKER,
2005; PAYNE, 2007). Micro-organismos que podem ser isoladas a partir de sistemas
de água industrial são do tipo Pseudomonas, Achromobacter ou Alcaligenes
28
(PARKER, 2005; ONADIPE, 2007). As formulações como emulsões, géis,

suspensões ou soluções são mais suscetíveis à contaminação por conter água em
sua formulação (ANVISA, 2004).
As matérias-primas constituídas de pó sintético, geralmente possuem uma
baixa contaminação, porém aquelas de origem natural podem conter elevadas
cargas microbianas, necessitando de tratamento prévio reduzir ou eliminar estar
contaminação (PINTO; KANEKO; PINTO, 2015; PARKER, 2005). Outros aspectos
podem tornar as condições ideais para o crescimento microbiano em formulações
farmacêuticas, como pH neutro (PINTO; KANEKO; PINTO, 2015).
Com o conhecimento dos fatores envolvidos na contaminação microbiana, é
possível obter uma proteção adicional mediante a inclusão de conservantes na
formulação como uma forma de combater o crescimento de micro-organismos no
produto (PARKER, 2005; PINTO; KANEKO; PINTO, 2015).
3.2 Sistema Conservantes
Um agente antimicrobiano corresponde a um produto químico natural ou

sintético que mata ou inibe o crescimento de micro-organismos. Agentes que matam
organismos são denominados de biocidas. Agentes que não matam, mas apenas
inibem o crescimento, são denominados de biostáticos (MADIGAN; MARTINKO;
PARKER, 2004).
Os conservantes utilizados em cosméticos são substâncias empregadas para
prevenir a contaminação microbiana (agentes biostáticos) e manter a integridade do
produto farmacêutico durante o período de vida útil ou de prateleira, bem como na
fase de sua utilização pelo consumidor, além de proteger o consumidor de uma
potencial infecção. Esta prevenção é importante, pois o cosmético entra em contato
constante com o ambiente e a pele humana (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE
COSMETOLOGIA, 2014; SOUZA; OHARA; SAITO, 1994; VARVARESOU et al.,
2009).
Os conservantes interferem no crescimento microbiano, na multiplicação e no
metabolismo por meio de um ou mais dos seguintes mecanismos (ALLEN JUNIOR;
POPOVICH; ANSEL, 2013):
- modificação da permeabilidade da membrana celular e perda dos
constituintes da célula (lise parcial);
29
- lise e ruptura citoplasmática;

- coagulação irreversível dos constituintes citoplasmáticos (precipitação de
proteínas);
- inibição do metabolismo celular, como a interferência em sistemas
enzimáticos ou a inibição da síntese da parede celular;
- oxidação dos constituintes celulares;
- hidrólise.
No Quadro 2 são apresentados exemplos de conservantes e seus prováveis
mecanismos de ação.
Quadro 2 – Exemplos de conservantes farmacêuticos comumente utilizados e seus prováveis modos

de ação.
Conservantes Prováveis modos de ação
Ácido benzoico,
Ácido bórico, Desnaturação de proteínas
p-hidroxibenzoatos
Ação lítica e desnaturação sobre
membranas citoplasmáticas e para os
Fenois e compostos fenólicos clorados
conservantes clorados, também pela
oxidação de enzimas
Álcoois Ação lítica e desnaturação de membrana
Compostos quaternários Ação lítica sobre as membranas
Fonte: ALLEN JUNIOR; POPOVICH; ANSEL, 2013.
As preparações líquidas e semissólidas que oferecem excelente meio de

crescimento para micro-organismos são na maioria aquosas, necessitando, portanto,
de um sistema conservante para garantir a estabilidade e segurança das fórmulas
farmacêuticas não estéreis (ALLEN JUNIOR; POPOVICH; ANSEL, 2013; PINTO;
KANEKO; PINTO, 2015).
Os conservantes possuem grupos funcionais reativos que precisam ser
considerados quando forem utilizados na formulação do produto cosmético. É
necessário um conhecimento de todos os componentes do produto e por estudos de
pré-formulação apropriados para determinar a propensão de interação e seleção do
sistema conservante (ALLEN JUNIOR; POPOVICH; ANSEL, 2013; ELDER;
CROWLEY, 2012).
30
A correta escolha do conservante visando garantir que a formulação seja um

“ambiente hostil” aos micro-organismos é baseada em alguns fatores. O tipo de
preparação e a eficácia exigida do sistema de conservação são os critérios
primários. Outros aspectos devem ser considerados durante a formulação como a
contaminação mais frequente, solubilidade em água para atingir a concentração
adequada na fase aquosa de um sistema com duas ou mais fases, a proporção de
conservante que permanece não dissociada no pH da formulação, a concentração
necessária para não afetar a segurança e o conforto do usuário, a estabilidade
durante o prazo de validade da preparação, a compatibilidade com todos os
componentes da formulação e sua interação com a embalagem do produto acabado
(DOORNE, 2007; VILLANOVA; SÁ, 2009; ALLEN JUNIOR; POPOVICH; ANSEL,
2013).
Na escolha do conservante um aspecto a ser considerado é a
regulamentação do uso de substâncias de ação conservante permitidas (Quadro 3).
No Brasil, a lista de conservantes permitidos para produtos de higiene pessoal,
cosméticos e perfumes consta na Resolução RDC 29 de 1º de junho de 2012. A
regulamentação varia de país para país como por exemplo na comunidade europeia
é a diretiva para cosméticos 76/768 EEC que apresenta as mais de 60 substâncias
ativas. O Japão é o país com lista mais restritiva (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE
COSMETOLOGIA, 2014).
Apesar de muitas desvantagens aparentes, a utilização de conservantes
químicos permanece durante o tempo e é a única forma eficaz de garantir a
qualidade microbiológica de preparações farmacêuticas ao longo da vida de
prateleira e utilização. É importante entender os fatores que afetam a atividade de
agentes antimicrobianos, como o pH da formulação e conhecer as possíveis
interações entre conservantes e outros componentes de formulações farmacêuticas
(DOORNE, 2007). Se os componentes da formulação interferirem na solubilidade ou
na disponibilidade do conservante, sua concentração química pode se tornar
ineficaz, uma vez que não é a medida verdadeira da concentração efetiva (ALLEN
JUNIOR; POPOVICH; ANSEL, 2013).
31
Quadro 3 – Exemplos de conservantes permitidos para produtos cosméticos com a máxima

concentração autorizada.
Conservante Máxima concentração autorizada
2-metil-4-isotiazolina-3-ona
0,01%
(metilisotiazolinona)
1,3-Dimetilol-5,5- dimetilhidantoína
0,6%
(DMDM hidantoína)
2-Fenoxietanol (fenoxietanol) 1,0%
0,4% (expresso como ácido) individual;
Ácido 4-hidroxibenzoico, seus sais e
0,8% (expresso como ácido) para
ésteres (parabenos)
misturas de sais ou ésteres.
Imidazolinidil ureia 0,6%
Ácido benzoico e respectivo sal de sódio

0,5%
(benzoato de sódio)
Fonte: ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE COSMETOLOGIA, 2014; BRASIL, 2012.
3.2.1 Parabenos
Os parabenos estão entre os conservantes mais usados em produtos

cosméticos (FDA, 2007). Quimicamente, são ésteres de alquil de ácido para-
hidrobenzoico, inodoros, incolores e insípidos (Figura 2) (FIB, 2011). As
regulamentações do Brasil, RDC 29/2012 permite o uso de no máximo 0,4% de cada
parabeno e um máximo de 0,8% de parabeno total, no produto cosmético (BRASIL,
2012). Uma gama de produtos pode conter parabenos, que incluem as maquiagens,
hidratantes, produtos para o cabelo, produtos de barbear, entre outros (FDA, 2007).
Os parabenos incluem metilparabeno, etilparabeno, propilparabeno,
butilparabeno, isopropilparabeno, isobutilparabeno e benzilparabeno (Figura 2). Os
parabenos são eficazes em várias faixas de pH e possuem um largo espectro de
ação antimicrobiana, embora sejam mais eficazes contra bolores e leveduras. Eles
também são mais ativos contra bactérias Gram-positivas do que contra as bactérias
Gram-negativas (ROWE; SHESKEY; QUINN, 2009).
Podem ser encontrados no mercado na forma isolada como Nipagin®,
Nipasol®, Phenonip®, Phenova®, entre outros.
32
Figura 2: Estrutura molecular dos parabenos.
Fonte: CEZAR, 2014.
A atividade antimicrobiana é proporcional ao comprimento da cadeia do grupo

alquil, característica esta indesejável do ponto de vista de solubilidade em água. Por
esta razão, os ésteres de ácido p-hidroxibenzoico de peso molecular menor são os
mais utilizados. Já a ligação éster é estável à hidrólise em temperatura de
esterilização, característica desejável (LÜCK; JAGER, 2000; FIB, 2011). Também,
como no caso do fenol, os ésteres de ácido p-hidroxibenzoico podem ser ligados em
proteínas, emulsionantes e outros componentes do produto devido ao grupo OH
fenólico e assim, ser inativado (LÜCK; JAGER, 2000).
O mecanismo de ação dos parabenos é corresponde em princípio pelo fenol,
que destrui a membrana celular e desnatura as proteínas intracelulares e inibe a
absorção de nutrientes e de aminoácidos essenciais, tais como a glucose. Como não
são compostos susceptíveis a quebra, a sua ação antimicrobiana é relativamente
independente do pH do meio a ser preservado. Por isso, são superiores aos
conservantes de ácidos orgânicos (LÜCK; JAGER, 2000).
33
Quadro 4 – Solubilidade dos parabenos em água e coeficiente de partição óleo:água.

Parabeno Solubilidade Coeficiente de Partição O/A
Óleo de Milho – 4.1
1 em 400 a 25 ºC
Óleo Mineral – 0.1
Metil 1 em 50 a 50 ºC
Óleo de Amendoim – 4.2
1 em 30 a 80 ºC
Óleo de Soja – 6.1
1 em 1250 a 15 ºC
Etil 1 em 910 a 20 ºC
1 em 120 a 80 ºC
1 em 4350 a 15 ºC
Propil 1 em 2500 a 20ºC
1 em 225 a 80 ºC
1 em > 5000 a 25 ºC Óleo Mineral – 3.0
Butil 1 em 670 a 80 ºC Óleo de Amendoim – 280
Óleo de Soja – 280
Fonte: ROWE; SHESKEY; QUINN, 2009.
O Cosmetic Ingredient Review (CIR) analisou a segurança de metilparabeno,

propilparabeno, butilparabeno em 1984 e concluiu que eram seguros para utilização
em produtos cosméticos em níveis de até 25%. Em 2004 foi publicado no Journal of
Applied Toxicology um estudo que detectou parabenos em tumores de mama, mas
não comprovou que os parabenos podem causar câncer e nem os seus níveis em
tecidos normais (FDA, 2007).
Um parecer de 2008 sobre parabenos a partir do Comitê Científico da
Comissão Europeia dos Produtos de Consumo afirma que "metilparabeno e
etilparabeno não são preocupantes", mas que "a avaliação da segurança de propil e
butilparabeno necessitam de mais estudos” (DAWSON, 2011).
Segundo o FDA, os resultados da investigação que indicam uma possível
conexão entre parabenos e câncer não são conclusivos, e que mais pesquisas
precisam ser realizadas (FDA, 2007).
34
3.2.2 Fenoxietanol
O Fenoxietanol é um líquido incolor, ligeiramente viscoso (Figura 3). Sua

atividade antibacteriana é eficaz numa ampla faixa de pH contra estirpes de
Pseudomonas aeruginosa e em menor medida para outros organismos gram-
negativos. É mais frequentemente utilizado em combinação com outros agentes de
conservação, tais como parabenos, para se obter um espectro mais amplo de ação
antimicrobiana.
As regulamentações do Brasil, RDC n. 29/2012 permite o uso em formulações
farmacêuticas para aplicação tópica, a uma concentração entre 0,5 - 1,0% (BRASIL,
2012). Possui solubilidade por vários agentes como descritos no Quadro 5.
Figura 3: Estrutura molecular do Fenoxietanol.
Quadro 5 – Alguns solventes e a solubilidade do Fenoxietanol

Solvente Solubilidade em 20 ºC
Acetona Miscível
Etanol (95%) Miscível
Glicerina Miscível
Isopropil 1 em 26
Óleo Mineral 1 em 143
Óleo de Oliva 1 em 50
Óleo de Amendoim 1 em 50
Água 1 em 43
35
3.2.3 Outros conservantes
O ácido benzoico é amplamente utilizado em alimentos, cosméticos, e

produtos farmacêuticos, como um conservante antimicrobiano. A grande atividade
em valores de pH entre 2,5-4,5. Apenas o ácido não dissociado mostra propriedades
antimicrobiana, pois é desta maneira que possui a capacidade de penetrar através
da parede celular e sua ação depende do pH do meio. Apresenta moderada
atividade bacteriostática contra a maioria das espécies de bactérias Gram-positivas
e menos contra bactérias Gram-negativas (LUCK; JAGER, 2000; ROWE; SHESKEY;
QUINN, 2009).
A ação antimicrobiana do ácido benzoico é baseada em várias intervenções
sobre o sistema enzimático das células dos micro-organismos. Em muitas bactérias
e leveduras, por exemplo, as enzimas que são inibidas controlam o metabolismo do
ácido acético e a fosforilação oxidativa (LUCK; JAGER, 2000).
O ácido bórico é utilizado como um conservante antimicrobiano, em gotas
para os olhos, produtos cosméticos, pomadas e cremes tópicos. Em concentrações
diluídas é utilizado como um antisséptico suave, com fraca propriedade
bacteriostática e fungistática. É incompatível com água, bases fortes e metais
alcalino. Reage violentamente com anidridos de ácido e de potássio. Isto também
forma um complexo com a glicerina, que é um ácido mais forte do que ácido bórico
(ROWE; SHESKEY; QUINN, 2009). Atua bloqueando as enzimas do metabolismo do
fosfato. Por sua constante de dissociação ser mais baixa que o restante dos
conservantes, o Ácido bórico se encontra quase exclusivamente não dissociado
(LUCK; JAGER, 2000).
O fenol é utilizado em formulações farmacêuticas tópicas e cosméticas. É
largamente utilizado como um anti-séptico, desinfetante e agente terapêutico.
Apresenta atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-negativas e Gram-
positivas, fungos e vírus. Em soluções aquosas de concentração 1% são
bacteriostáticos, enquanto em soluções mais fortes são bactericidas. Possui maior
atividade em soluções ácidas; o aumento da temperatura também aumenta a
atividade antimicrobiana e é inativado pela presença de substâncias orgânicas
(ROWE; SHESKEY; QUINN, 2009).
36
3.3 Cosméticos
Cosméticos são preparações constituídas por substâncias naturais ou

sintéticas, de uso externo nas diversas partes do corpo humano, pele, sistema
capilar, unhas, lábios, órgãos genitais externos, com o objetivo exclusivo ou principal
de limpá-los, perfumá-los, alterar sua aparência e ou protegê-los ou mantê-los em
bom estado. Entre os produtos incluídos nesta definição são hidratantes de pele,
perfumes, batons, esmaltes de unha, maquiagens, xampus, etc (ANVISA, 2004;
FDA, 2012).
De acordo com pesquisa Pyxis Consumo, ferramenta de dimensionamento de
mercado do Ibope Inteligência, o consumo de produtos de beleza e higiene cresceu
11% em 2013 na comparação com o ano anterior. Segundo o estudo, os brasileiros
gastaram R$ 55,13 bilhões com tais produtos naquele ano (SOUSA, 2013),
tornando-se o segundo maior mercado mundial de cosméticos (DINARDO, 2013).
O Brasil possui 2.412 empresas atuando no mercado de produtos de higiene
pessoal, perfumes e cosméticos, de acordo com a Abihpec dessas, 20 são
empresas de grande porte, a maioria delas multinacionais, com vendas líquidas
acima de R$ 100 milhões, representando 73% do volume de negócios total do setor
(SANTOS, 2014).
Algumas razões para esse excelente desempenho são o aumento da
expectativa de vida da população, o que tem levado a população a querer manter
uma aparência jovial por mais tempo e principalmente o maior acesso das pessoas
das classes C e D a esses produtos, a elevação do valor agregado médio dos
produtos adquiridos pela classe C e o incremento da produtividade e da inovação
das indústrias desse tipo, promovendo aumento da variedade de bens oferecidos
(DANA, 2013).
Os produtos cosméticos podem ser apresentados nos estados líquido,
semissólido e sólido. As emulsões semissólidas apresentam como cremes, loções e
géis (ANVISA, 2008), cada qual com características únicas e destinadas à aplicação
tópica. Elas podem ser aplicadas sobre a pele e as preparações não
medicamentosas são utilizadas devido a seus efeitos físicos como protetoras ou
lubrificantes (ALLEN JUNIOR; POPOVICH; ANSEL, 2013).
Os cremes são preparações farmacêuticas semissólidas que contêm um ou
mais agentes dissolvidos ou dispersos em uma base adequada, geralmente uma
37
emulsão óleo em água. São utilizados principalmente em produtos para aplicação

tópica sobre a pele (ALLEN JUNIOR; POPOVICH; ANSEL, 2013).
Os géis são sistemas semissólidos que consistem em dispersões de
pequenas ou grandes moléculas em um veículo líquido aquoso que adquire
consistência semelhante às geleias pela adição de um agente gelificante como os
derivados de celulose (carboximetilcelulose sódica) e as gomas naturais (goma
xantana) (ALLEN JUNIOR; POPOVICH; ANSEL, 2013).
A ANVISA exige que as empresas produtoras tenham implantado as normas
de boas práticas de fabricação, conforme as normas técnicas oficialmente
estabelecidas. Dentre as exigências presentes nas normas, está a necessidade da
realização de ensaios de controle de qualidade em todas as fases do processo de
fabricação. Essas normas são dinâmicas e devem ser atualizadas para acompanhar
a evolução tecnológica dos processos, novos equipamentos e gerenciamento da
qualidade (YAMAMOTO et al., 2004).
Os cosméticos, em geral, são excelentes meios para existência e proliferação
de micro-organismos, pois são fontes de elementos essenciais ao seu
desenvolvimento. As contaminações, que podem ser de origem física, química ou
microbiológica, são as principais causas de insucesso na obtenção de cosméticos de
qualidade e eficácia percebidas pelos consumidores (CROSHAW, 1977).
A atenção no controle dos produtos não estéreis assegura que a carga
microbiana presente no produto, seja no aspecto qualitativo ou quantitativo, não
comprometa a qualidade final ou a segurança do paciente (PINTO; KANEKO;
PINTO, 2015).
Com exceção das pomadas oftálmicas, as preparações tópicas não precisam
cumprir o requisito de esterilidade. Elas devem, entretanto, apresentar padrões
aceitáveis de carga microbiana, e as formulações propensas ao crescimento
microbiano devem conter conservantes (ALLEN JUNIOR; ANSEL; POPOVICH,
2007).
O setor de cosméticos é um dos setores mais dinâmicos da atualidade. Exige
uma contínua inovação e investimento constante no desenvolvimento de novos
projetos e processos, capaz de satisfazer a uma ampla gama de consumidores que
estão ansiosos por novidades (LIZÁRRAGA, 2014).
O mercado global vem passando por períodos de grandes competições
científicas e tecnológicas, principalmente após a nanociência e a nanotecnologia
38
terem sido reconhecidas como uma tendência chave na ciência do século XXI, o que
tem ocasionado um aumento nos recursos humanos e financeiros na indústria
mundial (BRUXEL et al., 2012).
A produção de cosméticos que emprega nanotecnologia, nanocosméticos,
especificamente falando, encontra-se mundialmente inserida na indústria de
cosméticos convencionais, constituindo-se em uma linha de produtos diferenciados
de base nanotecnológica, sendo geralmente classificada como um setor específico
da indústria química juntamente com os produtos de higiene pessoal e perfumaria
(FRONZA et al., 2007).
O interesse no uso da nanotecnologia aplicada a cosméticos é recente no
Brasil e vem crescendo, trazendo mais pesquisadores das principais universidades
brasileiras. Além disso, já existem empresas nacionais produtoras de matérias-
primas com base nanotecnológica (LIZÁRRAGA, 2014).
As nanoemulsões são dispersões estáveis com diâmetro médio de gota em
tamanho manométrico. Este sistema é composto por óleo, água e um ou mais
agentes surfactantes, podendo ser uma dispersão óleo em água (O/A) ou água em
óleo (A/O) (BENITA; MARTINI; SEILLER, 1996).
No setor cosmético, nanomateriais, como as nanopartículas, estão presentes
em xampus, condicionadores, cremes dentais, cremes antirrugas, cremes
anticelulites, clareador de pele, hidratantes, pós-faciais, loções pós-barba,
desodorantes, sabonetes, foto protetores, maquiagens de modo geral, perfumes e
esmaltes (FRONZA; et al., 2007).
As microemulsões são sistemas isotrópicos, transparentes, de baixa
viscosidade e termodinamicamente estáveis, obtidas quando uma mistura de
tensoativos apropriada é usada pela facilidade de aplicação e adesão na pele, como
hidratantes, preparações de protetor solar, produtos de bronzeamento, produtos
antienvelhecimento, desodorantes, perfumes, entre outros (ADNAN, et al., 2008;
NEMEN, LEMOS-SENNA, 2011; VICENTINI, 2008).
39
Quadro 6 – Tamanho e aspecto dos componentes dos sistemas emulsionados.

Denominação Tamanho (µm) Aspecto
Macroemulsão 2 - 20 Branco leitoso
Nanoemulsão 0,1 - 0,3 Branco azulado
Microemulsão < 0,1 Translúcido
Soluções micelares 0,01 Límpido
Soluções
0,001 Límpido
moleculares
Fonte: ALLEN JR.; ANSEL; POPPOVICH, 2007.
3.4 Excipientes farmacêuticos em produtos semissólidos
Os excipientes são adicionados à formulação com o intuito de facilitar a

preparação e a aceitabilidade por parte do usuário do produto e assegurar o
funcionamento da formulação. Entre os excipientes estão agentes desintegrantes,
diluentes, lubrificantes, agentes suspensores, agentes emulsionantes, flavorizantes,
corantes e estabilizantes químicos, entre outros (ASHFORD, 2005).
Para a escolha dos excipientes farmacêuticos utilizados na manipulação é
importante considerar os vários tipos de estabilidade e os fatores genéricos que
afetam a forma farmacêutica (ALLEN JUNIOR; ANSEL; POPOVICH, 2007).
Os excipientes estão incluídos nas fórmulas farmacêuticas em produtos
semissólidos assumindo a função de base carreadora de ativos, e para auxiliar na
fabricação, administração e/ou absorção e raramente possuem atividade
farmacológica (CROWLEY; MARTINI, 2001). São essenciais na produção dos
cosméticos não só porque melhoram determinadas características, como o aspecto,
o odor, o sabor ou a estabilidade, mas também porque diminuem o custo final do
produto (ALLEN JUNIOR; ANSEL; POPOVICH, 2007).
Uma ampla variedade de excipientes está disponível para a preparação de
formas farmacêuticas semissólidas. Os mais utilizados são: glicerídeos, ceras,
hidrocarbonetos, silicones polioxietilenoglicóis e homólogos, géis de produtos
minerais, bentonita e silício, géis de polímeros orgânicos, alginatos, gelose, pectina,
metilcelulose e carboximetilcelulose sódica, amido, entre outros (STORPIRTIS et al.,
2011).
40
Os excipientes podem ser classificados mediante a função que

desempenham na formulação. Os mais significativos considerando a reatividade
para a estabilidade do sistema são os tensoativos e os agentes doadores de
viscosidade, como as macromoléculas.
3.4.1 Tensoativos
Os tensoativos são substâncias que reduzem a tensão superficial da água

permitindo a formação de emulsões estáveis e a preparação de misturas uniformes
de substâncias químicas imiscíveis (VILLANOVA; SÁ, 2009).
Apesar dos tensoativos de origem natural serem preferidos aos sintéticos, por
apresentarem resultados adequados de emulsificação, agentes emulsionantes
auxiliares têm sido empregados para conferir maior estabilidade à emulsão
(MEDINA; SALVADO; DEL POZO, 2001). São amplamente empregados em
emulsões para uso externo como emulsificante o/a.
Os polissorbatos são derivados polioxietilênicos de ésteres de sorbitano. Os
tensoativos não-iônicos são substâncias sintéticas, empregados para preparação
tanto de emulsões o/a como de emulsões a/o para uso interno e externo. São
compatíveis com substâncias aniônicas e catiônicas são muito resistentes a
mudanças de pH. O tipo de emulsão formada depende do equilíbrio entre os grupos
hidrofílicos e lipofílicos, citando-se como exemplo, glicóis, ésteres de glicerol,
polissorbatos, esteres de sorbitano, entre outros (ALLEN JUNIOR; ANSEL;
POPOVICH, 2013; FERREIRA, 2002).
Os mono e diglicerídeos etoxilados possuem algumas das características dos
polissorbatos. São produzidos pela reação de um éster de glicerídeo convencional
com óxido de etileno para produzir uma estrutura que funciona de maneira
semelhante a dos polissorbatos (FERREIRA, 2002). Tensoativos não iônicos do
grupo dos poloxâmeros e polioxietileno-sorbitanos (Tweens®) têm se mostrado
promissores em combinação com os fosfolipídios, pois levam à formação de filmes
mistos compactos, conferindo maior estabilidade à formulação (BRUXEL et al.,
2012).
41
Figura 4: Estrutura molecular do Tween® 80
Fonte: PubChem
3.4.2 Macromoléculas
Os derivados da celulose, como a metilcelulose, são utilizados

extensivamente como excipientes farmacêuticos em diferentes aplicações. Podem
ser utilizados como espessantes na indústria alimentar (CALEGUER; BENASSI,
2007; ROWE; SHESKEY; QUINN, 2009) e como matriz para a liberação controlada
de fármacos na indústria farmacêutica (LOPES; LOBO; COSTA, 2005). Também são
utilizados na indústria farmacêutica e de cosméticos para produção de géis
hidrofílicos, tendo um aumento na sua aplicação devido à sua fácil espalhabilidade e
por não serem gordurosos. Esses geis têm vantagens quanto a toxicidade,
biocompatibilidade, biodegradabilidade, alta estabilidade e baixo custo, além de
serem encontrados em abundância na natureza (Figura 4) (LIMA NETO; PETROVIK,
1997; ROWE; SHESKEY; QUINN, 2009).
A carboximetilcelulose sódica ou carmelose é amplamente utilizada nas
formulações farmacêuticas orais e tópicas, principalmente para aumentar a
viscosidade. Soluções aquosas viscosas são usadas como estabilizantes de
emulsões de uso tópico. Também é usada em produtos cosméticos, produtos de
higiene pessoal e alimentos, sendo fortemente incompatível com soluções ácidas e
sais solúveis de ferro e outros metais tais como: alumínio, mercúrio, zinco e também
apresenta incompatibilidade com goma de xantana. (ROWE; SHESKEY; QUINN,
2009).
42
Figura 5: Estrutura molecular da carboximetilcelulose sódica.
A importância das gomas está na sua habilidade de controlar as

características reológicas (viscosidade, elasticidade e plasticidade) de sistemas
aquosos por meio de estabilização de emulsões, suspensão de partículas e controle
de cristalização (LUCCA; TEPPER, 1994).
A goma xantana (Figura 5) é amplamente utilizada na indústria de
formulações farmacêuticas orais e tópicas, cosméticos e alimentos como um agente
de suspensão e estabilização. É também utilizado como um agente espessante e
emulsificante. Não é tóxica, é compatível com a maioria dos outros ingredientes
farmacêuticos, e tem boas propriedades de estabilidade e viscosidade. A goma
xantana também tem sido utilizada como um agente de gelificação para
administração de formulações tópicas contendo nanopartículas ou microemulsão.
Este polissacarídeo é estável em uma ampla faixa de pH (pH 3-12) e temperaturas
de 10 – 60 ºC (ROWE; SHESKEY; QUINN, 2009).
Figura 6: Estrutura molecular da goma xantana

43
3.5 Interações entre conservantes e demais excipientes
Vários fatores afetam a estabilidade de um produto. Variáveis relacionadas à

formulação, ao processo de fabricação, ao material de acondicionamento e às
condições ambientais e de transporte podem influenciar na estabilidade do produto
(ANVISA, 2004). Para Voigt (1982), incompatibilidades compreendem os efeitos
recíprocos entre dois ou mais componentes de uma preparação farmacêutica.
A presença de incompatibilidade deve ser investigada considerando toda
formulação (FERREIRA, 2002). As incompatibilidades podem ocorrer entre as
substâncias ativas, entre as substâncias coadjuvantes (excipientes), entre as
substâncias ativas e as coadjuvantes, ou entre uma ou outra e o material da
embalagem ou impurezas (CAVALCANTI, 2008). A instabilidade das formulações
pode ser visualmente detectada por mudanças na aparência física, na cor, no odor,
no gosto ou na textura (ALLEN JUNIOR; ANSEL; POPOVICH, 2007).
Segundo a origem e a manifestação, as incompatibilidades podem ser físicas,
químicas ou terapêuticas. As físicas se caracterizam pela não-uniformidade
classificadas como solução incompleta resultando num produto não homogêneo;
precipitação quando uma substância precipita no solvente insolúvel; separação de
líquidos imiscíveis e liquefação de ingredientes sólidos (FERREIRA, 2002).
As incompatibilidades químicas caracterizam-se pela transformação parcial ou
total das substâncias associadas, formando compostos secundários, como novas
propriedades químicas e consequentemente, novas propriedades farmacodinâmicas.
Das classes de incompatibilidades, esta é a que merece maior atenção, não só por
ser mais frequente, mas por trazer muitos prejuízos para a indústria e para o
consumidor (FERREIRA, 2002).
A eficácia do conservante pode ser comprometida por interações com
ingredientes ativos e excipientes ou outros comportamentos físico-químicos (ELDER;
CROWLEY, 2012). Com relação à característica física do produto, se solução,
suspensão ou emulsão, diversos fatores podem interferir nesta inativação,
dependendo da complexidade da fórmula. Observando primeiramente os tipos de
reação que podem ocorrer, pode-se ponderar que numa fórmula complexa como
emulsão, uma série de fatores podem anular a atividade do sistema conservante
(PINTO; KANEKO; PINTO, 2015). A estabilidade química de um fármaco pode ser
44
reduzida, caso o mesmo seja incorporado em um excipiente inadequado ou que

contenham coadjuvantes farmacotécnicos incompatíveis (FERREIRA, 2002).
Com a variedade de conservantes disponíveis e o grande número de
excipientes em uso nas formulações farmacêuticas e cosméticas, interações de
diferentes naturezas são possíveis no sentido de inativar a ação antimicrobiana do
sistema conservante (PINTO; KANEKO; PINTO, 2015).
Muitas das combinações incompatíveis que resultam em desativação do
conservante envolvem macromoléculas, como os diversos derivados da celulose, os
polietilenoglicois e as gomas, como a adraganta, que comprovadamente atraem e
complexam os conservantes, como os parabenos e os compostos fenólicos,
tornando-os indisponíveis para sua função. Os excipientes interferem na solubilidade
e na disponibilidade do conservante, fazendo com que sua concentração química
não seja a medida verdadeira (ANSEL; POPOVICH; ALLEN, 2000).
Os parabenos são inativados (parcialmente ou completamente) por fontes
ligantes de hidrogênio, tais como os compostos altamente etoxilados, como os
polissorbatos e outros compostos, como os derivados de celulose, proteínas e
lecitinas. Podem também ser absorvidos por muitos tipos de argilas ou compostos
semelhantes (C&P, 2007).
Segundo Schmolka (1973) diversos conservantes que apresentam
características lipofílicas, como é o caso dos parabenos tornam-se susceptíveis à
solubilização micelar por emulsificantes. Uma micela é uma agregação de moléculas
ou a formação de uma nova fase, e são obtidas quando os tensoativos se encontram
em concentração superior à concentração micelar crítica (conhecida como a CMC
concentração micelar crítica). Esta propriedade de agregação ou formação de
micelas, se reflete em alterações marcadas nas propriedades da solução, incluindo a
tensão de superficial, o índice de refração, solubilidade, condutividade elétrica, etc.
A incompatibilidade de conservantes com outros componentes da fórmula
geral é detectada durante o teste de eficácia inicial. Mudanças mais sutis podem
ocorrer lentamente e serem detectadas durante testes de estabilidade. Isto ocorre
quando os ensaios de eficácia de conservante detectam que o sistema conservante
se torna inadequado por não inativar um ou mais organismos testes com rapidez
suficiente para satisfazer os critérios de aceitação (DOORNE, 2007).
45
3.6 Teste de Eficácia de Conservantes – Challenge test
Para definir o conservante para determinada formulação, é necessário que se

faça o teste de desafio do conservante, a fim de se determinar a substância química
e a concentração mínima efetiva para garantir que o produto se mantenha sem
contaminação, conforme a legislação específica, durante sua fabricação, na
embalagem e durante sua distribuição, além de resistir a possíveis contaminações
introduzidas pelo usuário em função do mau uso (PINTO; KANEKO; PINTO, 2015).
O teste de desafio (Challenge Test) ou teste de eficácia de conservantes tem
como objetivo avaliar a eficácia do sistema conservante necessário à proteção
satisfatória do produto, desde a fabricação, uso pelo consumidor até o prazo final de
validade. Consiste na inoculação da amostra com a suspensão de micro-
organismos, com carga conhecida e, avaliações periódicas do número de
sobreviventes e comparação dos resultados com as especificações (ASSOCIAÇÃO
BRASILEIRA DE COSMETOLOGIA, 2014; RUSSEL, 2003).
A eficácia antimicrobiana, seja ela inerente ao produto ou devida à adição de
conservantes, precisa ser demonstrada para produtos tópicos múltipla-dose;
produtos orais; oftálmicos; otológicos; nasais; fluidos de diálise; irrigação, etc
(BRASIL, 2010).
Para o propósito com o teste, os produtos são separados em 4 categorias.
Categoria 1 - Injetáveis, outros parenterais incluindo emulsões, produtos otológicos,
nasais estéreis, oftálmicos constituídos de base ou veículo aquoso; Categoria 2 -
Produtos de uso tópico. Constituídos de base, ou veículo aquoso, produtos nasais
não estéreis e emulsões, incluindo aqueles aplicados em membranas mucosas;
Categoria 3 - Produtos orais constituídos de base ou veículo aquoso, exceto
antiácidos e Categoria 4 - Antiácidos constituído de base aquosa (BRASIL, 2010).
3.6.1 Micro-organismos testes
O método da Farmacopeia Brasileira (BRASIL, 2010) para o teste de eficácia

de conservantes recomenda que sejam utilizadas as cepas padrões dos micro-
organismos Candida albicans, Aspergillus niger, Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa e Staphylococcus aureus.
46
O uso de micro-organismos-padrão permite abrangência morfológica e

metabólica de bactérias, leveduras e fungos que estão largamente distribuídos na
natureza e que tenham sido associados a problemas microbiológicos. Permite ainda
a comparação de sistemas conservantes em produtos diferentes. Isso possibilita
padronizar a potência do sistema conservante e comparar os sistemas conservantes
em produtos similares (PINTO; KANEKO; PINTO, 2015).
Os micro-organismos específicos foram escolhidos por serem patogênicos
conhecidos (Pseudomonas aeruginosa), indicadores de contaminação fecal
(Escherichia coli), ou indicadores de baixos níveis de higiene (Staphylococcus
aureus) (PINTO; KANEKO; PINTO, 2015).
Staphylococcus aureus é uma bactéria, Gram-positiva com colônias
aglomeradas em forma de cocus que se dividem em mais de um plano. Distingue-se
de outras espécies de Staphylococcus por apresentar na base das colônias
pigmentação ouro e os resultados positivos para coagulase, fermentação de manitol
e teste de desoxirribonuclease (LOWEY, 1998). São anaeróbios facultativos e
catalase positivos, não resistem ao calor. Já suas toxinas, responsável pela
síndrome do choque tóxico, uma infecção grave caracterizada por febre alta,
vômitos, algumas vezes ocasionando a morte são altamente termo-resistentes,
suportando tratamentos térmicos severos. Cresce comparativamente bem sob
condições de alta pressão osmótica e pouca umidade, o que parcialmente explica
porque podem crescer e sobreviver nas secreções nasais e sobre a pele (SILVA et
al., 2010; TORTORA et al., 2006).
A Escherichia coli é uma das espécies entéricas predominante no intestino
humano e, como parte da microbiota intestinal normal, assim como outras espécies
podem proporcionar benefícios à saúde do hospedeiro, por exemplo, prevenir a
colonização do intestino por agentes patogênicos. No entanto, existem algumas
estirpes de E. coli, por vezes referidos como enteropatogênicas, que podem causar
graves doenças diarreicas em humanos (FDA, 2012).
Pseudomonas aeruginosa é uma espécie de bactérias cuja principal
característica é a extrema versatilidade metabólica e nutricional, que permite a
utilização de uma enorme variedade de compostos orgânicos como fonte de carbono
e energia (GARRITY; BOONE; CASTENHOLZ, 2001). São bastonetes retos ou
ligeiramente curvos, Gram-negativos, não formam esporos, não toleram condições
ácidas, são catalase positivas, oxidase positivas e formam pigmentos fluorescentes;
47
podem ser encontradas na água, no solo, na poeira em suspensão, no ar e nos

vegetais, e conseguem resistir a inúmeros antisépticos e antibióticos (KIMATA et al.,
2004; PIRNAY et al., 2005).
Aspergillus niger é um membro do gênero Aspergillus que inclui um conjunto
de fungos que são geralmente considerados assexuados, embora as formas
perfeitas (formas de reprodução sexual) foram encontradas. Aspergillus são
onipresentes na natureza. Eles estão amplamente distribuídos geograficamente, e
foram observados em uma ampla gama de ambientes, pois eles podem colonizar
uma grande variedade de substratos. A. niger é comumente encontrado como um
crescente saprófita em folhas mortas, grãos armazenados, pilhas de compostagem,
e outra vegetação em decomposição. Os esporos são divulgados, e estão muitas
vezes associados com os materiais orgânicos e de solo (TSCA, 1997).
Aspergillus estão entre os fungos mais frequentemente isolados de solos. Os
esporos assexuados abundantes produzidos dentro dos conidióforos são resistentes
a muitos estresses ambientais, o que permite que o organismo sobreviva durante
períodos inativos (TSCA, 1997).
A Candida albicans é uma levedura capaz de provocar qualquer tipo de
doença, superficial, cutânea, subcutânea ou sistêmica. É encontrada no corpo
humano, como saprobiotas, em animais, em frutas etc. No ser humano torna-se
patogênica quando as condições do hospedeiro são favoráveis, pois são agentes
oportunistas. Ao exame microscópico, compõe-se de células em levedura,
unicelulares com brotamento e filamentos septados (McCULLOUGH; ROSS;
READE, 1996; MINAMI, 2003).
3.7 Neutralização do Sistema Conservante
Entende-se que no teste de eficácia de um produto cosmético um

conservante antimicrobiano específico deve ser precedido pela sua neutralizado
para recuperar os micro-organismos viáveis através de neutralizantes específicos,
bem como os meios de cultura, diluentes e diluições adequadas para a realização
das análises (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE COSMETOLOGIA, 2014).
Existem três métodos comuns para neutralizar as propriedades
antimicrobianas de um produto: neutralização química, diluição e filtração.
48
A inibição química de bactericidas é o método mais adequado para o teste de

eficácia antimicrobiana. A escolha da composição do inativante químico (diluente)
em testes microbiológicos depende do sistema conservante utilizado
especificamente para cada produto (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE
COSMETOLOGIA, 2014). Os inativantes para os principais conservantes são
apresentados no Quadro 7.
Quadro 7 – Principais conservantes utilizados na indústria cosméticas e seus inativantes.

Conservantes Inativantes
Parabenos polissorbato 80 3% p/v
Formaldeído histidina 0,1% p/v
Imidazolidinil ureia
Diazolinil ureia histidina 0,5% p/v
DMDM hidantoína
polissorbato 80 2% p/v
Fenoxietanol
lecitina de soja 0,3% p/v
Fonte: ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE COSMETOLOGIA, 2014.
49
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Seleção de conservantes e excipientes para o estudo
Foram utilizadas várias combinações de conservantes e excipientes como,

macromoléculas e tensoativos não-iônicos comumente utilizados nas formulações
semissólidas, provenientes do Laboratório de Farmacotécnica e da Farmácia Escola
da UNIVALI.
Os tensoativos não iônicos Alkest® CSO 400 H (Lote: 130817M58483) e Tween
80® (Lote: 36668), as macromoléculas carboximetilcelulose sódica (Lote: 3781*OS-
004031/F01) e goma xantana (Lote: 3959*140787) e os conservantes metilparabeno
(Lote: 3772*LG1111), Phenonip® (Lote: GBG0028130), Verstatil® BP (Lote: 406050)
e Verstatil® PC (Lote: 406570).
4.2 Micro-organismos padrões
Os micro-organismos relacionados no Quadro 8 são indicados para o estudo

de eficácia do conservante segundo a Farmacopeia Brasileira (BRASIL, 2010) e
foram repicados partir das culturas padrões originais.
Quadro 8 – Condições para reconstituição das cepas de micro-organismos para o estudo de eficácia
do conservante.
Tempo de Tempo de incubação
Temp. de
incubação do para a recuperação
Micro-organismos inoculação
inoculo microbiana
ºC
(h) (dias)
Escherichia coli - ATCC 8739 32,5 ± 2,5 18 – 24 3–5
Pseudomonas aeruginosa - ATCC 9027 32,5 ± 2,5 18 – 24 3–5
Staphylococcus aureus - ATCC 6538 32,5 ± 2,5 18 – 24 3–5
Candida albicans - ATCC 10231 22,5 ± 2,5 44 – 52 3–5
Aspergillus niger - ATCC 16404 22,5 ± 2,5 144 – 240 6 – 10

FONTE: BRASIL, 2010.
50
4.2.1 Preparação do inóculo

4.2.1.1 Bactérias
Para o preparo dos inóculos bacterianos foram utilizadas a bactéria Gram-

positiva Staphylococcus aureus e as Gram-negativas Escherichia coli e
Pseudomonas aeruginosa.
Cada bactéria foi transferida para o meio de manutenção Mueller-Hinton
preparado conforme anexo A, e incubada a 37 ºC por 18-24 h, para assegurar
pureza e viabilidade das culturas jovens.
Foram selecionadas de 4 a 5 colônias de bactérias recém ativadas e
transferidas para tubo de ensaio com 5 mL de solução NaCl 0,86% estéril,
homogeneizado em agitador de tubos por 15 s. Ajustou-se a densidade do inóculo
por espectrofotometria a 520 nm, por comparação com a escala de 0,5 de
McFarland, para obter a concentração de aproximadamente 1,5 x 105 células/mL
(CLSI, 2009).
4.2.1.2 Fungos leveduriformes
Foi utilizado o inóculo de Candida albicans a qual foi cultivada em ágar

Sabouraud dextrosado preparado conforme anexo A, para assegurar pureza e
viabilidade das culturas jovens de 24 a 48 h a 30 ºC.
Para preparar o inóculo, foram selecionadas 5 colônias da levedura, as quais
foram suspensas em 5 mL de NaCl 0,85% estéril e homogeneizadas em agitador de
tubo por 15 s. A densidade do inóculo foi ajustada por espectrofotometria a 520 nm,
por comparação com a escala de 0,5 de McFarland, para obter a concentração de
aproximadamente 1,5 x 104 células/mL (NCCLS, 2002).
4.2.1.3 Fungos filamentosos
Para o preparo do inóculo de fungo filamentoso foram utilizadas cepas de

Aspergillus niger.
Foi mantido em ágar Sabouraud à temperatura ambiente por 7 a 10 dias para
obtenção de cultura jovem. O respectivo inóculo foi preparado removendo os
esporos do fungo a partir de cultura jovem, com auxílio de uma alça, transferidos
51
para tubo com água estéril e homogeneizado em agitador de tubos por 30 s. A

suspensão conidial foi filtrada, para remoção das hifas, novamente homogeneizada
e ajustada para 1,0 x 104 células/mL com adição de água (NCCLS, 2002).
4.3 Análise de compatibilidade entre conservantes e excipientes
Testes de compatibilidade entre conservantes e excipientes foram realizados

com base na Farmacopeia Brasileira (BRASIL, 2010), utilizando e analisando uma
concentração pré-fixada dos conservantes com diferentes concentrações dos
excipientes individualmente.
As concentrações dos conservantes utilizadas neste estudo foram escolhidas
com base nos limites máximos de cada um e foram escolhidas as concentrações
intermediárias. Foram testados quatro tipos de conservantes: Metilparabeno (0,2%),
Phenonip® (0,2%); Fenoxietanol com Benzoato de sódio (Verstatil BP®) a 0,5% e
Fenoxietanol com Caprililglicol (Verstatil PC®) a 0,5%.
Os excipientes foram divididos em duas categorias, tensoativos não iônicos
(Tween® 80 – polissorbato 80 e ALKEST® CSO 400 H – óleo de rícino polietoxilado
hidrogenado) nas concentrações 40, 20, 10 e 5 g/L e macromoléculas (goma
xantana e carboximetilcelulose sódica) nas concentrações 1, 3. 5 e 7 g/L e 2 e 4 g/L
respectivamente. As concentrações dos tensoativos foram utilizadas a partir da
maior concentração utilizada para neutralizar a ação do conservante para a usual em
cosméticos. Já para as macromoléculas, foram utilizadas conforme a concentração
usual em cosméticos. Concentrações maiores de carboximetilcelulose sódica (4 e 6
g/L) não passaram nos testes preliminares, pois impossibilitou a homogeneização
dos micro-organismos e a retirada de alíquotas para a contagem.
Foram utilizadas as seguintes combinações:
- Conservante + excipientes + caldo nutriente;
- Conservante + caldo nutriente;
- Excipientes + caldo nutriente;
- Caldo nutriente.
Além dos conservantes e excipientes, a mistura teve como fonte de nutriente
o caldo nutriente. O pH foi ajustado para 6,9 e os meios foram esterilizados durante
15 m sob temperatura de 120 ºC e pressão de 1,3 kg/cm³.
52
As culturas de inóculo de cada um dos micro-organismos requeridos foram

inoculadas em duplicata em cada frasco estéril com tampa em três repetições (dias
alternados).
O volume de inóculo introduzido ficou entre 0,5% e 1,0% em relação ao
volume total. As combinações inoculadas foram incubadas em estufa com
temperatura a 22,5 ± 2,5 °C.
Após os intervalos de 7, 14 e 28 dias de incubação, cada frasco com amostra
inoculada foi analisado pelo método de superfície. Foram adicionados em placas de
Petri, separadamente, de 15 a 20 mL de ágar Mueller-Hinton (para bactérias) e ágar
Sabouraud dextrose (para fungo e levedura). Após a solidificação, foram
adicionados à superfície de cada meio de cultura, 50 µL do tubo de ensaio. As
placas contendo ágar Mueller-Hinton foram incubadas a 32,5 ± 2,5 °C durante 24 –
48 h para determinação do número de bactérias. As placas contendo ágar
Sabouraud-dextrose foram incubadas a 22,5 ± 2,5 °C durante 5 - 7 dias para
determinação do número de fungos e as placas contendo ágar Sabouraud-dextrose
a 30 ºC durante 24 – 48 h para determinar o número de leveduras.
Após o tempo de incubação das placas, foi determinado o número de
Unidades Formadoras de Colônias (UFC) de cada amostra em cada intervalo de
tempo.
4.4 Análise de eficácia dos conservantes incorporados em formulações

emulsivas (micro e namoemulsão)
4.4.1 Formulações
Após os resultados de compatibilidade obtidos nos testes entre conservantes

e excipientes, foram escolhidos três conservantes (metilparabeno, Phenonip® e
Verstatil BP®) os quais foram incorporados em formulações emulsivas
(microemulsão e nanoemulsões) e foi verificada a eficácia dos conservantes nos
produtos finais.
As formulações emulsivas empregadas no presente estudo foram
desenvolvidas por Fischer-Muller (2013) e a composição está descrita no Quadro 9.
53
Quadro 9 – Composição das formulações emulsivas.

Microemulsões Nanoemulsões
Excipientes
Micro M Micro BP Micro P Nano M Nano BP Nano P
Alkest® e
40% 40% 40% 20% 20% 20%
Span80®
Polymol® 10% 10% 10% 10% 10% 10%
Água
q.s.p. q.s.p. q.s.p. q.s.p. q.s.p. q.s.p.
ultrapurificada
Metilparabeno 0,2% - - 0,2% - -
Phenonip® - - 0,2% - - 0,2%
Verstatil® BP - 0,5% - - 0,5% -
Fonte: Fischer-Muller, 2013.
Os componentes da fase oleosa (óleo, tensoativos e conservantes) e aquosa

(água) foram pesados em béquer separados e aquecidos em banho-maria (80 ºC).
Quando as fases atingiram 80 ºC, a fase aquosa foi gotejada cuidadosamente sobre
a fase oleosa sob agitação constante. Após adicionado toda a fase aquosa, a
formulação permaneceu sob agitação em banho-maria por 5 min e depois em
agitação constante até resfriar.
As formulações foram acondicionadas em frasco de plástico com capacidade
de 100 g.
4.4.2 Inoculação dos micro-organismos padrões
Em cada embalagem com tampa estéril foi inoculada uma concentração do

suficiente para se obter uma concentração final no produto 1 x 10 5 UFC/ mL para
cada micro-organismos requerido.
O volume de inóculo introduzido estava entre 0,5% e 1,0% em relação ao
peso total das emulsões. Foram retirados 10 g de cada embalagem para ter a
contagem do tempo zero e em seguida foram mantidas em estufa com temperatura
entre 22,5 ± 2,5°C. As emulsões foram analisadas em 7, 14 e 28 dias.
54
4.4.3 Contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFC)
Em cada período de amostragem, 10 g de cada emulsão foram transferidos

para 90 mL de caldo Caseina-soja (TSB) contento os inativantes Tween® 80 (30 g/L)
e lecitina de soja (3 g/L) estéril. As amostras foram homogeneizadas e 1 mL foi
inoculado pelo método de superfície, em cada meio de cultura (ágar Caseína-Soja –
TSA para bactérias e ágar Sabouraud-dextrose – SAB para fungos e leveduras). As
placas contendo TSA foram incubadas a 32,5 ± 2,5 °C durante 24 - 48 h para
determinação do número de bactérias, as placas contendo SAB a 22,5 ± 2,5 °C
durante 5 - 7 dias para determinação do número de fungos e para determinação do
número de leveduras foram incubadas contendas a 30 ºC 24 - 48 h.
Após o período de incubação, foi determinado o número de UFC/mL de cada
amostra em cada intervalo de tempo.
4.5 Categoria de produto, critérios para a eficácia antimicrobiana e análise dos

resultados
Os requisitos para a eficácia antimicrobiana do conservante foram atingidos

quando os critérios estabelecidos pela Farmacopeia Brasileira (BRASIL, 2010) para
a categoria foram atingidos, conforme apresentado no Quadro 10.
Quadro 10 – Categoria de produtos e critérios para a eficácia antimicrobiana.
Tempo (dia)
Micro-
Tipo de produto
organismo
7º 14º 28º
Categoria 2 – Deve haver

Não deve haver
Produtos de uso redução de 2 logs
aumento da
tópico. Constituídos de Bactérias --- do nº de UFC
contagem em
base, ou veículo inicialmente
relação ao 14º dia
aquoso, produtos inoculados
nasais não estéreis e Não deve haver Não deve haver
emulsões, incluindo Bolores e aumento do nº de aumento do nº de
---
aqueles aplicados em leveduras UFC inicialmente UFC inicialmente
membranas mucosas inoculados inoculados
Fonte: BRASIL, 2010.
55
A concentração de cada micro-organismo (UFC/mL) presente em cada

emulsão foi calculada e comparada com a contagem no tempo inicial. Os resultados
das mudanças das concentrações dos inóculos nos produtos foram expressos
através do valor de redução logarítmica.
56
57
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A qualidade microbiológica de produtos farmacêuticos constitui um dos

atributos essenciais para o seu desempenho adequado, principalmente em relação à
segurança, eficácia e aceitabilidade do produto. Neste trabalho, foi testado a eficácia
dos conservantes metilparabeno, Phenonip®, Verstatil BP® e Verstatil PC® utilizando
diferentes excipientes (ALKEST® CSO 400 H, carboximetilelulose sódica, goma
xantana e Tween® 80) para avaliar a compatibilidade entre eles através da redução
do crescimento dos micro-organismos padrões.
Os conservantes utilizados no preparo das formulações em estudo foram os
parabenos metilparabeno e uma combinação de metil, etil, butil, propil e isobutil
parabenos em fenoxietanol (Phenonip®) que são os mais utilizados em farmácias
magistrais e na indústria cosmética e fenoxietanol e benzoato de sódio (Verstatil®
BP) e fenoxietanol e caprililglicol (Verstatil® PC), uma alternativa promissora em
função da resistência ao uso dos parabenos. Para entender a interações entre os
conservantes e os excipientes, foram escolhidos para este estudo dos insumos
usualmente utilizados em formulações semissólidas.
5.1 Análises de compatibilidade entre conservantes e excipientes
A eficácia do conservante pode ser comprometida por interações

(incompatibilidade) com insumos ativos, excipientes ou outros comportamentos
físico-químicos (ELDER; CROWLEY, 2012). Com o objetivo de verificar a
interferência de excipientes farmacêuticos na atividade antimicrobiana dos
conservantes utilizados em formulações semissólidas, o presente trabalho desafiou
isoladamente os excipientes para conhecer essas interações.
A Farmacopéia Brasileira (BRASIL, 2010) recomenda o uso de 5 micro-
organismos teste cada um em concentração final em torno de 105 células/mL para
bactérias e 104 células/mL para fungo e levedura. A contagem é realizada no 7º, 14º
e 28º dia de incubação. O conservante desafiado é considerado eficiente se após o
décimo quarto dia houver uma redução logarítmica de 2 logs do crescimento
microbiano para bactérias em comparação ao inóculo inicial e se não houver
58
aumento do número de UFC/mL em comparação com o inóculo inicial para fungos e

leveduras.
Os resultados obtidos com a contagem de micro-organismos viáveis no
estudo utilizando os conservantes metilparabeno (0,2%) e Phenonip® (0,2%) com os
tensoativos não iônicos ALKEST® CSO 400 H e Tween® 80 separadamente, são
apresentados na Figura 7.
Figura 7: Efeito da redução do crescimento microbiano em UFC/mL na combinação entre conservante

metilparabeno (M) (0,2%) e Phenonip® (P) (0,2%) e os tensoativos não iônicos ALKEST® CSO 400 H (A) e
Tween® 80 (T) nas concentrações (5, 10, 20 e 40 g/L), frente aos cinco micro-organismos testes, após 28 dias de
incubação.
Inóculos iniciais: 105 células/mL para bactérias e 104 células/mL para fungo e levedura.
59
Na combinação de metilparabeno com 10 g/L e 5 g/L de Tween® 80 ocorreu

uma redução na contagem para a Candida albicans após 28 dias de incubação. Não
houve redução de 2 logs no crescimento microbiano para os demais micro-
organismos.
O conservante Phenonip® (mistura de fenoxietanol com metil-, etil-, propil-,
butil e isobutilparabeno) apresentou incompatibilidade frente aos tensoativos não
iônicos, pois o crescimento dos micro-organismos utilizados no teste, não foi
reduzido a 2 logs, como descritos na Farmacopéia Brasileira (BRASIL, 2010), pelo
contrário, o número de UFC/mL dos micro-organismos aumentou entre os dias 14º e
28º dias.
DeLuca e Kostenbauder (1960) relataram que a concentração inibidora de
dois conservantes catiônicos, cloreto de cetilpiridínio e cloreto de benzalcônio, foi
reduzida na presença de Tween® 80 com a bactéria Enterobacter aerogenes.
Corroborando com os resultados obtidos nessa pesquisa, Brown e Richards
(1964) relataram que a atividade de cloreto de benzalcônio com menor concentração
de clorexidina, foi aumentada por uma baixa concentração (0,02%) de Tween ® 80,
mas que em concentração mais elevada (0,5%) eliminou completamente o efeito
antimicrobiano de ambos os conservantes. Kurup et al. (1991) apresentaram
resultados semelhantes, quando estudaram o efeito de diferentes concentrações de
Tween® 80 sobre metilparabeno, fenoxietanol, e clorocresol contra Pseudomonas
aeruginosa.
Schwarb et. al. (2001) testou a qualidade microbiológica de produtos
cosméticos encontrados no mercado Suíço. Dos 11 produtos (de cuidados da pele
suíços e formulações internacionais) da marca envolvida no surto da P. lilacinus
invasiva, 3 marcas contendo os conservantes metilparabeno, propilparabeno,
etilparabeno e fenoxietanol, não cumpriram os critérios de eficácia da preservação
antimicrobiana frente aos micro-organismos Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus, Candida albicans, Aspergillus niger.
Muitos conservantes são utilizados em preparações farmacêuticas e uma
variedade de interações ocorre entre conservantes e a fase oleosa emulsionada e as
moléculas ou micelas de emulsificantes.
Segundo Schmolka (1973) esses resultados podem ser devido ao fato de que
por diversos conservantes apresentarem características lipofílicas, como é o caso
dos parabenos, esses compostos tornam-se susceptíveis de solubilização micelar
60
por emulsificantes. Acima da concentração micelar crítica, há uma diminuição na

concentração aquosa livre de conservante e, consequentemente, uma diminuição na
atividade antimicrobiana.
Segundo o Guia ABC de microbiologia (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE
COSMETOLOGIA, 2014), os parabenos são inativados (parcialmente ou
completamente) por fontes ligantes de hidrogênio, tais como os compostos
altamente etoxilados, como os polissorbatos (Tween® 80 a 3%) e outros compostos,
como os derivados de celulose, proteínas e lecitinas e isso pode explicar os
resultados observados na Figura 7.
Os resultados obtidos com a contagem de micro-organismos viáveis neste
estudo utilizando o conservante Verstatil® BP (0,5%) frente aos dois tensoativos não
iônicos (ALKEST® CSO 400 H e Tween® 80) separadamente, foi eficaz, pois
apresentou redução logarítmica (2 logs) na contagem de micro-organismos viáveis
após 28 dias de incubação (Figura 8). O conservante Verstatil® PC na combinação
com o ALKEST® CSO 400 H foi eficaz frente ao fungo Aspergillus niger, pois
conseguiu reduzir a concentração de UFC/mL nos dias 14 e 28 em comparação ao
inoculo inicial.
Na combinação com o emulsificante ALKEST® CSO 400 H nas concentrações
testadas (5, 10, 20 e 40 g/L) o conservante Verstatil® PC (0,5%) não apresentou uma
conservação eficaz, pois houve um aumento do crescimento entre os dias 14º e 28º
de incubação dos micro-organismos Candida albicans nas concentrações 40, 20 e
10 g/L, para Escherichia coli nas concentrações 40, 20 e 10 g/L e para
Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus na concentração de 40, 20, 10 e
5 g/L (Figura 8).
Nas concentrações de 5 g/L de ALKEST® CSO 400 H com o conservante
Verstatil® PC (Figura 8) a levedura Candida albicans permaneceu com a mesma
concentração do inóculo inicial no 14º dia e reduziu 2 logaritmos no 28º dia. Já para
a bactéria Escherichia coli houve uma redução logarítmica de 2 logs no 14º dia em
relação ao inóculo inicial, mas permaneceu com a mesma contagem no 28º dia nas
concentrações de 5 e 10 g/L.
61

Verstatil® BP e PC (0,5%) e os tensoativos não iônicos ALKEST® CSO 400 H (A) e Tween® 80 (T), nas
concentrações (5, 10, 20 e 40 g/L), frente aos cinco micro-organismos testes, após 28 dias de incubação.
O conservante Verstatil® PC (0,5%) na combinação com o tensoativo Tween®

80 na concentração de 20 g/L (Figura 8), a levedura Candida albicans permaneceu
com a mesma quantidade de UFC/mL entre o 14º e 28º dias de incubação.
O fenoxietanol (principal componente do Verstatil® BP e PC) possui um amplo
espectro de ação contra bactérias Gram-negativas e Gram-positivas e pouca
62
eficiência para fungos. Recomenda-se a associação com outro conservante para

potencializar a ação antimicrobiana (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE
COSMETOLOGIA, 2014), confirmando o bom resultado frente aos tensoativos não-
iônicos do Verstatil® BP (associação de fenoxietanol com benzoato de sódio).
A baixa conservação antimicrobiana da associação de Verstatil ® PC e o
ALKEST® CSO 400 H pode estar relacionada com a incompatibilidade do
fenoxietanol, principal agente conservante, com tensoativos não iônicos (ROWE;
SHESKEY; QUINN, 2009). O fenoxietanol no Verstatil® PC está associado com um
emoliente caprililglicol, que por si só não é considerado um conservante, mas em
conjunto com um conservante pode potencializar a ação antimicrobiana. Esta
potenciação é de maior interesse no caso dos micro-organismos mais resistentes,
como Gram-negativos e fungos (PINTO; KANEKO; PINTO, 2015).
A associação do Verstatil® PC com os tensoativos não iônicos, bem como as
outras duas associações estudadas (metilparabeno e tensoativos não iônicos;
Phenonip® e tensoativos não iônicos), apresentaram baixa conservação frente aos
micro-organismos quando comparadas à associação de Verstatil® BP e tensoativos
não iônicos.
Os resultados obtidos com a contagem de micro-organismos viáveis no
estudo utilizando os conservantes metilparabeno e Phenonip® na concentração de
0,2% e Verstatil® BP e PC na concentração de 0,5% com 2 e 4 g/L de
carboximetilcelulose estão expressados na Figura 9.
Os resultados obtidos com a contagem de micro-organismos viáveis neste
estudo utilizando o conservante metilparabeno (0,2%) e Phenonip® (0,2%) frente a
carboximetilcelulose sódica, nas concentrações de 2 e 4 g/L, apresentaram alta
compatibilidade a qual pode ser verificada pela redução logarítmica (2 logs) na
contagem de quase todos os micro-organismos viáveis após 28 dias de incubação
(Figura 9).
Para o fungo Aspergillus niger e a levedura Candida albicans houve redução
logarítmica do inóculo inicial para o 14º dia e permaneceu após 28º dias, exceto na
concentração 2 g/L com o conservante Verstatil® PC frente a levedura Candida
albicans.
63
Figura 9: Efeito da redução do crescimento microbiano em UFC/mL na combinação entre os conservantes

metilparabeno (M) (0,2%), Phenonip® (P) (0,2%), Verstatil® BP e PC (0,5%) e carboximetilcelulose sódica
nas concentrações 2 e 4 g/L, frente aos cinco micro-organismos testes após 28 dias de incubação.
Os resultados da combinação de 0,2% de metilparabeno com 2 g/L de

carboximetilcelulose sódica não foram satisfatórios para a bactéria Pseudomonas
64
aeruginosa na combinação de, pois não apresentaram redução logarítmica (2 logs)

na contagem de UFC/mL após 14 dias de incubação (Figura 9).
A bactéria Staphylococcus aureus foi resistente à conservação de 0,2% de
metilparabeno e Phenonip® em 2 g/L de carboximetilcelulose sódica, apresentando
redução logarítmica (2 logs) na contagem de UFC/mL no 14º dia, mas aumentou a
população microbiana após 28 dias de incubação. Os dois conservantes
(metilparabeno e Phenonip®) foram eficazes em 2 g/L de carboximetilcelulose frente
a bactéria Escherichia coli, reduzindo 2 logaritmos após 14 dias de incubação em
comparação ao inóculo inicial (105 células/mL).
Na concentração de 4 g/L de carboximetilcelulose sódica, a combinação com
0,2% de metilparabeno e Phenonip® diminuíram a quantidade de UFC/mL das
bactérias Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa em concentração ao inóculo
inicial para o 14º dia e permaneceram com a mesma quantidade após 28º dia de
incubação (Figura 9). O metilparabeno diminuiu também a quantidade de UFC/mL
da bactéria Staphylococcus aureus após 28 dias de incubação.
Muitas das combinações incompatíveis que reconhecidamente inativam os
conservantes contêm macromoléculas, incluindo vários derivados de celulose,
polietilenoglicóis e gomas naturais. Dentre essas macromoléculas, está a goma
adraganta, que pode atrair e reter alguns conservantes, como os parabenos e os
compostos fenólicos, tornando-os inaptos para realizar sua função (ALLEN JUNIOR;
POPOVICH; ANSEL, 2013).
O efeito da concentração de 2 g/L de carboximetilcelulose sódica com o
conservante Verstatil® PC não foi satisfatório, pois houve um aumento do número de
UFC/mL após 28 dias de incubação para os micro-organismos Candida albicans,
Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus. O conservante Verstatil® BP
não foi satisfatório frente as bactérias Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e
Staphylococcus aureus.
A atividade do fenoxietanol (principal ativo do Verstatil® BP e PC) contra
Pseudomonas aeruginosa na presença de derivados de celulose foi estudada por
Kurup et al. (1995), onde a atividade dos conservantes, em diferentes
concentrações, foram reduzidos na presença de macromoléculas. Independente da
combinação entre os conservantes e o derivado de celulose, a interação entre eles
foi um dos mecanismos predominante para a redução da atividade. Todos os micro-
65
organismos (Staphylococcus spp, Bacillus spp e Micrococcus spp) testados por

Flores, Morillo e Crespo (1997) foram resistentes do fenoxietanol 0,4%.
metilparabeno (M) (0,2%) e Phenonip® (P) (0,2%) e goma xantana, nas concentrações (1, 3, 5 e 7 g/L),
frente aos cinco micro-organismos testes, após 28 dias de incubação.
Já para goma xantana em todas as concentrações analisadas (1, 3, 5 e 7 g/L)

na combinação com metilparabeno (0,2%) e Phenonip® (0,2%), os micro-organismos
Aspergillus niger e Candida albicans diminuíram a quantidade de UFC/mL da
66
concentração inicial (104 células/mL) para o 14º dia e permaneceram com a mesma
quantidade de UFC/mL entre os dias 14 e 28 de incubação. (Figura 10)
Em todas as concentrações de goma xantana (1, 3, 5 e 7 g/L) na combinação
com o conservante metilparabeno (0,2%) a bactéria Escherichia coli teve redução
logarítmica (2 logs) de UFC/mL após 28 dias de incubação, portanto o conservante
foi eficaz.
A Pseudomonas aeruginosa apresentou redução logarítmica frente à goma
xantana na concentração de 1 g/L na combinação com o conservante metilparabeno
(0,2%) e para as demais concentrações (3, 5 e 7 g/L) o conservante não teve sua
ação microbiana eficaz para esta bactéria.
Na concentração de 3 g/L de goma xantana na combinação com o
conservante metilparabeno (0,2%) a bactéria Staphylococcus aureus apresentou
uma redução de 2 log da concentração inicial (105 células/mL) para o 14º dia, mas
apenas 1 log após 28 dias. Na concentração de 5 g/L houve a redução de 2 logs
após 28º dias, mostrando que o conservante foi eficaz nessas das concentrações de
goma xantana.
O conservante Phenonip® (0,2%) na combinação 1 e 5 g/L de goma xantana
(Figura 10), não apresentou uma conservação eficaz para as bactérias Escherichia
coli e Pseudomonas aeruginosa, pois não houve uma redução logarítmica de mais
de 2 logs após 28 dias de incubação. Para a bactéria Staphylococcus aureus na
concentração de 1, 3 e 5 g/L de goma xantana houve redução logarítmica de 2 logs
após 28 dias de incubação.
Segundo Doorne (2007), espessantes semissintéticos, tais como a celulose
modificada, pode diminuir a concentração de conservantes. Portanto, se aumentar a
concentração do conservante a tendência é de diminuir o crescimento dos micro-
organismos.
Os conservantes Verstatil® BP e PC (0,5%) foram eficazes para os micro-
organismos Aspergillus niger e Cadida albicans em todas as concentrações de (1, 3,
5 e 7 g/L) de goma xantana. Na concentração de 1 g/L de goma xantana (Figura 11),
houve redução do crescimento das bactérias Escherichia coli e Pseudomonas
aeruginosa no 14º dia em comparação com o inoculo inicial.
A ação antimicrobiana do Verstatil® PC não foi eficaz para as bactérias
Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa, pois houve um aumento do
67
crescimento entre 14º e 28º dia de incubação dos micro-organismos nas

concentrações de 3, 5 e 7 g/L de goma xantana.
Verstatil® BP e PC (0,5%) e goma xantana nas concentrações (1, 3, 5 e 7 g/L), frente aos cinco micro-
organismos testes, após 28 dias de incubação.
A partir dos resultados do estudo da compatibilidade entre os conservantes e

excipientes, foi verificado a eficácia dos conservantes (metilparabeno, Phenonip®,
Verstatil® BP e PC) quando misturados com a carboximetilcelulose sódica frente aos
micro-organismos, exceto para S. aureus. Já para a goma xantana, houve
resistência das bactérias Gram-negativas Escherichia coli e Pseudomonas
68
aeruginosa nas maiores concentrações de goma xantana, dificultando a

homogeneização e consequentemente a disponibilidade do conservante na
formulação.
O conhecimento detalhado de como estas interações entre os componentes
da formulação interferem na eficácia dos agentes antimicrobianos podem ser
prejudiciais à conservação do produto serve de base para um melhor cuidado no
desenvolvimento de formulações, pois esses sistemas conservantes são
amplamente empregados na manipulação de cosméticos.
Tabela 1 – Análise da compatibilidade entre conservantes (metilparabeno, Phenonip ®, Verstatil® BP e

PC) e excipientes (Alkest CSO 400 H®, Tween® 80, carboximetilcelulose sódica, goma xantana) em
diferentes concentrações, frente aos 5 micro-organismos testes.
Excipientes Concentração Metilparabeno Phenonip Verstatil BP Verstatil PC
+ (A; C; E; P; S) + (A; C; E; P; S) - (A; C; E; P; S) - (A; C; E)

5
+ (S; P)
+ (A; C; E; P; S) + (A; C; E; P; S) - (A; C; E; P; S) - (A; E)
10
+ (C; S; P)
Alkest® CSO 400 H
+ (A; C; E; P; S) + (A; C; E; P; S) - (A; C; E; P; S) - (A)
20
+ (C; E; S; P)
+ (A; C; E; P; S) + (A; C; E; P; S) - (A; E; P; S) - (A)
40
+ (C) + (C; E; S; P)
- (C) + (A; C; E; P; S) - (A; E; P; S) - (A; E; P)
5
+ (A; E; P; S) + (C) + (C; S)
- (C) + (A; C; E; P; S) - (A; C; E; P; S) - (A; C)
10
+ (A; E; P; S) + (E; S; P)
Tween® 80
+ (A; C; E; P; S) + (A; C; E; P; S) - (A; C; E; P; S) - (A; C)
20
+ (E; S; P)
+ (A; C; E; P; S) + (A; C; E; P; S) - (A; E; P; S) - (A)
40
+ (C) + (C; E; S; P)
- (A; C; E) - (A; C; E; P) - (A; C; E) - (A; C; E)
2
Carboximetilcelulose + (P; S) + (S) + (P; S) + (P; S)
sódica - (A; E; P; S) - (A; C; E; P - (A; C) - (A; C; E)
4
+ (C) + (S) + (E; P; S) + (P; S)
- (A; C; E; P) - (A; C; S) - (A; C; E; P) - (A; C; E; P)
1
+ (S) + (E; P) + (S) + (S)
- (A; C; E; S) - (A; C; S) - (A; C; E; P) - (A; C; E)
3
Goma + (P) + (E; P) + (S) + (P; S)
Xantana - (A; C; E; S) - (A; C; S) - (A; C; E; S) - (A; C; S)
5
+ (P) + (E; P) + (P) + (E; P)
- (A; C) - (A; C) - (A; C; E; S) - (A; C)
7
+ (E; P; S) + (E; P; S) + (P) + (E; P; S)
Legenda: Aspergillus niger (A); Candida albicans (C); Escherichia coli (E); Pseudomonas aeruginosa
(P); Staphylococcus aureus (S). Símbolo: (-) houve redução de 2 logs no crescimento de bactérias e
não houve aumento do crescimento de fungos; (+) não houve redução de 2 logs no crescimento de
bactérias e houve aumento do crescimento de fungos.
5.2 Teste de Eficácia do Sistema Conservante – Teste do Desafio
Após os resultados de compatibilidade obtidos nos testes dentre conservantes

e excipientes, foram escolhidos o Verstatil® BP por apresentar o melhor resultado
frente aos tensoativos não iônicos e as macromoléculas, o metilparabeno por ser um
69
conservante muito utilizado em cosmético e o Phenonip ® por ser uma mistura de

vários conservantes, mesmo não apresentando um resultado satisfatório no teste
com os excipientes.
As formulações de microemulsões e nanoemulsões adicionadas de 0,2% de
metilparabeno, 0,2% de Phenonip® e 0,5% de Verstatil® BP foram desafiados com
cada um dos cinco micro-organismos e, em períodos de tempo pré-determinados (7,
14 e 28 dias). As amostras dessas formulações foram diluídas e inoculadas em meio
sólido para a contagem de micro-organismos viáveis presentes nas formulações.
Os resultados do teste do desafio das emulsões com os conservantes
metilparabeno, Verstatil® BP e Phenonip® podem ser observados nas Figuras 12, 13,
14.
Os inóculos microbianos (105 UFC/mL) foram obtidos a partir de uma diluição
de uma suspenção de células equivalente a escala nefelométrica 0,5 de MacFarland
(1,5 x 108 UFC/mL). Sendo assim, depois de padronizadas quanto à turbidez, foi
realizada a contagem padrão em placas a fim de verificar se a densidade da carga
microbiana estava dentro do preconizado. Analisando os resultados, foi verificado
que no tempo zero as contagens de micro-organismos estavam na ordem de 105
UFC/mL, isto é o desejável em um teste do desafio, pois desta forma se verifica a
quantidade inicial de inóculo adicionada.
No tempo zero, o contato entre o micro-organismo e o conservante presente
na formulação é muito rápido, não permitindo que ocorra uma diminuição da carga
microbiana.
De acordo com a Farmacopeia Brasileira (BRASIL, 2010), nos critérios para
eficácia antimicrobiana, a microemulsão e a nanoemulsão enquadram-se na
categoria 2 (produtos de uso tópico, constituídos de base, ou veículo aquoso,
produtos nasais não estéreis e emulsões, incluindo aqueles aplicados em
membranas mucosas). Portanto o critério baseia-se na redução de 2 log no número
de UFC/mL inicialmente inoculados para bactérias no 14º dia, e no 28º dia a
contagem não deve aumentar em relação ao 14º dia. Já para bolores e leveduras
não deve haver aumento no número de UFC/mL inicialmente inoculados no 14º e
28º dia.
70
Figura 12 – Testes de eficácia do conservante metilparabenos (M) na concentração de 0,2% em

micro e nanoemulsão, frente aos cinco micro-organismos testes.
71
Figura 13 – Testes de eficácia do conservante Verstatil® BP (BP) na concentração de 0,5% em

micro e nanoemulsão, frente aos cinco micro-organismos testes.
Formulações de microemulsão e nanoemulsão, os conservantes

metilparabeno (0,2%) Verstatil® BP (0,5%) não foram eficazes, por não apresentar
redução logarítmica (2 logs) na contagem de micro-organismos viáveis após 14 dias
de incubação.
Nas emulsões, o metilparabeno (0,2%) não foi eficaz e segundo Rowe,
Sheskey e Quinn (2009), por apresentar uma atividade antimicrobiana baixa quando
72
utilizado individualmente, sua atividade pode ser melhorada através da utilização de

combinações com outros parabenos como efeitos sinérgicos. As combinações de
fenoxietanol com metil-, etil-, propil-, butil e isobutilparabeno são usados com
frequência em conjunto, como é o caso do conservante Phenonip ®. Pode-se também
adicionar outros excipientes, tais como: propileno glicol (2-5%); álcool feniletílico e
EDTA.
Assim como muitos conservantes, os parabenos apresentam uma atividade
antimicrobiana reduzida na presença de alguns surfactantes não-iônicos,
usualmente utilizados em formulações de cremes (PharmaSpecial, 2004). Em
virtude da não eficácia do metilparabeno em emulsões, houve a necessidade de
testar o Phenonip® para verificar sua resposta antimicrobiana em formulações
semissólidas.
Shaqra, Al-Momani e Al-Groom (2014) inocularam Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus em cosméticos como xampu,
creme para as mãos e condicionador contendo os conservantes metilparabeno,
propilparabeno e DMDM hidantoína na concentração de 0,2% e imidazolidinil ureia
na concentração de 0,3%. Eles observaram que a bactéria Pseudomonas
aeruginosa foi resistente a todos os conservantes. As outras bactérias variaram na
sua resistência, mas a bactéria Staphylococcus aureus foi resistente ao conservante
metilparabeno e a Escherichia coli foi resistente aos dois conservantes.
Como esperado, a resistência aos conservantes variou de um micro-
organismo para outro, o que justifica a necessidade de associações de vários
conservantes.
Santos (2006) verificou a eficácia após 28 dias em creme Lanette ® com a
mistura dos conservantes metilparabeno (0,2%) e propilparabeno (0,1%), quando
inoculado com as bactérias Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus.
O resultado obtido com o conservante Verstatil® BP incorporado na fase
oleosa das emulsões foi um pouco inesperado, pois se esperava um resultado de
eficácia como no estudo frente aos dois tensoativos (ALKEST ® CSO 400 H e
Tween® 80) com a redução logarítmica (2 logs) na contagem de micro-organismos
viáveis após 28 dias de incubação.
73
Figura 14 – Testes de eficácia dos conservantes Phenonip® (P) na concentração de 0,2% em micro
e nanoemulsão, frente aos cinco micro-organismos testes.
Parker, McCafferty, Macbride (1968) e Wallhausser (1984) relatavam uma

variedade de agentes antimicrobianos cuja interação demonstrou sinérgia, como
Phenonip®, composto por fenoxietanol com metil-, etil-, propil-, butil e
isobutilparabeno. Conservantes antimicrobianos pertencentes aos mesmos grupos
químicos são utilizados para produzir efeitos aditivos quando utilizados em
combinação. O presente estudo da eficácia do conservante frente aos excipientes e
74
incorporados em micro e nanoemulsões mostra que em ensaios simples entre

conservante e excipientes, nem sempre reproduzem os mesmos resultados em
produtos prontos para comercialização.
O conservante Phenonip® teve pouca ação frente aos excipientes quando
testado isoladamente, mas quando incorporado na microemulsão e nanoemulsão
apresentou ação antimicrobiana frente aos micro-organismos. Este resultado
corrobora com os resultados encontrados por Smaoui e Hlima (2012) que testaram o
Phenonip® em xampu para crianças frente aos micro-organismos Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans e Aspergillus
niger que apresentaram eficácia após 14 dias de incubação. As combinações de
parabenos mostraram ter um efeito sinérgico sobre as bactérias como anteriormente
descritas por Doron (2001).
É importante dar atenção especial às combinações de excipientes com
conservantes e suas concentrações. Produtos cosméticos que contenham muitos
ingredientes podem ter um efeito sinérgico ou antagônico sobre o efeito dos
conservantes contra os micro-organismos (STEINBERG, 2006). A atividade do
sistema conservante deve ser testada no produto a ser preservado, pois vários
fatores, incluindo ingredientes e projeto/planejamento de formulação, podem
influenciar a ação do conservante.
Os resultados demonstram a necessidade de conhecer a eficácia dos
sistemas conservantes quando incorporados em formulações contendo excipientes
capazes de neutralizar a ação dos conservantes, pois embora sejam
incompatibilidades farmacêuticas descritas na literatura, o potencial de inativação e a
intensidade com que ocorre depende ainda do tipo de excipiente (classe química) e
dos demais componentes da formulação, da composição dos sistemas
conservantes, da proporção entre excipiente e conservante e disponibilidade destes
na formulação.
75
6 CONCLUSÕES
Os estudos de influência dos tensoativos não iônicos Alkest ® e Tween® 80 na

ação antimicrobiana dos sistemas conservantes mostraram que o metilparabeno e o
Phenonip® foram inativados na presença dos tensoativos testados independente da
concentração dos mesmos.
Os dois conservantes livres de parabenos avaliados, Verstatil ® BP e PC,
sofreram menor influência dos tensoativos do que os sistemas contendo parabenos.
O Verstatil® BP foi eficaz em todas as condições testadas, exceto para Candida
albicans na presença dos tensoativos a 40 g/L, enquanto Verstatil ® PC, embora com
resultados melhores do que os obtidos com os parabenos, se mostrou eficaz
somente para o Aspergillus niger, Candida albicans e Escherichia coli.
Os sistemas conservantes analisados (metilparabeno, Phenonip ®, Verstatil®
BP e PC) foram eficazes frente ao Aspergillus niger e Candida albicans quando na
presença de carboximetilcelulose sódica em diferentes concentrações. Frente às
bactérias a resposta conservante dependeu do micro-organismo, não sendo eficaz
na presença da bactéria gram-positiva Staphylococcus aureus.
Um comportamento semelhante de eficácia dos conservantes frente ao
Aspergillus niger e Candida albicans foi observado na presença da goma xantana.
Quando na presença das bactérias, os conservantes Phenonip ®, Verstatil® PC
sofreram inativação pela goma xantana em diferentes concentrações da mesma,
enquanto o metilparabeno e o Verstatil® BP mantiveram a eficácia na maioria das
condições testadas.
Os conservantes metilparabeno (0,2%), Phenonip® (0,2%) e Verstatil® BP
(0,5%) foram incorporados em microemulsão e nanoemulsão. Todos os
conservantes mostraram eficácia frente à contaminação das formulações por
Aspergillus niger. O metilparabeno e o Verstatil® BP não foram eficazes frente à
Candida albicans, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus
aureus no teste do desafio do conservante.
O Phenonip® na concentração de 0,2% mostrou-se eficaz como sistema
conservante quando incorporado nas formulações nanoemulsionadas (micro e
nanoemulsão), mantendo a qualidade microbiológica das formulações quando
exposto aos micro-organismos testados, exceto para a Candida albicans.
76
77
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Universidade Federal de Minas Gerais, 2004.
85
ANEXO A
Descrições dos meios de cultura de acordo com o manual do fabricante
Caldo Nutriente
Digestão péptica de tecido animal.........................................................................5,0 g

Extrato de levedura................................................................................................1,5 g
Extrato de carne bovina..........................................................................................1,5 g
Cloreto de sódio.....................................................................................................5,0 g
pH após esterilização.......................................................................................7,4 ± 0,2
Agar Muller Hinton
Infusão de Carne Bovina....................................................................................300,0 g

Caseína Ezimática Hidrolisada............................................................................17,5 g
Amido.....................................................................................................................1,5 g
Agar......................................................................................................................17,0 g
Agar Sabouraud Dextrose
Dextrose...............................................................................................................40,0 g
Peptonas..............................................................................................................10,0 g
Agar......................................................................................................................15,0 g
Água purificada................................................................................................1000 mL
Ágar Caseína Soja
Peptona de caseína pancreática..........................................................................15,0 g

Farinha de soja obtida por digestão papaínica......................................................5,0 g
Cloreto de sódio ....................................................................................................5,0 g
Agar .....................................................................................................................15,0 g
86
Caldo Caseína Soja
Peptona de Caseína pancreática.........................................................................17,0 g

Farinha de soja obtida por digestão papaínica......................................................3,0 g
Cloreto de sódio.....................................................................................................5,0 g
Fosfato de potássio dibásico..................................................................................2,5 g
Glicose monoidratada............................................................................................2,5 g
pH após esterilização......................................................................................7,3 ± 0,2
Esterilização e acondicionamento dos meios de cultura

Meios em placas
Esterilizar o meio a 121 ºC durante 15 minutos e distribuir, assepticamente, em

placas de Petri estéreis. Conservar sobre refrigeração até o uso por no máximo uma
semana.
Meios líquidos
Dissolver os ingredientes do meio e distribuir nos frascos. Esterilizar a 121 ºC

durante 15 minutos. Conservar sobre refrigeração até o uso.
APÊNDICE A
Efeito da redução do crescimento microbiano na combinação entre conservante metilparabeno (M) e Phenonip® (P) (0,2%) e os tensoativos não
iônicos ALKEST® CSO 400 H e Tween® 80, frente aos cinco micro-organismos testes.
Concentração ALKEST ® Tween® 80

Tensoativos Micro-organismo 14 d 28 d 14 d 28 d
não iônicos M P M P M P M P
Aspergillus niger 103 107 108 > 108 > 108 104 > 108 107
Candida albicans 107 107 107 107 > 108 > 108 > 108 107
40 g/L Escherichia coli > 108 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108
Pseudomonas aeruginosa > 108 > 108 107 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108
Staphylococcus aureus > 108 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108
Aspergillus niger 107 107 107 > 108 103 107 107 106
Candida albicans 107 107 107 107 107 > 108 107 > 108
20 g/L Escherichia coli > 108 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108
Pseudomonas aeruginosa > 108 > 108 107 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108
Staphylococcus aureus 107 > 108 107 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108
Aspergillus niger > 108 105 > 108 107 108 104 106 107
Candida albicans 106 > 108 107 > 108 104 107 103 > 108
10 g/L Escherichia coli 107 > 108 107 > 108 107 > 108 107 > 108
Pseudomonas aeruginosa > 108 > 108 > 108 107 > 108 > 108 > 108 > 108
Staphylococcus aureus > 108 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108
Aspergillus niger > 108 > 108 > 108 > 108 103 103 106 106
Candida albicans 107 107 108 > 108 104 107 10² 107
5 g/L Escherichia coli 107 > 108 103 > 108 106 > 108 < 10¹ > 108
Pseudomonas aeruginosa 107 > 108 107 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108
Staphylococcus aureus > 108 > 108 > 108 > 108 107 > 108 107 > 108
87
88
APÊNDICE B
Efeito da redução do crescimento microbiano na combinação entre conservante Verstatil® BP e PC (0,5%) e os tensoativos não iônicos ALKEST®
CSO 400 H e Tween® 80, frente aos cinco micro-organismos testes.
Concentração ALKEST ® Tween® 80

Tensoativos Micro-organismo 14 d 28 d 14 d 28 d
não iônicos BP PC BP PC BP PC BP PC
Aspergillus niger < 101 < 101 < 101 < 101 < 101 < 101 < 101 < 101
Candida albicans 106 107 104 106 107 107 104 107
40 g/L Escherichia coli 103 >108 101 105 < 101 >108 < 101 102
Pseudomonas aeruginosa 103 105 < 101 >108 102 >108 < 101 103
Staphylococcus aureus 104 >108 102 >108 < 101 >108 < 101 103
Candida albicans < 101 103 102 105 104 104 < 101 104
20 g/L Escherichia coli < 101 107 < 101 106 < 101 106 < 101 102
Pseudomonas aeruginosa < 101 >108 10¹ >108 10² >108 101 105
Staphylococcus aureus < 101 >108 < 101 105 < 101 >108 < 101 105
Candida albicans < 101 105 < 101 105 < 101 104 < 101 102
10 g/L Escherichia coli 103 103 < 101 103 101 106 102 103
Pseudomonas aeruginosa < 101 106 < 101 104 10² >108 < 101 103
Staphylococcus aureus 104 >108 < 101 < 101 < 101 >108 < 101 103
Candida albicans < 101 104 < 101 102 102 103 < 101 < 101
5 g/L Escherichia coli 102 101 101 101 102 102 102 102
Pseudomonas aeruginosa < 101 >108 < 101 < 101 < 101 >108 < 101 104
Staphylococcus aureus 101 101 < 101 > 108 102 < 101 < 101 < 101
APÊNDICE C
Efeito da redução do crescimento microbiano na combinação entre os conservantes metilparabeno e Phenonip® (0,2%) e Verstatil® BP e PC (0,5%)
e a carboximetilcelulose sódica, frente aos cinco micro-organismos testes.
Carboximetilcelulose sódica
Concentração Micro-organismo 14 d 28 d
M P BP PC M P BP PC
Aspergillus niger < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹
Candida albicans < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ 10²
2 g/L Escherichia coli < 10¹ < 10¹ 10² < 10¹ 10¹ < 10¹ 10¹ 10³
Pseudomonas aeruginosa 104 10³ 10¹ < 10¹ 10³ < 10¹ 10² 10²
Staphylococcus aureus 10² 10¹ 108 106 104 10² >108 105
Aspergillus niger < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹
Candida albicans < 10¹ < 10¹ < 10¹ 10¹ 10² 10¹ 10¹ < 10¹
4 g/L Escherichia coli 103 10² 105 10¹ 10³ 10² < 10¹ < 10¹
Pseudomonas aeruginosa < 10¹ 10³ < 10¹ < 10¹ < 10¹ 10³ 10¹ 10²
Staphylococcus aureus 10³ 104 > 108 106 10³ 10³ >108 >108
89
90
APÊNDICE D
Efeito da redução do crescimento microbiano na combinação entre os conservantes metilparabeno e Phenonip ® (0,2%) e Verstatil® BP e PC (0,5%) e a
goma xantana, frente aos cinco micro-organismos testes.
Goma xantana
Concentração Micro-organismo 14 d 28 d
M P BP PC M P BP PC
Candida albicans 102 < 101 < 101 < 101 101 < 101 < 101 < 101
1 g/L Escherichia coli 102 105 102 102 102 103 102 102
Pseudomonas aeruginosa 103 >108 10³ 104 103 103 10³ < 101
Staphylococcus aureus 106 102 >108 >108 105 102 >108 >108
Candida albicans < 101 < 101 < 101 < 101 < 101 < 101 < 101 101
3 g/L Escherichia coli 101 >108 101 10² < 101 >108 < 101 10²
Pseudomonas aeruginosa >108 >108 10³ 106 >108 >108 10² >108
Staphylococcus aureus 103 102 < 101 10³ 102 < 101 102 105
Aspergillus niger < 101 < 101 < 101 < 101 < 101 101 < 101 101
Candida albicans < 101 102 < 101 < 101 < 101 101 < 101 101
5 g/L Escherichia coli < 101 >108 10² 106 < 101 >108 102 102
Pseudomonas aeruginosa >108 >108 106 106 >108 106 >108 106
Staphylococcus aureus < 101 103 < 101 103 < 101 103 < 101 103
Candida albicans < 101 104 < 101 104 < 101 102 < 101 101
7 g/L Escherichia coli < 101 >108 < 101 < 101 102 >108 < 101 102
Pseudomonas aeruginosa 105 106 105 106 105 107 105 >108
Staphylococcus aureus < 101 105 102 105 104 < 101 < 101 104
APÊNCIDE E
Testes de eficácia dos conservantes metilparabenos (M) e Phenonip® na concentração de 0,2% e de Verstatil® BP (BP) na concentração de 0,5%
em microemulsão, frente aos cinco micro-organismos testes.
7d 14 d 28 d
Micro-organismo
M P BP M P BP M P BP
Aspergillus niger 10¹ 10² 10¹ 10² 10¹ 10² 10¹ < 10¹ 10¹
8 8 5 5 8 8
Candida albicans > 10 > 108 > 10 10 10 > 10 > 10 103 > 108
Microemulsão Escherichia coli < 10¹ 104 < 10¹ < 10¹ 103 104 < 10¹ 10² > 108
Pseudomonas < 10¹ 103 104 < 10¹ 103 10³ 10³ < 10¹ > 108
aeruginosaaureus
Staphylococcus > 108 105 < 10¹ < 10¹ 10² > 108 > 108 < 10¹ > 108
Aspergillus niger 10¹ 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹
6
Candida albicans > 10 8
10 8
> 10 8
> 10 8 10 > 10 8
> 10 8
104
> 108
Nanoemulsão Escherichia coli > 108 105 105 > 108 103 105 > 108 < 10¹ > 108
Pseudomonas > 108 103 > 108 > 108 103 > 108 > 108 10² > 108
aeruginosaaureus
Staphylococcus > 108 104 > 108 > 108 103 104 > 108 < 10¹ > 108
91

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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

PRISCILA DE OLIVEIRA SCHMITT

INFLUÊNCIA DE EXCIPIENTES FARMACÊUTICOS SOBRE A

PRISCILA DE OLIVEIRA SCHMITT

INFLUÊNCIA DE EXCIPIENTES FARMACÊUTICOS SOBRE A

Dissertação submetida à Universidade do Vale do

Orientador: Prof. Dr. Alexandre Bella Cruz

S56i Schmitt, Priscila de Oliveira, 1987-

Cópia de computador (Printout(s)).

1. Conservantes Farmacêuticos. 2. Excipientes Farmacêuticos.

Josete de Almeida Burg – CRB 14.ª 293

A Deus, minha família, amigos, colegas de trabalho e orientadores

Ao meu marido Leandro pelo amor, paciência e companheirismo que foram

Ao meu orientador Alexandre e co-orientadora Ruth pelos conhecimentos

As professoras Tania e Angélica pelas contribuições desde o começo, quando esta

As minhas amigas e profissionais Daniela, Melissa, Sabrina, Amanda, Helen, Laís,

A todos os professores do mestrado que de alguma forma contribuíram para a minha

Aos funcionários da UNIVALI, em especial os funcionários da secretaria e vigilantes

A Deus que está comigo em todos os momentos, me carregando e iluminando

Priscila de Oliveira Schmitt

Orientador: Alexandre Bella Cruz, Doutor.

Devido a natureza dos excipientes que as compõem, as formulações farmacêuticas

Palavras-chave: Conservantes. Controle de qualidade microbiológico. Teste de

Priscila de Oliveira Schmitt

Supervisor: Alexandre Bella Cruz, Doctor.

Keywords: Preservatives. Microbial quality control. Challenge test.

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Quadro 1 Exemplos de micro-organismos e suas prováveis fontes de

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(PARKER, 2005; ONADIPE, 2007). As formulações como emulsões, géis,

3.2 Sistema Conservantes

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Quadro 4 – Solubilidade dos parabenos em água e coeficiente de partição óleo:água.

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O Fenoxietanol é um líquido incolor, ligeiramente viscoso (Figura 3). Sua

Figura 3: Estrutura molecular do Fenoxietanol.

Fonte: ROWE; SHESKEY; QUINN, 2009.

Quadro 5 – Alguns solventes e a solubilidade do Fenoxietanol

3.2.3 Outros conservantes

O ácido benzoico é amplamente utilizado em alimentos, cosméticos, e