Diagnostic Bacteriologique Et Serologique de La Brucellose

Institut Pasteur D’Algérie
Collection Techniques Microbiologiques
Diagnostic Bactériologique
et Sérologique de La
Brucellose Humaine
M.N OUAR-KORICHI
H.SENOUCI
K.RAHAL
2ème Edition 2005
BIOLOGIE
CLINIQUE
BACTERIOLOGIE
Editions
Pirates
DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE ET SEROLOGIQUE DE LA BRUCELLOSE HUMAINE IPA 2éme édition 2005
Déjà parus dans la collection technique microbiologique :
M.N.OUAR KORICHI –M.N-H.SENOUCI-K.RAHAL Diagnostic bactériologique et sérologique de la

brucellose. ANDS 1998.33 Pages.
R.BELOUNI-H.TALI MAAMAR-K.RAHAL étude cytobactériologique et biochimique du liquide

céphalo-rachidien. ANDS 2000.52 Pages.
A.BENSLIMANI-K.RAHAL : prélèvements génitaux. ANDS 2001.128 Pages.
A.S.MERAD- H.TALI MAAMAR-K.RAHAL : Diagnostic bactériologique et antibiothérapie des

infections oculaires. ANDS 2003.40 Pages.
1
SOMMAIRE
I-INTRODUCTION : 2
II-GENERALITES 4
II-1-Définition de la brucellose : 4
II-2-Mode de transmission à l’homme : 4
II-3-Physiopathologie de la brucellose : 4
II-4-Signes cliniques de la brucellose : 5
II-5-Etiologie Bactérienne : 5
III-Epidémiologie de la brucellose : 6
III.1-Epidémiologie de la brucellose dans le monde : 6
III.2-Epidémiologie de la Brucellose en Algérie : 6
IV-Précautions à prendre au niveau du laboratoire : 8
V-Diagnostic bactériologique de la brucellose : 9
V-1-Prélèvements : 9
V-2-Modalités de culture et d’incubation : 10
V-2-1-Prélèvements mono microbiens : 10
V.2.2-Prélèvements poly microbiens : 11
V-3-Conduite à tenir devant une culture positive 12
V.3.1-Examen macroscopique des cultures 12
V.3.2-Identification du genre : 15
V.3.3-Identification d’espèce : 17
V.3.4-Détermination des Biovars 19
IV-Test de sensibilité aux antibiotiques : 22
VII-Diagnostic sérologique de la Brucellose humaine 23
VII.1-Prélèvements (3.4) : 23
VII.2-Epreuve à l’antigène tamponné (Rose Bengale) 24
VII.3-Séroagglutination de Wright (SAW) 25
VII.4-Immunofluorescence indirect (I.F.I) : 27
VII.5-Détermination des IgG, IgA, IgM par ELISA 29
VII.6-Réaction de fixation du complément (RFC) : 31
VIII-Nouvelles techniques de diagnostic : 32
VIII.1-Sérodiagnostic rapide de Brucellose humaine : 32
VII.2-Polymérase Chain Réaction (PCR) (23.24.25) 33
Annexes 34
Bibliographie
2
I-INTRODUCTION :
Selon le manuel de sécurité du laboratoire
« WHO » de l’OMS (Anon, 1993 a)(1) et
selon les normes AFNOR X42 -040 (2), la
brucellose fait partie du groupe de risque
III.
Les micro-organismes appartenant à cette

classe représentent une menace réelle pour
le personnel de laboratoire et présentent
un bas niveau de risque pour la
communauté.
Ce degré de risque varie avec la virulence

du micro-organisme (B melitensis et B suis
sont les plus dangereuses pour l’homme et
selon le nombre de bactéries dans le
prélèvement. La b brucella est un germe
aérobie strict se présentant sous forme de
petits coccobacilles à gram négatif,
immobiles non capsulés. La croissance à
35 °C sur milieu gélosé est lente (48 h
environ pour avoir des colonies).l’étude
des caractères métaboliques est très
spécifique utilisant des tests propres à
cette bactérie (uréase, lysotypie…)
La brucellose est l’une des maladies les

plus facilement acquises au laboratoire ;
afin d’éviter toute contagion, il est
indispensable de prendre certaines
mesures et précautions pour une
manipulation sans risque. (1.2).
3
II-GENERALITES II-2-Mode de
transmission à l’homme :
II-1-Définition de la
brucellose : Contact direct :
La brucellose est une pathologie qui a Pénétration du germe par voie cutanée ou
plusieurs noms : fièvre méditerranéenne, muqueuse favorisée par des blessures ou
fièvre de malte, fièvre ondulante, des excoriations) avec des animaux
mélitococcie. malades par les carcasses, produits
d’avortement (placenta, sécrétions
C’est une anthropozoonose transmise à vaginales) ou encore par contact accidentel
partir de diverses espèces animales à au laboratoire avec des prélèvements.
l’homme qui est accidentel, soit par voie
cutanéo-muqueuse (contact avec un Inhalation de poussière de litière,
animal infecté ou par un objet contaminé) d’aérosols contaminés dans un laboratoire,
soit par voie digestive (ingestion un abattoir ou une étable.
d’aliments contaminés tels produits lactés,
fromages…)
Contact direct :
Par ingestion d’aliments contaminés (lait
Seules 4 espèces sont pathogènes pour
cru, fromage frais de fabrication
l’homme :
artisanal…) (3.4).
 B melitensis
 B abortus II-3-Physiopathologie de
 B suis la brucellose :
 B.canis
La brucellose est une septicémie d’origine
Certaines professions sont lymphatique. Elle pénètre l’organisme par
particulièrement exposées tels que les plusieurs voies : cutanée, digestive ou
agriculteurs, les éleveurs, les vétérinaires, respiratoire, puis gagne par voie
personnel des abattoirs et des laboratoires. lymphatique le premier relais
ganglionnaire et s’y multiplie.
Selon A Philippon « cette
anthropozoonose a des répercussions Elle essaime par voie lymphatique et
importantes aussi bien pour la santé sanguine pour coloniser les organes ayant
publique que pour l’économie de la plupart une trame réticulo-endothéliale
des pays en voie de développement. importante (ganglions, moelle osseuse,
foie, rate).
Sa survenue chez l’homme dépend en
grande partie du réservoir animal et la La répartition des décharges bactériennes
plus forte incidence d’infection chez se traduit par une fièvre ondulante.
l’homme a lieu si l’infection existe chez le
mouton et la chèvre. Des localisations ostéo-articulaires,
glandulaires, hépatospléniques ou
Brucella fait partie des agents potentiels de neuroméningées peuvent survenir et
Bioterrorisme. continuer à évoluer pendant la phase
subaigüe.
4
Ces germes sont phagocytés plus ou moins

rapidement par les macrophages puis
détruits avec libération d’antigènes et
d’endotoxine. Ce sont des parasites intra
cellulaires facultatifs du système réticulo-
histiocytaire (splénomégalie,
hépatomégalie). Il ya réponse
immunitaire par production d’anticorps
permettant le sérodiagnostic de la maladie.
Leur rôle protecteur semble réel mais
secondaire par rapport à l’immunité
cellulaire.
L’immunité à médiation cellulaire est

essentielle pour la défense de l’organisme
contre l’infection. Les lymphocytes T
renforcent l’activité bactéricide des
macrophages qui détruisent les brucellas
au sein d’un granulome spécifique. II-5-Etiologie
Bactérienne :
II-4-Signes cliniques de
la brucellose : Le genre Brucella comprend 6 espèces sur
la base des critères culturaux,
Apres une incubation de 1 à 4 semaines métaboliques et antigéniques
(inoculation conjonctival, pharyngé,
 Brucella melitensis (1.2.3 Biovars)
cutanée), diffusion lymphatique vers les
trouvée chez la chèvre et le mouton
ganglions avec multiplication puis
 Brucella abortus (1.2.3.4.5.6.9)
essaimage dans la circulation générale
touche les bovins.
avec septicémie,
 Brucella suis (1.2.3.4.5) trouvé chez
La brucellose aigue septicémique le porc et le lièvre.
 Brucella canis trouvée chez le
est caractérisée par la fièvre ondulante
chien.
sudoro-algique de début insidieux associée
 Brucella ovis chez les ovins.
de myalgies, d’asthénie et d’arthralgie.
 Brucella neotomae chez les
Brucellose sub aigue focalisée : animaux sauvages (chevreuil,
caribou, renne).
avec apparition de foyers infectieux unique
ou multiples tels que l’atteinte ostéo- Les 4 premières espèces sont pathogènes
articulaire (spondylodiscite), chez l‘homme.
neuroméningées, endocardites, orchi-
épididymite et hépatosplénique.
Brucellose chronique : caractérisé

par une symptomatologie générale type
asthénie avec ou non poly-algie.
5
Le diagnostic de brucellose en Algérie est

III-Epidémiologie de essentiellement sérologique (épreuve à
la brucellose : l’antigène tamponné, sérodiagnostic de
Wright et parfois IFI et ELISA).
III.1-Epidémiologie de la L’IFI et l’ELISA sont réalisées uniquement
brucellose dans le à l’IPA
monde : Les résultats d’une étude sérologique
réalisée dans l’unité de sérologie
La brucellose est de répartition mondiale (Laboratoire de Bactériologie Médicale,
avec la notion de prédominance dans le IPA) sur 1739 sérums entre 1994 à 2003
bassin méditerranéen, encore l’Asie de montrent 19.03 % de sérums positifs. (Voir
l’ouest. Tableau I).
Tableau I : Résultat par années des sérums positifs
(H Senouci, K Rahal)
Année Négatifs Total Positifs % de Positifs
1994 75 96 21 21.87
1995 75 87 12 13.79
1996 56 62 6 9.67
1997 114 127 13 10.23
1998 129 135 6 4.44
Figure Worldwide incidence of human brucellosis 1999 54 56 2 3.57

(http://infection.thelancet.com).
2000 196 292 96 32.87
2001 210 256 46 17.96
III.2-Epidémiologie de la L’identification
2002 290 bactériologique
380 90 de la
23.68
brucella est rarement
248 effectuée , soit par
Brucellose en Algérie : 2003
manque
209
de ballons
39
d’hémocultures
15.72
, soit
Total 1408 1739 331 19.03
Les premières descriptions de la maladie par manque de matériel de Bactériologie
en Algérie on été faites en 1885 par Cochez appropriés tels que hottes masques ,
et en 1899 par Legrain.(7) lunettes, incinérateur soit par manque de
laboratoire de bactériologie dans la région
Durant la période allant de 1984 à 1990 : et enfin soit par crainte des techniciens de
éclosion d’une importante épidémie de laboratoire , de la manipulation de ce type
brucellose à Ghardaïa avec plus de 600 cas de prélèvements très contagieux.
due à Brucella melitensis suite à la
consommation de fromage frais de chèvre Cela peut expliquer le faible nombre de
(KEMARIA). souches isolées au laboratoire de
Bactériologie médicale de l’IPA durant la
D’autres régions ont été touchées : période allant de 1991 à 2004. (Voir
Tlemcen, Sétif (7.8). Tableau 2).
Durant la période allant de 1991 à 1998 :

les régions touchées étaient : Ghardaïa, El
Bayadh, Saida, Biskra, Khenchela, Naama,
Bechar, Msila, Tébessa, Laghouat.(7)
6
Tableau II : Les espèces et les Biovars de

Brucella isolés au laboratoire de l’IPA de 1994
à 2004 (M .Lazri, K Rahal)
Espéce/Biovar Nombre de souches

Brucella melitensis 3 65
Brucella melitensis 2 01
Brucella melitensis * 03
Total 69
(* souches isolées en 1991.1993.1995 ayant perdu le caractère lisse :
le Biovar ne peut être déterminé)
Ces souches ont été isolées de malades

présentant une fièvre au long cours dans
66 cas, 2 cas présentant une endocardite et
un cas présentant un abcès fessier.
Dans 67 cas les souches ont été isolées

d’hémocultures et 02 souches ont été
isolées de pus.
Les 69 souches proviennent des régions

suivantes : Tlemcen (22 souches), El Oued
(17souches), Constantine (06 souches).
Béni Mered (05 souches), Oran et IPA (03
souches chacun), Médéa et El Kettar (02
souches chacun) et 01 souche pour
Ghardaïa, Tébessa, Laghouat, Batna,
Berrouaghia, Msila, Sétif, Béni Messous,
Ain Sefra.
7
IV-Précautions à prendre laboratoire doté d’une hotte afin d’éviter toute

contamination du personnel de laboratoire.
au niveau du laboratoire :  Le travail doit être effectué dans le calme ,

les gestes doivent être lents, le
Tous les prélèvements bactériologiques manipulateur doit être concentré sur son
(Hémoculture, Pus, LCR, Liquide synovial, produits travail.
d’aspiration métastatique ostéo-articulaires, urines,  Toute personne travaillant sur la Brucella
crachat, Placenta, sécrétion vaginale et liquide doit être suivi médicalement avec un
séminale, liquide articulaire) provenant d’un sujet contrôle sérologique à des temps réguliers
brucellique peuvent contenir des brucelles. (tous les 6 mois).
(1.3.4.5.9.12.13.16).  Les personnes traitées par les
immunosuppresseurs et les femmes
Ces prélèvements sont contagieux par voie cutanéo- enceintes ne doivent pas être exposées aux
muqueuse à travers les excoriations ou au niveau brucelles.
des muqueuses buccales et nasales ou par voie
aérienne et conjonctivale. (3.15).
Matériel indispensable
Ces modes de transmission obligent le personnel du
laboratoire à prendre les précautions suivantes :  Hotte à flux laminaire vertical.
 Lunettes de protection.
Manipulation des prélèvements sous hotte  Masque.
obligatoire avec filtration d’air : Hotte à flux
 Gants.
laminaire vertical (2.3.16).
 Incinérateur d’anses de platine.
L’opérateur doit porter des vêtements de  Autoclave.
protection : blouses, gants, lunettes de protection et  Incinérateur.
masque respiratoire.
Il est interdit de pipeter à la bouche (utilisation de

poire ou tube de Guillemot).
Tous les instruments utilisés pour

l’ensemencement : pipettes pasteur, seringues
doivent être immergées dans des récipients en métal
autoclavables contenant de l’eau de Javel.
L’ensemble de ce petit matériel sera autoclavé puis
incinéré et le récipient sera autoclavé.
L’ensemencement se fait à l’aide d’une anse de

platine, l’incinérateur d’anse est indispensable afin
d’éviter toute projection lors de la stérilisation.
Les boites de Pétri, le prélèvement et les produits

contaminés doivent être incinérés.
Stérilisation à la chaleur (autoclave ou Poupinel) de

tout matériel : Plateaux, tubes en verre après
utilisation.
L’emploi de pipettes cotonnée st indispensable afin

de ne pas contaminer le système d’aspiration
(poire).
On ne doit pas mélanger une suspension

bactérienne par aspiration et refoulement à travers
une pipette. Il est recommandé de faire s’écouler le
liquide le long de la paroi intérieure du tube.
Vu la contagiosité importante, le diagnostic

bactériologique ne peut être fait qu’au niveau d’un
8
V-Diagnostic Mettre une étiquette su r les flacons d’hémoculture y

inscrire : le nom, le prénom du malade, l’âge, la date
bactériologique de la et l’heure du prélèvement, la température du malade

lors du prélèvement.
brucellose : Accompagner le prélèvement d’une fiche de

renseignements : (voir annexe)
V-1-Prélèvements : Faire parvenir rapidement les prélèvements au

laboratoire afin de les incuber dans une étuve à
Modalités de prélèvement : 35°C.
Si le prélèvement ne peut être acheminé au

Hémoculture : laboratoire, le laisser à la température ambiante. Ne
jamais mettre une hémoculture au réfrigérateur.
Examen fondamental qui doit être
pratiqué avant toute antibiothérapie : Le diagnostic direct ne peut se faire que dans les cas
de brucellose aigue ou de brucellose subaigüe
Les hémocultures ne sont positives que focalisée ; il est basé principalement sur
l’hémoculture : 03 hémocultures au minimum
pendant la période aigue de la maladie. doivent être réalisées.
Elles sont toujours négatives dans les

Autres prélèvements :
brucelloses chronique.(3)
Milieux utilisés : Pus :

Milieu diphasique : CASTANEDA ou Abcès superficiel ou profond.
milieu monophasique : bouillon citraté.
Matériel utilisé : seringue ou écouvillon.
Matériel utilisé :
Liquides de ponctions :
 Gants, garrot.
 Antiseptique. Selon les localisations secondaires,
 Compresses, sparadrap. différents prélèvements peuvent être
 Flacons d’hémocultures. effectués : LCR, Liquide articulaire, pus,
 Dispositif de prélèvement. liquide de ponction, secrétions vaginales.
Technique : Ces prélèvements sont aussi contagieux

que les hémocultures.
Se laver les mains, mettre des gants
Faire les prélèvements après une
Désinfecter les bouchons des flacons d’hémoculture
désinfection soigneuse.
à l’aide de l’alcool iodé.
Laver, rincer, sécher désinfecter le point de piqure à

l’aide de l’alcool iodé. (Avant bras).
Après l’asepsie, ne toucher qu’avec des doigts gantés

le site de ponction pour la palpation éventuelle.
Piquer le malade, laisser couler le sang jusqu’au

repère du flacon (environ 5 à 10 ml par adulte).
Oter l’aiguille du bras du patient, mettre un

pansement compressif.
Faire au moins 03 flacons d’hémoculture dans les 24

H à des temps différents.
9
Prélever à l’aide d’une seringue un volume de sang

V-2-Modalités de culture et après désinfection du bouchon d’hémoculture à
d’incubation : l’aide d’une compresse imbibée d’alcool à 70°C.
Déposer une goutte de sang dans chacun des milieux

V-2-1-Prélèvements mono gélosés (GSF et GSC) et sur 2 lames afin de réaliser
des frottis.
microbiens :
Jeter la seringue dans le pot d’eau de Javel.
Hémoculture : Ensemencer par stries la goutte de sang sur le milieu
gélosé.
Doit être manipulée sous hotte à flux
laminaire. Incuber sous CO2 l’ensemble des boites de Pétri
(Exigence en CO2 de B.abortus) à 35 °C.
Matériel : Faire les 2 frottis, laissez sécher, fixer à la flamme à
l’intérieur de la hotte.
 Boites de Pétri de gélose au sang
frais ou de gélose au sang cuit ou Remarque :
TSAYe (Trypticase Soy Agar On peut utiliser différents milieux :
additionné d’extrait de levure)
sèche.  Gélose au sang cuit, gélose au sang frais.
(Voir annexe).
 Bocal contenant de l’eau de Javel.
 Milieu TSAYe parfois additionné de sérum.
 Pipettes pasteur.  Dans certains cas (sujets ayant reçus une
 Anse de platine. antibiothérapie préalable, micro-
 Bec Bunsen. organismes à croissance difficile) il sera
 Incinérateur d’anse. nécessaire de laisser les flacons incuber à
l’étuve pendant 8 semaines.
 Seringues.
 Alcool à 70°C.
Autres prélèvements :
 Lames.
 Jarres ou étuves à CO2. Manipulation sous hotte
Mode opératoire : Ganglions lymphatiques, moelle osseuse,

liquide de ponction articulaire, LCR, pus
Désinfecter la surface de la hotte.
de foyers suppurés. Lorsque ces
Mise en marche de la ventilation. prélèvements sont liquides, ils doivent être
traités comme le sang c'est-à-dire
Faire sécher les boites de Pétri de gélose au sang
ensemencés dans des flacons à double
frais et de gélose au sang cuit ou TSAYe.
milieu solide et liquide (CASTANEDA) ou
Préparer le bocal contenant de l’eau de Javel. à défaut Bouillon citraté.
Préparer les pipettes pasteur. Les prélèvements de tissus et notamment
Préparer l’anse de platine
de ganglions lymphatiques sont broyés
(Stomacher) et ensemencés directement
Allumer le bec Bunsen. sur milieu solide (TSAYe. GSF, GSC).
Allumer l’incinérateur de l’anse de platine.
En général les colonies de Brucella
Apres 72 H d’incubation (1) : les hémocultures d’un apparaissent à partir de ces prélèvements
sujet Brucellique sont examinés en réalisant un en 2 à 4 jours.
examen microscopique après coloration (Gram ou
Bleu de méthylène) et une subculture sur milieu
gélosé.
10
V.2.2-Prélèvements poly
microbiens :
Expectoration, sécrétion vaginales doivent
être traitées.
02 techniques sont pratiquées
Culture sur le milieu sélectif de FARELL

(préparation du milieu voir annexe).
Inoculation du prélèvement à 02 cobayes :

en injectant par voie sous cutanée, les
cobayes sont sacrifiés l’un à la 3éme
semaine et l’autre 6 à 8 semaines après
l’inoculation.
Le sang est recueilli pour servir à l’épreuve

de séroagglutination.
Les lésions macroscopiques sont notées,

on utilise la rate et d’autres tissus pour
faire des cultures.
11
V-3-Conduite à tenir devant V.3.1-Examen macroscopique des

une culture positive cultures (3.10.16)
(suspicion de Brucella) Sur gélose au sang cuit : les colonies
apparaissent très fines (0.5 mm de
(1.3.11.15.16).
diamètre après 48H-72H à 35°C sous
Hotte-lunette-Masques Obligatoires +++ CO2), elles sont grisâtres blanchâtres
légèrement bombées.
Sur gélose au sang frais de cheval :

elles présentent les mêmes
caractéristiques morphologiques que sur la
gélose au sang cuit et elles sont non
hémolytiques.
Sur TSAYe : parfois additionné de

sérum : les colonies atteignent 0.5 mm de
diamètre après 72 h d’incubation à 35°C
sous CO2, elles sont transparentes,
Observation des boites après 24 H
bleutées, légèrement bombées, elles ont
d’incubation : toute colonie apparaissant
parfois une couleur de Miel.
de manière distincte n’est pas une
Brucella. Sur Milieu de FARELL : les colonies
sont transparentes de 05 mm de diamètre,
La brucella apparait en un très léger tapis
celles-ci doivent être repiquées et
sur le 1er cadran de l’ensemencement après
ensemencées sur une boite de Pétri
24 H d’incubation. Elle donne de belles
contenant du TSAYe. (3.16).
colonies après 72 H d’incubation.
12
V.3.1.1-Examen de la culture à la  Les colonies jaune-beige sont de

loupe à Trans-Illumination- type rugueux (Rought).
Oblique :  Les colonies bleutées sont de type
(Technique acquise au laboratoire Brucella lisse. (Smooth).
INRA-Nouzilly)
Matériel : Technique utilisée pour les

géloses transparentes (TSAYe, FARELL) :
 Loupe
 Lampe à illumination oblique
 Culture
 Chambre noire.
Technique :
 Poser la boite sur le porte objet le

couvercle vers le haut.
 Faire la mise au point.
Interprétation :
13
V.3.1.2-Examen de la culture V.3.1.3-Test d’agglutination à

après coloration au Crystal l’Acriflavine :
Violet :
(Technique acquise au laboratoire Brucella INRA- Technique :
Nouzilly)
 C’est une agglutination sur lame.
 Pour cette technique porter des  Mettre une goutte d’Acriflavine
gants 1/1000 (voir annexe) en contact
 Préparer un bécher contenant u avec la culture (colonie).
antiseptique.
 Inonder la boite de TSAYe Interprétation :
ensemencée, avec du Crystal violet
(préparation voir Annexe) :  Les colonies sont rugueuses
 Laisser agir 20 secondes. (Rough) : agglutination positive.
 Aspirer le colorant à l’aide d’une  Les colonies sont lisses (Smooth) :
pipette montée d’une poire. agglutination négative.
Interprétation :
 Les colonies rugueuses (Rought)

sont colorées en rose –violet.
 Les colonies lisses (Smooth) seront
de couleur blanche.
Remarque :
Le colorant étant toxique pour la culture, il

faut repiquer les colonies lisses (Smooth)
en les aspirant à l’aide d’un tube de
Guillemot, en les mettant en suspension
dans 0.4 ml d’eau physiologique afin
d’ensemencer les boites.
14
V.3.2-Identification du
genre :
1-Critères morphologiques
après coloration de Gram :
Très fins coccobacilles à gram négatif.
2-Uréase :
Elle est recherchée sur milieu gélosé de 3-Recherche de l’oxydase :
Kristensen ou sur milieu de Ferguson
(attention à ne pas faire tomber le tube). Se fait sur papier Whatman imbibé du
(3.16) réactif N-N-dimethylparaphenylene
diamine, ou utilisation des disques
Technique : commercialisés. (3.16)
Prendre une boite de Kristensen ou tube Technique :

de Kristensen.
Préparer la solution de N-N-
Prélever à l’aide de l’anse de platine la dimethylparaphenylene diamine.
culture bactérienne.
Imbiber le papier Whatman de ce réactif.
Ensemencer richement en pastille dans un
cadran ou en strie le long de la pente. Prélever la culture à l’aide d’anse de
platine.
Lecture : Déposer la culture sur le papier.
Hydrolyse de l’urée (apparition d’un halot
rose autour de la culture).
Lecture (+) : coloration rose violette.
Mentionner le temps d’hydrolyse de l’urée.
Remarque :
Pour le milieu de Ferguson, ensemencer

richement le milieu à l’aide de la culture,
incuber.
Interprétation :
Toute coloration ros e= Uréase Positive
Oxydase (+) : B.melitensis, B abortus,
Toute coloration orange = Uréase B.canis, B suis.
Négative.
Oxydase (-) :B.neotamae, B ovis.
Interprétation :
NB : B.abortus est oxydase (+) sauf B abortus biovar
3 isolé au Sénégal et en Guinée Bissau.(1)
 Uréase (+) :B.melitensis. B .suis,
B.neotomae, B.canis.
 Uréase (-) : B.ovis.
15
 Apres avoir lu la catalase, remettre

le couvercle de la boite de Pétri.
Oxydase Uréase Besoins
 Scotcher cette dernière avant de
en
sérum l’incinérer.
B.melitensis + + -
6-Autres réactions :
B.abortus + + -*
B suis + + -  Citrate de Simmons négatif.
B neotamae - + -  RM négatif, VP négatif.
B ovis - - +  Indole Négatif.
 Aucune acidification des glucides
B canis + + -
par les techniques courantes.
*Brucella abortus 2 nécessite du sérum

lors de la culture.
Les autres caractères bactériologiques

sont :
4-Réduction des nitrates en

nitrites :
Technique :
Ensemencer richement un bouillon Nitrate
(attention à ne pas casser le tube en verre),
incuber sous CO2.
Lecture.
 Rajouter les réactifs NR1 et NR2
dans le tube.
 Apparition de coloration rouge
dans le tube
5-Catalase
Technique :
 Prendre une boite de Pétri vide
avec son couvercle.
 Mettre une goutte d’eau oxygénée
dans la boite.
 Déposer une colonie dans la goutte.
Lecture :
Présence de bulles d’air : catalase (+).
Remarque :
16
V.3.3-Identification 1-Technique :
d’espèce :
1er jour :
Se fait par Lysotypie
Le milieu
V.3.3.1-Lysotypie : Milieu BAB2 (Blood Agar Base N°2)
(Technique acquise au laboratoire Brucella INRA-
Nouzilly)
+ 5 % de Sérum de cheval.
Couler la gélose dans des boites de Pétri

Détermination de la DCE pour le
rondes, incuber une nuit à 37°C.
bactériophage Tb
Les souches
Les souches à étudier ainsi que les souches

de référence sont ensemencées sur TSAYe
en pente.
 Souche 544 : B.abortus biovar 1 :

ATCC 23488.
 Souche 16M : B.melitensis biovar
1 : ATCC 23456
 Souche 1330 : B.suis biovar 1 :
ATCC 23444.
Phages :
On utilise la DCE (dilution courante

d’épreuve) pour les phages suivants :
Lysotypie avec le bactériophage Tb
 Tbilissi (Tb)
 Izatnagar (Iz).
 Weybridge (Wb).
 Et R/C.
La DCE : c’est la dilution la plus élevée

pour laquelle il ya lyse totale de la bactérie.
17
2ème jour
Abréviations :
Milieu :
 PL : Pseudo Lyse Tb : Tbilissi Iz : Izatnagar
On utilise une boite de BAB2 + Sérum par Wb : Weybridge
phage.  Les phages Tb, Iz, Wb lysent les souches
lisses.(Smooth).
Souches :  Le phage R/C lyse les souches rugueuses
(Rough)
Préparer la suspension bactérienne :
Mettre 0.4 ml d’eau physiologique dans

des tubes de Kahn.
Préparer la culture à l’aide d’anses de

platine.
Homogénéiser la culture dans l’eau

physiologique (en réalisant des rotations
très lentes à l’aide de l’anse de platine sur
la paroi du tube).
Vortexer.
Prendre un écouvillon jetable : imbiber ce

dernier de la suspension bactérienne.
Ensemencer les boites en stries.
Phages :
A l’aide d’une pipette pasteur effilée,

prélever la dilution de phages.
Déposer une goutte de cette dilution par

stries.
Laisser sécher sur la paillasse.
Incuber sous CO2 (pour les souches

exigeantes).
Lecture après 24-48 H.
2-Interprétation :
Tb Iz Wb R/C
B.melitensis - + - -
B.abortus + + (PL)
+ +
B.suis - + + -
B.neotamae +(PL) + + -
B.ovis - - - +
B.canis - - - +
18
V.3.4-Détermination des Les tubes sont incubés selon l’exigence ou

non de la souche vis à vi du CO2.
Biovars (3)
4 tests permettent l’identification des Lecture et interprétation :
Biovars et confirment l’identification
 Si l’extrémité inferieure du papier
d’espèce :
est noire (au moins 1 cm de
1. Exigence en CO2. hauteur) : réaction positive.
2. Production d’H2S.  Si l’extrémité inferieure du papier
3. Test aux colorants (Thionine- est blanche : réaction négative.
Fuschine-Safranine).
4. Agglutination à l’aide de sérums
Interprétation :
polyclonaux A et M.
Réaction (+) :
1-Exigence en CO2 :  B.abortus (1.2.3.4.9)
 B.suis(1).
Lorsqu’une souche est en cours
 B.neotamae
d’identification, il faut systématiquement
ensemencer 2 boites de TSAY.L’une est Réaction (-) :
incubée en atmosphère normale et l’autre
sous CO2.  B.melitensis
 B.canis.
Lecture :  B.ovis
 Les autres Biovars de B.abortus
Exigence en CO2 (+) : B abortus Biovar  Les autres Biovars de B.suis.
1.2.3.4.9 et B.ovis.
2-Production d’H2S :
Matériel :
 Gélose inclinée de BAB2.
 Anse de platine
 Bandelettes imprégnées d’acétate
de plomb.
Technique :
Ensemencer la pente d’une gélose inclinée
de BAB2 à l’aide d’une anse de platine
chargée de culture (ensemencer en stries
serrées du bas vers le haut).
Faire pénétrer dans le tube de BAB2

ensemencé une bandelette imprégnée
d’acétate de Plomb sans toucher à la
gélose.
Refermer le tube après avoir plié

légèrement le papier.
19
3-Agglutination à l’aide de Lecture :

sérums polyclonaux A et M :
 Agglutination (+) : Présence
d’agglutinats.
Principe :
Chaque Brucelle présente 2 types  Agglutination (-) : Suspension
d’antigènes A et M opalescente : absence d’agglutinats.
Selon l’espèce et le biovar il ya Interprétation :

prédominance de l’un par rapport à l’autre.
 A+M- :B.abortus (1.2.3.6) et
Les anticorps anti A et anti M sont B.melitensis (2),B suis(1.2.3),
obtenus en immunisant des lapins grâce à B.neotomae.
des souches de B.abortus et B.melitensis.
 A-M+ :B.melitensis(1), B.abortus
Matériel : (4.5.9), B.suis(5).
 Lames  A+M+ :B.melitensis(3), B.suis(4).

 Anse de platine
 Boites de Pétri Cette technique permet de séparer les
 Sérums Biovars de B.melitensis.
 Pipette effilée.
Technique :
Diluer les sérums purs au 1/15 dans de
l’eau physiologique phénolée.
Prendre une lame, déposer à l’aide d’une

pipette effilée une goutte de sérum A.
Prélever la culture à l’aide d’une anse de

platine et la déposer à coté du sérum.
Mélanger la culture dans le sérum.
Mettre la lame dans une boite de pétri

lentement afin d’éviter toute projection.
Agir en faisant des mouvements de

rotation.
Faire de même avec le sérum M.
20
4-Test aux colorants Couler la gélose en boite, pré incuber une

nuit à 37°C.
(Thionine, Fuschine,
Safranine) : Souches bactériennes
Principe : Ensemencer les souches de référence

(1330,16M, 544) et les souches à tester sur
Test de sensibilité ou de résistance des des géloses de TSAYe inclinées.
souches de Brucella vis-à-vis des
2ème jour :
différentes concentrations de colorants
Préparer les suspensions bactériennes
Technique : dans de l’eau physiologique.
1er jour : Ensemencer les boites de colorants en
Milieu : stries à l’aide d’écouvillons imbibés dans la
suspension bactérienne.(comme pour la
6 flacons de BAB2 (=95 ml) + 5 ml de Lysotypie).
sérum de cheval.
Ensemencer les boites dans l’ordre allant
Sortir les solutions de fuschine, thionine, du moins au plus concentré.
safranine du réfrigérateur afin qu’elles
atteignent la température ambiante. Remarque :le test des colorants est
généralement fait en même temps que la
3 flacons de gélose pour la thionine : lysotypie.
1er flacon : ôter 1 ml de gélose fondue et le Interprétation :

remplacer par 1 ml de Thionine : 10 T.
B.melitensis : les 3 Biovars sont résistants
2ème flacon : ôter 2 ml de gélose fondue et à la Thionine et à la Fuschine.
le remplacer par 2 ml de Thionine : 20 T.
B.abortus : variable selon les biovars,
2ème flacon : ôter 4 ml de gélose fondue et resistant à la Thionine (3.5.6.9) résistant
le remplacer par 4 ml de Thionine : 20 T. pour la fuschine (tous sauf le biovar 2).
2 flacons de gélose pour la Pour la Safranine à la concentration 100
Fuschine : g/ml, la majorité des B.suis sont inhibées
or les B.melitensis et B.abortus ne sont pas
1er flacon : ôter 1 ml de gélose fondue et le
inhibées.
remplacer par 1 ml de Fuschine : 10 F.
2ème flacon : ôter 2 ml de gélose fondue et

le remplacer par 2 ml de Fuschine : 20 F.
1 flacon de gélose pour la Safranine :
1er flacon : ôter 1 ml de gélose fondue et le

remplacer par 1 ml de Safranine : 10 S.
Agitez les flacons afin de bien

homogénéiser le mélange.
21
Exemple: Aspects de culture de B. abortus, biovars 1, 2, 3, 4

et 9 en présence de 20 µg/ml de F (à gauche) et T (à droite)
IV-Test de sensibilité aux

antibiotiques :
CMI : les E tests sont conseillés pour
tester :
 La Tétracycline ou Doxycycline
 Rifampicine
 Gentamycine
 Streptomycine
 L’association Triméthoprim-
Sulfamethoxazol.(3.17).
22
VII-Diagnostic
sérologique de la
Brucellose humaine
Le diagnostic de la brucellose humaine est
essentiellement basé sur des techniques de
sérologie.
VII.1-Prélèvements
(3.4) :
Il est impératif et obligatoire de se munir
d’une paire de gants pour toute
manipulation de produits biologiques.
La recherche des anticorps anti-Brucella se

fait sur des prélèvements de sérum et
éventuellement sur du LCR dans les
formes localisées des atteintes
neurologiques : le sang est centrifugé
pendant 10 minutes à 5000 tr/mn et le
sérum est recueillis sous hotte puis
décomplémenté 30 mn à 56 °C dans un
bain marie, par contre le LCR ne subit
aucun traitement préalable.
La recherche des anticorps anti-Brucella se

fait également dans le LCR.
Cette opération « hotte et

décomplementation » est facultative, mais
recommandée pour éviter toute
contamination.
Recommandations du laboratoire du Pr
BRUN (Arnaud Villeneuve-Montpellier).
23
VII.2-Epreuve à
l’antigène tamponné
(Rose Bengale) : Card
Test (EAT) :
Principe (3.4.10.18) :
C’est une réaction simple et spécifique
d’agglutination rapide sur lame en milieu
acide utilisant une suspension de Brucella
inactivée colorée par le rose Bengale.
Elle met en évidence les IgG et se positive

plus tardivement, elle est toute fois plus
sensible et reste plus longtemps positive
que l’agglutination de Wright.
Mode opératoire :
Sur un support pour agglutination (lames
de verre, microplaque, carton de Bristol)
déposer cote à cote 2 gouttes d’un volume
égal : 30 ul de sérum à étudier ou 60 ul de
LCR + 30 ul de l’antigène tamponné.
Mélanger avec un bâtonnet, en utilisant un

pour chaque sérum.
La lecture est faite au bout de 4 minutes

après agitation.
Résultat et interprétation :
Un sérum négatif se traduit par l’absence
d’agglutination et un sérum positif se
traduit par la présence d’agglutination
même minime.
Ce test est utilisé pour le dépistage. Il

convient donc de tester les sérums positifs
par des réactions quantitatives.
Le test EAT se positive 7 à 10 jours après le

test du SAW.
24
VII.3-Séroagglutination Apres une nuit ou 24 H sortir la

microplaque de l’étuve et procéder à la
de Wright (SAW) (3.4.10.18) lecture.
Principe Lecture et interprétation :

Le sérodiagnostic de Wright utilise une Une réaction positive se traduit par une
méthode d’agglutination avec comme agglutination en voile à la surface de la
antigène une suspension de Brucella tuée cupule.
par le formol et la chaleur.
Une réaction négative se traduit par un
Le sérum de patient contenant des point au fond de la cupule : dépôt de
anticorps anti brucella provoque une l’antigène Brucella..
agglutination qui se traduit par un voile à
la surface de la cupule, tandis que le sérum Pour une dilution 1/80ème , cela
ne contenant pas d’anticorps se traduit par correspond à un titre de 120 UI/ml selon
une sédimentation au fond de la cupule. le tableau de correspondance. Un titre >
ou = à 120 UI/ml dilution 1/80ème indique
C’est une réaction d’agglutination qui se une brucellose aigue ou active. ce taux est
fait en microplaque et qui met en évidence généralement dépassé lors des brucelloses
des immunoglobulines de type IgM. aigues.
Mode opératoire : Un titre < 120 UI/ml doit éveiller la

suspicion et justifier un sérodiagnostic
C’est une micro méthode qui utilise quelques jours plus tard.
comme antigène, un antigène prêt à
l’emploi commercialisé par BIORAD
(réactif utilisé au laboratoire de l’IPA).
Prendre une microplaque dans le sens de

la largeur et distribuer dans la cupule A1
190 ul d’antigène brucellique et de la
cupule B1 à H1 100 ul d’antigène Brucella.
Ajouter dans la cupule A1 10 ul de sérum

(dilution 1/20).
Transférer 100 ul de la cupule A1 dans la

cupule B1, mélanger soigneusement et
prélever 100 ul de la B1 et la transférer
dans la cupule C1 et ainsi de suite jusqu’à
la cupule H1.les derniers 100 ul sont jetés.
Agiter énergiquement la microplaque et

l’incuber à 37°C pendant une nuit.
Apres une nuit ou 24 H sortir la

microplaque et l’incuber à 37 °C pendant
une nuit.
25
Lecture d’une
séroagglutination de Wright
en microplaque : 1/20 1/20 1/20
 Une microplaque permet de tester

11 sérums de patients plus un 1/40 1/40 1/40
sérum témoin positif. Cette
méthode en tubes utilise très peu
d’antigènes brucelliques 1/80 1/80 1/80
contrairement à la méthode en
tubes.
 Exemple pour un sérum testé en 1/160 1/160
tube on utilise 2.5 ml d’antigènes
de brucella, alors que dans la
méthode en microplaque on utilise 1/320
800 ul d’antigènes.
 Elle est plus économique et facile à 1/640

lire.
1/1280
 Tableau de correspondance des
dilutions aux valeurs des unités
internationales 1/2560
dilution
Titre en
1/20
1/40
1/80
1/160
1/320
1/640
1/1280
1/2560
UI
Titre en
30
60
120
240
480
960
1920
3840
Avantages et inconvénients :
C’est une réaction qui se positive assez tôt
durant la maladie (10-15 jours : c’est la
plus précoce) mais se négative vite.
Elle est positive surtout en phase aigue et

subaigüe d’où son intérêt.
L’inconvénient du test est sa non

spécificité (réactions croisée avec Yersinia
enterocolitica, Vibrio cholerae et
Francisella tularensis).
26
Placer ensuite les lames dans une chambre humide

VII.4- et à l’abri de la lumière 30 mn à température
Immunofluorescence normale.
indirect (I.F.I) : Apres ce laps de temps, procéder au premier lavage

en mettant les lames à laver dans un bec rempli au
¾ de tampon PBS et en les plaçant verticalement
Technique non standardisée (Laboratoire
dans un support pour lames pendant 10 mn.
de Mr Braun Montpellier) :
Renouveler le lavage une seconde fois, rincer avec
L’I.F.I est réalisée après avoir préparé de de l’eau distillée quelques secondes puis sécher les
manière artisanale des lames au lames.
laboratoire. Préparer pendant le deuxième lavage les dilutions
au 1/100 des immunoglobulines
Une dilution d’antigène de brucella (voir
annexe) au 1/200 est effectuée dans de 900 ul de tampon PBS (voir annexe)
l’eau physiologique phénolée à 0.5 % puis
100 ul de bleu d’Evans (voir annexe)
distribuée à raison de 30 ul sur chaque
cercle de la lame d’IFI. 10 ul d’Immunoglobulines marquées à la
fluorescéine IgM, IgA et IgG (voir annexe).
Principe :
Lorsque les lames sont bien sèches déposer 30 ul de
chaque immunoglobuline marquée à la fluorescéine
L’IFI est une réaction de sensibilité et de dans les cupules correspondantes à cet effet et
spécificité de qualité très appréciable incuber les lames dans une chambre humide à l’abri
de la lumière pendant 30 mn.
E test est en outre recommandé dans les
formes tardives et chroniques de la Apres incubation procéder aux deux lavages comme
cité précédemment.
maladie car il met en évidence 3 classes
d’immunoglobulines : IgM, IgA et IgG. Rincer avec de l’eau distillée pendant une minute.
Mode opératoire Sécher les lames et procéder au montage de la lame

avec une solution de tampon + glycérine (voir
La technique est réalisée en utilisant 3 dilutions : annexe) et recouvrir d’une lamelle..
1/10,1/20 et 1/40.
Lecture :
Si le sérum du patient se positive au 1/40 il faudra
pousser les dilutions de ½ en ½ et ce jusqu’à Lire les lames à l’aide d’un microscope à
l’extinction de la fluorescence.
fluorescence avec un objectif X 50 ou avec
Prendre une microplaque et faire les dilutions un objectif X40.
suivantes :
Un sérum positif se traduit en observant
 1/10 : 180 ul de tampon PBS + 20 ul de une fluorescence verdâtre des bacilles de
sérum pur du malade.
Brucella en forme de ballons de rugby.
 1/20 : 100 ul de tampon PBS + 100 ul de
sérum du 1/10
 1/40 : 100 ul de tampon PBS + 100 ul de
Un sérum négatif se traduit par une
sérum du 1/20. extinction complète de la fluorescence avec
un fond rouge.
Déposer 30 ul de chaque dilution de sérum dans les
cupules correspondantes (voir figure N°1). Si le sérum du malade est positif au 1/40 il
Dans un premier temps faire 3 dilutions du sérum : faut pousser les dilutions de ½ au ½
1/10,1/20,1/40 et distribuer selon la figure N°1 les jusqu’à extinction complète de la
dilutions de sérums à raison de 30 ul dans chaque fluorescence.
cupule.
27
Interprétation des résultats :
Brucellose IgM > IgA IgG > ou =

Aigue 1/10 négatif 1/40
Brucellose IgM IgA IgG > ou =
Subaigüe 1/10 négatif 1/40
Brucellose IgM IgA IgG
Chronique Négatif négatif 1/40
Avantage et inconvénients :
Ce test se positive plus tardivement que
l’agglutination de Wright.
Elle est très utile en cas de brucellose

chronique car elle décèle encore des
anticorps spécifiques alors que les autres
réactions sérologiques se sont négativées.
Les anticorps persistent à un taux élevé

pendant 4 mois et déclinent pour
disparaitre en 18 mois.
L’IFI est souvent le seul test positif dans la

brucellose subaigüe ou chronique.
28
avec du papier buvard en veillant bien à ne pas

VII.5-Détermination des laisser aucune goutte à l’intérieur des cupules.
IgG, IgA, IgM par ELISA Les microplaques sont ensuite envelopées dans du
papier aluminium en prenant soin d’inscrire la date
(Technique non standardisée du laboratoire du Pr M
de préparation et la nature de l’antigène.
Braun, Laboratoire Arnaud de Villeneuve de
Montpellier). Conserver à – 80°C.
Principe : Mode opératoire :

La technique ELISA repose sur une Les sérums de patients doivent etre dilués au 1/101
méthode immuno-enzymatique de dans du tampon lait (voir annexe) :
détection qui permet de visualiser une
10 ul de sérum+1000 ul de tampon lait. Bien
réaction antigène anticorps grâce à une homogénéiser au vortex.
réaction colorée produite par l’action sur
un substrat, d’une enzyme préalablement Repartir dans la microplaque 200 ul de sérum dilué
dans 4 cupules réservées pour chaque sérum :IgT,
fixée à l’anticorps.
IgG, IgA, IgM.
Les puits de la microplaque sont Mettre le témoin sérum dans les premières cupules.
recouverts d’antigènes de Brucella (A.B.C.D).
(Brucella abortus) commercialisé par
Incuber les microplaques 1 heure à 37°C.
différents laboratoires.
Rincer après incubation les microplaques avec la
solution de lavage à raison de 4 cycles, puis les
sécher en tapotant sur du papier buvard ou par
Les sérums de patients et ceux des témoins centrifugation.
positifs sont incubés à 37°C.
Préparer les dilutions des immunoglobulines
Les anticorps spécifiques aux antigènes de marquées à la phosphatase alcaline.
la bactérie les reconnaissent et forment le Dilution des Immunoglobulines :
couple antigène-anticorps.
Ig Totales au 1/4000 5 ul d’IgT + 20 ml de tampon.
Matériel et réactifs (voir IgA au 1/3000 5 ul d’IgA + 15 ml de tampon.
annexe) : IgG au 1/6000 5 ul d’IgG + 30 ml de tampon.
IgM au 1/6000 5 ul d’IgM + 30 ml de tampon.
Antigénation ou coating des
Distribuer 200 ul d chaque conjugué à l’aide d’une
microplaques :
pipette multicanaux dans les cupules
L’antigène utilisé pour le coating de la microplaque correspondantes.
(adsorption de l’antigène aux parois de la cupule de
Incuber 1 h à l’étuve.
la microplaque) est dilué au 1/7 dans du tampon
antigène (voir annexe). Procéder de nouveau aux lavages à raison de 4
cycles.
Cette opération consiste à déposer dans toutes les
cupules de la microplaque un volume bien précis de Sécher les microplaques comme dans la 1ère étape.
la dilution de l’antigène brucellique (voir annexe).
Préparer la dilution du substrat (4
Distribuer à l’aide d’une micropipette multicanaux nitrophénylphosphate) et mettre dans toutes les
200 ul de cette dilution dans toutes les cupules de la cupules 200 ul de cette dilution (voir annexe).
microplaque. Elles sont ensuite recouvertes et
placées à +4°C pendant une nuit. Couvrir la microplaque avec du papier buvard et
l’incuber 30 mn à 37°C.
Le lendemain les microplaques sont lavées 4 à 5 fois
avec la solution de lavage (voir annexe) puis séchées
29
Faire la lecture à 490 nm de longueur d’onde, filtre Elle est recommandée pour des recherches
800. épidémiologiques ou épizootiques.
Interprétation des résultats : On observe des réactions croisées avec les
antigènes de Francisella tularensis, de
La dégradation du substrat par l’enzyme
Yersinia enterocolitica O9, de Vibrio
donne une coloration jaune qui est
cholerae, de Campylobacter jejuni.
proportionnelle à la quantité d’anticorps
contenus dans le sérum du patient.
Formule de calcul pour

l’interprétation des résultats :
0.400 :DO témoin en IgG total x DO Ig

Total du sérum (S1.S2.S3 etc.…)
Calcul du coefficient multi calibreur
0.400 : DO des immunoglobulines totales

du témoin = coefficient multi calibreur.
Ce coefficient multi calibreur sera

multiplié avec tous les DO des sérums
obtenus.
La densité optique de 0.400 a été obtenue

à partir d’un panel de sérums humains.
Cette technique n’est pas standardisé .c’est

pourquoi certains paramètres de la
formule de calcul peuvent être modifiés
(technique mise au point par le laboratoire
de l’hôpital Arnaud de Villeneuve de
Montpellier).
Normes :
Une DO < à 0.150 ….Négatif
Une DO > à 0.250….Positif.
Une DO > 0.150 et < 0.250 ….douteux
Remarque :
Il existe actuellement sur le marché des

Kits ELISA qui sont commercialisés par
différents laboratoires allemands et
américains.
Avantages et inconvénients :
30
VII.6-Réaction de fixation du
complément (RFC) :
C’est une réaction qui n’est plus utilisée
pour le diagnostic sérologique de la
brucellose humaine pour son manque de
sensibilité.
Utilité des méthodes diagnostiques en

fonction du stade de la maladie (2004) :
Hémoculture
Wright
Rose Bengale
IFI et ELISA
RFC
Stade de la IDR*
maladie
Aigue 3+ + +/- +/- +/- -

Subaigüe + 3+ 3+ 3+ 3+ +
Chronique - +/ +/- + +/- 3+
-
*IDR : Intra Dermo Réaction
Cinétique d'évolution des anticorps
31
L’addition d’un réactif de détection va

VIII-Nouvelles techniques permettre la visualisation du complexe
de diagnostic : antigène-anticorps.
Remarque : il existe des bandelettes pour

VIII.1-Sérodiagnostic rapide la détection des IgM et d’autres la
de Brucellose humaine : détection des IgG.
Principe (19. 20. 21) : Technique :
C’est un test permettant la mise en  Mettre une goutte du sérum du

évidence d’IgM et d’IgG spécifiques de malade à analyser dans la fenêtre
Brucella par une immunochromatographie de la bandelette.
latérale.  Ajouter un réactif de détection.
 Attendre 10-15 mn.
Sur une bandelette poreuse, l’antigène
Brucella est déposé en une ligne selon le (Voir Annexe en Anglais)
principe d’immunochromatographie
latérale.
Lors de l’analyse, les anticorps spécifiques

anti brucella (IgM et IgG) présents dans le
sérum du malade migrent le long de la
bande et se lient à l’antigène de brucella
(fraction liposaccharidique préparée à
partir de Brucella abortus) fixée sur une
membrane poreuse (Stick) en une ligne
permettant la mise en évidence d’une
bande.
The Royal Tropical Institute (KIT) in Amsterdam has developed the Brucella IgM and IgG Flow assays for the rapid serodiagnosis of brucellosis in human.
The Brucella IgM Flow assay is designed for the detection of Brucella-specific immunoglobulin M (IgM) antibodies, and the Brucella IgG Flow assay is
designed for the detection of Brucella-specific IgG antibodies.
+4 +3 +2 +1 Négative Négative
32
VII.2-Polymérase Chain
Réaction (PCR) (23.24.25) Identification moléculaire de B. abortus (A) après PCR
du gène omp31
M, B. melitensis; S, B. suis
Le test de PCR est considérée plus sensible
que les ancienne s techniques de
diagnostic, cependant la sensibilité et la
spécificité de la PCR varient entre les
laboratoires et aucune standardisation de
la technique n’existe actuellement (E.
Navarro et coll 2004)(21)
L’intérêt : rapidité du diagnostic (quelques

heures) et elle est plus sensible que les
méthodes de diagnostic traditionnelles.
Inconvénient :
Cliché INRA-Nouzilly
Aucune standardisation de la technique, la
PCR varie en fonction des laboratoires
(préparation du prélèvements différents,
type de gène et méthodes de détection
différentes) (E. Navarro et coll 2004)(21) Identification moléculaire de Brucella après PCR du gène
omp25 et restriction (B)(EcoRV) ou non (A)
A, B. abortus; M, B. melitensis; O, B. ovis
Exemples :
Les chercheurs Zerva et coll 2001 (22) :

préconisent un test de PCR qui amplifie
une séquence de gènes protéiques de 31
KD de Brucella abortus a partir de sérum
de malade ou du sang total.
Les résultats de l’étude révèlent un

meilleur taux de positivité dans le sérum
par rapport au sang total.
Les chercheurs Morata et coll 2003 (23) :

utilisent une PCR qui amplifie une
séquence de 223 bp, puis réalisent un test Cliché INRA-Nouzilly
ELISA au lieu d’une migration sur gel avec
Bromure d’éthidium.
Remarque :
IDR à la melitine : est intéressante pour le

diagnostic de brucellose chronique
cependant l’allergène n’est plus
commercialisé.
Le vaccin anti brucellique à usage

humain n’est plus fabriqué depuis
fin 1992.
33
ANNEXE 1  Apres dissolution, porter à

ébullition.
BACTERIOLOGIE  Autoclaver à 121° C pendant 30
mn.
I-composition des
4-Milieu sélectif : Milieu de
milieux
Farrell modifié (INRA Nouzilly)
1-Gélose au sang cuit :
 Protéase peptone 15 g
 Peptone 10g  Extrait de foie digéré 2.5 g
 Chlorure de sodium 5 g  Extrait de levure 5g
 Extrait de viande 5g  Chlorure de sodium 5g
 Agar 20 g  Agar 12 g
 Eau distillée QSP 1000 ml  Eau distillée 1000 ml.
Apres dissolution, ajuster le pH=7.8 Préparation :
Autoclaver 126 °C. Pendant 30 mn Cette gélose est préparée puis autoclavée à
121 °C.
Ajouter 5 % de sang de cheval ou de
mouton après avoir fait fondre le milieu. Laisser refroidir jusqu'à 56°C.
La gélose de base ainsi que le sang sont Ajouter 5 ml de solution filtrée de sérum
commercialisés par l’IPA. contenant 20 % de dextrose dans 95 ml de
milieu.
2-Gélose au sang frais :
Ajouter les antibiotiques suivants :
 Même formule que la gélose au
 Cycloheximide 100 mg/l
sang cuit
 Polymyxine B sulfate 25000 U.
 Additionner de 5 % de sang de
 Vancomycine 20 mg
cheval ou de mouton quant la
 Acide nalidixique 5 mg
gélose atteint 50°C.
 Nystatine 100 000 U
3-TSAYe (commercialisé par 5-Préparation du milieu de
l’IPA) : Kristensen
 Biotrypticase 17 g
Pour 1 litre d’eau distillée :
 Chlorure de sodium 5g
 Biosayase 3 g  Bacto-peptone 1 g
 Dipotassium Hydrogénophosphate  NaCl 5g
2.5 g  KH2PO4 2g
 Glucose 2.5 g  Rouge de phénol 0.012 g
 Agar 15 g  Glucose ou Dextrose 1g
 Extrait de levure (Gibco) 1 g  Bacto-Agar 20 g.
 Eau distillée QSP 1000 ml
Préparation :
Préparation :
 Dissoudre à froid les produits
 PH = 6.9 à 7.1 chimiques dans un peu d’eau
distillée.
34
 pH à 6.8  Regrouper les 2 solutions (au total

 Repartir en flacon de 50 ml. 100 ml).
 Stériliser 20 mn à 120°C.  Diluer au 1/40 juste avant l’emploi.
 Rajouter 5 ml d’urée à 20 % (20 g
pour 100 ml d’eau distillée) filtrer 2-Préparation de l’Acriflavine
à 0.45 U. 1/1000 :
6-Milieu BAB2  0.1 g d’Acriflavine + 100 ml d’eau
distillée.
 Protéase peptone 15 g  La solution est conservée à +4°C
 Liver digest ou viande foie digest pendant des années.
2.5 g
 Extrait de levure 5 g 3-Préparation du réactif
 Chlorure de sodium 5 g
d’oxydase :
 Agar 12g
 Prendre une pincée du réactif NN-
pH = 7.4
dimethyl para Phénylène diamine
Autoclaver à 121°C pendant 20 mn. et VP-hemioxalate salt l’introduire
dans un tube à vis (12-18 ml) + 4-5
7-Milieu TSB : Bouillon ml d’eau distillée.
Trypticase Soja  Agiter au vortex.
 Imbiber un morceau de papier
 Bio trypticase 17 g Whatman à l’aide de cette solution.
 Bio soyase 3g
Remarque : la poudre doit être conservée à
 Chlorure de sodium 5 g
+4°C et manipulée sous hotte avec des
 Dipotassium hydrogenophosphate
gants.
2.5 g
 Glucose 2.5 g
4-Préparation de bandelettes
 Eau distillée QSP 1000 ml.
d’Acétate de plomb : recherche
Préparation : d’H2S (identification du biovar) :
 PH : 6.9-7.1
 Préparer de la solution à 10 %
 Repartir le milieu dans des flacons
d’acétate de plomb :
de 100 ml.
 Peser 10 g de poudre d’acétate de
 Autoclaver à 121°C pendant 30 mn.
plomb, ajouter 100 ml d’eau
 Ajouter 15 % de Glycérol dans 100
distillée.
ml de TSB.
 Laisser sécher à l’air.(T° du
laboratoire)
II+Réactifs et colorants :  Découper des bandelettes de 12 cm
de long et de 1 cm de large.
1-Préparation du Crystal violet :
5-Préparation des solutions des
 Dans un bol avec broyeur (Pilon) :
dissoudre 2 g de Crystal violet dans colorants (tests aux colorants) :
20 ml d’éthanol absolu.
 Thionine 0.1 % : Prendre 0.1 g de
 Dissoudre 0.8 g d’oxalate
Thionine pour 100 ml d’eau
d’ammonium dans 80 ml d’eau
distillée. Ou 0.05 g de Thionine
distillée.
pour 50 ml d’eau distillée.
35
 Fuschine 0.1 % : Prendre 0.1 g de

Fuschine pour 100 ml d’eau
distillée. Ou 0.05 g de Fuschine
 Safranine 0.1 % : Prendre 0.1 g de

Safranine pour 100 ml d’eau
distillée. Ou 0.05 g de Safranine
36
éviter de les congeler et de les

Conservation des souches décongeler trop souvent.
de Brucelles :  Veillez faire pour chaque souche
plusieurs exemplaires et plus
Conservation de courte particulièrement pour les souches
de référence appelées à être
durée : 2 mois environ utilisées fréquemment.
(technique INRA Nouzilly Tours) :
 Incuber 24 h à l’étuve à 35°C, des

géloses en pente inclinée de TSAYe
afin de contrôler la stérilité.
 Ensemencer la souche de brucella
par stries serrées tout au long de la
pente d’une gélose inclinée de
TSAYe à l’aide d’une anse de
platine.
 Stériliser l’anse de platine dans
l’incinérateur, puis dans la flamme
du bec bunsen.
 Incuber une nuit la gélose inclinée
de TSAYe à l’étuve à 35°C.
 Apres une nuit d’incubation,
déposer les tubes bien refermés
dans le réfrigérateur à +4°C.
Conservation de longue
durée : (technique Maison Alfort).
 Préparer 100 ml de bouillon
Trypticase Soja (TSB) additionné
de 15 % de Glycérol (voir annexe 7).
 Bien mélanger avec la pipette,
prélever 2 ml de cette solution dans
un tube à hémolyse.
 Prélever à l’aide d’une pipette
pasteur le maximum de colonies à
partir d’une culture pure de
brucella et ensemencer un tube à
hémolyse contenant du TSB + 15 %
de glycérol.
 Repartir les 2 ml de la suspension
bactérienne dans 2 cryotubes à vis
extérieure.
 Congeler à -20°C.
 Les souches peuvent être
conservées au moins 05 ans, il faut
37
contenu du (des) récipient(s) de sorte que

Transport des toute fuite de substance liquide ne portera
prélèvements de pas atteinte à l’intégrité des matières de
rembourrage ou de l’emballage extérieur.
Brucella :
L’utilisation du triple emballage permet
Selon OMS 09-2004-Département d’assurer efficacement depuis des années
Maladies transmissibles surveillance le confinement des substances
et action (5) infectieuses.
Selon l’OMS-Sécurité sanitaire mondiale- Exemples de matières infectieuses

Transport des substances infectieuses. classées dans la catégorie A
Considérations générales relatives aux Micro-organisme

amendements adoptés dans la 13ème
révision du règlement type des Nations Brucella abortus (cultures seulement)
Unies pour le transport des substances
Brucella melitensis (cultures seulement)
infectieuses.
Brucella suis (cultures seulement).
Réduction des risques :
Exemples de matières infectieuses
Les risques encourus par ceux qui
classées dans la catégorie B.
s’occupent du transport des substances
infectieuses peuvent être réduits en Matière infectieuse qui ne répond pas aux
différents points de la chaine d’infection critères de la classification dans la
par emballages appropriés. catégorie A.
La clé de la maitrise efficace du risque et Les matières infectieuses de la catégorie B
de sa réduction au minimum se trouve doivent être affectées au N° ONU 3373.
dans le choix de l’emballage le plus
approprié. Nota : la désignation officielle de transport
pour le N° ONU 3373 est « échantillons de
Un emballage approprié offre les barrières diagnostic » ou « échantillons cliniques ».
physiques nécessaires et suffisantes pour
éviter une fuite du produit vers l’extérieur.
Le triple emballage comprend :
Un ou plusieurs récipients primaires

étanches emballés dans un emballage
secondaire, de façon à ne pouvoir être
brisées percés ou à ne pouvoir libérer leurs
contenus dans l’emballage secondaire.
Un emballage secondaire étanche protégé

par un emballage extérieur solide.
Des matières de rembourrage et des

matériaux absorbants qui doivent être
disposés entre le(s) récipient(s)
primaire(s) et l’emballage secondaire en
quantité suffisante pour absorber tout le
38
FICHE DE RENSEIGNEMETS
 NOM :…………………………………
 PRENOM : …………………………………
 AGE : …………………………………
 FONCTION : …………………………………
 MALADE HOSPITALISE EXTERNE : …………………………………
 LIEU D’HOSPITALISATION : …………………………………
 MEDECIN TRAITANT : …………………………………
 ADRESSE ET N° DE TELEPHONE : …………………………………
 SITUATION FAMILIALE : …………………………………
 ADRESSE PERMANENTE : …………………………………
 FEMME ENCEINTE : OUI ◊ NON◊
SIGNES CLINIQUES
 FIEVRE : OUI ◊ NON◊ DUREE : …………………………………

 ARTHRALGIES: OUI ◊ NON◊ DUREE : …………………………………
 SUEURS NOCTURNES: OUI ◊ NON◊ DUREE : …………………………………
 TEMPERATURE : …………………………………
 FRISSONS: OUI ◊ NON◊ DUREE : …………………………………
 ASTHENIE: OUI ◊ NON◊ DUREE : …………………………………
 AUTRES SIGNES………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
TESTS BIOLOGIQUES PRATIQUES ET RESULTATS :……………………………………………………………………………………….
NOTION EPIDEMIOLOGIQUES
 PATIENT HABITANT EN MILIEU RURAL : OUI ◊ NON◊

 SI OUI CITEZ LA REGION …………………………………
 LE PATIENT A-T-IL DU BETAIL : OUI ◊ NON◊
 SI OUI LEQUEL ?: …………………………………
 Y’A-T-IL DES CAS D4AVORTEMENTS AU NIVEAU DU BETAIL ; …………………………………
 Y’A T4IL UNE NOTION DE CONSOMMATION DE PRODUITS LAITIERS NON PASTEURISES (FROMAGE-
LAIT) :…………………………………………………………………………………………………………
TRAITEMENT ANTIBIOTIQUE :
 TRAITEMENT RECU: OUI ◊ NON◊

 LESQUELS; …………………………………
 LE TRAITEMENT ANTIBIOTIQUE EST IL SUPERIEUR OU INFERIEUR A 1 MOIS; …………………………………
 DATE DU DEBUT ET DUREE DU TRAITEMENT : …………………………………
PRELEVEMENT :
 NATURE DU PRELEVEMENT: …………………………………

 NOMBRE DE PRELEVEMENTS: …………………………………
 DATE DU PRELEVEMENT : …………………………………
39
 MgCl2,6H2O 0.203 g
 NaCl 8g
ANNEXE 2  Tween 20: 0.5 ml.
 NaN3 : 0.2 ml
SEROLOGIE Compléter à 1 l d’eau distillée.
Réactifs et matériels : 5-Solution de lavage :
 Nacl 8.5 g
Réactifs  Tween 20 0.5 ml
 NaN3 0.2 ml
Antigène brucella fournis par les
 Compléter à 1 l d’eau distillée.
laboratoires BIORAD code 63241 ou
OXOID code 02.01.02260 (Ag Brucella 6-Tampon lait :
melitensis) et 02.01.02619 (B.abortus).
1 g de lait Régilait (existant dans le
Antigène rose Bengale pour le test commerce) pour 10 ml de tampon sérum.
d’épreuve à l’antigène tamponné
commercialisé par BIORAD code 63231 ou Préparation du substrat : 4
BIOMERIEUX code 72691 (Brucella solide Nitrophényl phosphate di sodium salt
test) ou OXOID code 02.01.02621. peser 0.010 g dans 10 ml de tampon
substrat PH 9.6.
Préparation des tampons pour ELISA :
Préparation du tampon PBS, Tween
1-Solution mère pour tampon 20 PH 7.4
oxygène et tampon substrat :
 NaCl 7.65 g
 NaHCO3 (solution A) 84 g/l  Na2HPO4 0.72 g
 Na2CO3 (solution B) 106 g/l.  KH2PO4 0.21 g
2-Tampon antigène PH 9.6 Compléter avec 1 l d’eau distillée.
 Solution A 70 ml Solution de montage pour lames

 Solution B 30 ml d’IFI :
 NaN3 0.2 g (pour conservation)
 Compléter à 1 l d’eau distillé. Utiliser 1 volume de glycérine pour 2
volumes de tampon PBS.
3-Tampon substrat PH 9.6
 Solution A.29 ml
 Solution B.20 ml
 MgCl2+6H2O 0.203 g
 NaN3 0.2 g
 Compléter à 1 l d’eau distillé.
4-Tampon Lait-Sérum PH 7.3
 Il sert à la dilution des sérums et

du conjugué
 Na H2 PO4-H2O 1.31 g
 Na2 H PO4-2H2O 7.208 g ou
Na2HPO4-2H2O 14.49 g
40
Matériel utilisé pour les techniques :

EAT, SAW, IFI, ELISA :
 Plaques pour agglutination

 Agitateur pour microplaque
 Bain marie
 Bâtonnets ou à défaut pipettes
pasteur à extrémités non cassées.
 Micropipette de 100 ul avec
embouts.
 Micropipettes multicanaux de 200
ul avec embouts.
 Tubes de Kahn
 Portoirs métalliques
 Etuve à 37°C.
 Hotte.
 Lames Téflon cerclées pour IF.
 Microplaque en forme U Greiner
avec couvercle.
 Papier Buvard.
 Papier aluminium
 Microscope à fluorescence.
 Lecteur ELISA avec imprimante.
 Laveur de microplaque.
 Bacs et porte lames pour lavage des
lames d’IFI.
41
10-M.N.Ouar-Korichi,H Senouci,K.Rahal-
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Algerie : situation épdemiologique REM
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9-M.Lovgren-2003 Gram négative
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42
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review of literature.Part I Technique for
direct detection and identificaation of
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25-OMS-sécurité sanitaire-transport de
substances infecieuses 2004 Transport des
substances infectieuses
WHO/CDS/CSR/LYO/2004-9 P32.
43
Remerciements
Nos remerciements vont à :
Pr Belkaid directeur de l’institut pasteur

d’Algerie qui nous a permis d’editer ce
fascicule.
Mr JM Verger et Mme M Grayon du

laboratoire de Brucellose à l’INRA Nouzilly
qui nous ont permis d’acquerir les
techniques bacteriologiques du diagnostic
de la brucellose.
Mr Brun du laboratoire de sérologie de la

brucellose humaine,laboratoire arnaud
Villeneuve de Montpellier.
Nous tenons à remercier le personnel

technique (H Senouci et M Lazri) qui
manipule les prelevements de brucellose
au laboratoire de bacteriologie médicale
Humaine.IPA.
44
Royal Tropical Institute / Koninklijk Instituut voor de Tropen (KIT) 3-9-2002
Brucella IgM / IgG Flow assay

Brucella-specific immunoassays for use on human serum or whole blood samples
Instructions for use
Intended use:
The Royal Tropical Institute (KIT) in Amsterdam has developed the Brucella IgM and IgG Flow assays for the rapid
serodiagnosis of brucellosis in human. The Brucella IgM Flow assay is designed for the detection of Brucella-specific
immunoglobulin M (IgM) antibodies, and the Brucella IgG Flow assay is designed for the detection of Brucella-specific IgG
antibodies.
Introduction:
Brucellosis is a zoonosis caused by Brucella abortus, B. suis and B. melitensis. Clinical manifestations of brucellosis in human are
variable and often are non-specific, and the diagnosis requires confirmation by laboratory testing. The Brucella IgM and IgG Flow
assays provide an indirect measure for infection through the detection of specific antibodies. Specific IgM antibodies usually
predominate early in the disease. Specific IgG antibodies may remain present for a much longer period and predominate in persistent
infections and during relapse.
The Brucella IgM and IgG Flow assays are relatively simple and rapid assays. The assays require neither special training,
equipment nor electricity. Results are obtained in 10 to 15 minutes. The assays and the running fluid can be stored at +2° C to
+25° C.
Principle:
The Brucella Flow assay is a one step immunochromatographic lateral flow assay. A lipopolysaccharide antigen (LPS) prepared
from a culture of B. abortus is immobilised in a discrete line on a porous nitrocellulose membrane located in the test zone. The
assay utilises a dried detection reagent deposited within the device. The mobile detection reagent consists of anti-human
antibodies labelled with red colloidal gold particles. The Brucella IgM Flow assay uses anti-human IgM antibodies and the
Brucella IgG Flow assay uses anti-human IgG antibodies. To perform the assay a serum sample is placed in the sample port.
Running fluid is added to solubilize the detection reagent and to carry the serum molecules and detection reagent through the
porous membrane in the test zone. Antibodies in the serum that are specific for Brucella attach to the LPS antigen and these
antibodies will be stained by binding of the detection reagent. The presence of specific IgM antibodies will be revealed by the
appearance of a red line in the test zone in the Brucella IgM Flow assay. A red line will appear in the test zone in the Brucella IgG
Flow assay when specific IgG antibodies are present. If the sample does not contain Brucella-specific IgM or IgG antibodies, the
sample and detection reagent will pass over the test zone and no line will appear in the test zone. With any sample a red line
should appear in the control zone. The control ensures that the detection reagent is still active.
Test kit and labelling:

Brucella IgM Flow assays and Brucella IgG Flow assays are supplied as separate kits. Each kit contains 25 individually wrapped
assay devices together with 1 bottle of running fluid, sufficient for the analysis of 25 serum samples. One plastic reusable pasteur
pipet.
• Note: plastic devices are not labelled individually and should be marked “IgM” or “IgG” by the user
Utensils not provided:

Micropipet and disposable pipet tips for application of serum
Lancet and heparinised 50ul capillary for collection and application of whole blood.
Storage:
Brucella Flow kits should be stored at +4° C to +25° C, in a dry place and protected from direct exposure to sunlight for optimal
performance. Individual devices may be stored at +25° C to +45° C for short periods.
Expiry date:
The date of manufacturing is printed on the packaging. When stored properly tests may be used for at least two years after the
date of manufacturing
Precautions:
Blood and serum samples should be handled with care as they are potentially infectious. Equipment and supplies for specimen
handling should be treated accordingly. Used Brucella Lateral Flow devices, disposables and samples should be properly
decontaminated and discarded.
Specimen collection:
Serum should be prepared in the same way as routinely performed for any serological assay. Freshly collected samples should be
used. Serum samples stored at -20° C may be used as well.
Whole blood samples may be collected by fingerprick with a lancet and a glass capillary coated with an anticoaggulant
Standard assay procedure for serum:

1. Remove a Brucella Flow assay device from the packaging and place on a bench top with the test window facing upwards.
Mark IgM test “M” and IgG test “G”.
2. Spot 5µl of serum to the sample pad in the round sample port using a micropipet and a disposable pipet tip.
3. Immediately add 130µl running fluid to the round sample port. The running fluid may be added using a micropipet or using
the plastic Pasteur pipet provided. When using the Pasteur pipet just transfer enough running fluid to completely fill the
round sample port. Keep the Pasteur pipet for later use.
4. You will see a colour moving across test and control zones. This shows that the test is working.
5. Read results at 10 to 15 minutes.

6. Results are stable for a further 10 to 15 minutes; thereafter false results may occur.
Standard assay procedure for whole blood :

1. Remove a Brucella Flow assay device from the packaging and place on a bench top with the test window facing upwards.
Mark IgM test “M” and IgG test “G”.
2. Collect 10µl of whole blood from finger prick with the anticoagulant coated capillary. Place the tip of the capillary on the
sample pad to make direct contact with the pad. The pad thus will drain the blood sample from the capillary
3. Immediately add 130µl running fluid to the round sample port. The running fluid may be added using a micropipet or using
the plastic Pasteur pipet provided. When using the Pasteur pipet just transfer enough running fluid to completely fill the
round sample port. Keep the Pasteur pipet for later use.
Note: the use of whole blood instead of serum may give some background staining in the test window. However this does not influence the
reading of the test result.
Interpretation of test results:

Brucella IgM Flow assay
- A positive result is indicated by the presence of a line at the test zone and a line at the control zone. In brucellosis, specific
IgM antibodies usually are present during the first view months of illness. Specific IgM antibodies generally are not present
in patients with persisting brucellosis. A positive result in the Brucella IgM Lateral Flow assay is consistent with acute
brucellosis. Specific IgM antibody levels rapidly decline after treatment
- A negative result is indicated by absence of a line at the test zone and presence of a line at the control zone.
Brucella IgG Flow assay
- A positive result is indicated by the presence of a line at the test zone and a line at the control zone. Specific IgG antibodies
develop shortly after infection and may remain present months to years after infection. A positive result in the Brucella IgG
Flow assay is consistent with active brucellosis. Specific IgG antibodies also may be formed during relapse.
- A negative result is indicated by absence of a line at the test zone and presence of a line at the control zone.
4+ 3+ 2+ 1+ Negative Negative
The Brucella IgM and IgG Flow assays are complementary assays and the use of both tests increases sensitivity. In some patients specific
IgM and IgG antibodies may be present at the same time. In other patients only one of these two antibody species may be present
Limitations of use:
The sensitivity and specificity of the Brucella Flow assays depends on various factors including stage of disease and previous
antibiotic usage.
Further reading of suggested literature:

Young EJ An overview of human brucellosis. Clin. Inf. Dis. 1995; 21, 283-290.
Smits HL, Abdoel TH, Solera J, Clavijo E and Diaz R. Immunochromatographic Brucella-specific immunoglobulin
M and G lateral flow assays for the serodiagnosis of human brucellosis. Clin. Diagn. Lab. Immunol 2003;10:1141-
1146.
Irmak H, Buzgan T, Evirgen O, Akdeniz H, Demiroz AP, Abdoel TH and Smits HL. Use of a New, Simple and
Rapid Diagnostic Test, the Brucella-IgM and IgG Flow Assays in the Serodiagnosis of Human Brucellosis in an
Endemic Area in Eastern Turkey. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2004;70:688-694.
KIT Biomedical Research Tel: 31 20 5665470

Royal Tropical Institute / Koninklijk Instituut voor de Tropen (KIT) Fax: 31 20 6971841
Meibergdreef 39 H.Smits@kit.nl
1105 AZ Amsterdam www.kit.nl
The Netherlands
2
Brucella IgM / IgG Flow Assay
Short protocol
Introduction
The Brucella IgM / IgG Flow Assay consists of two tests one for the detection of specific IgM antibodies and
one for the detection of specific IgG antibodies. The presence of specific IgM and IgG antibodies in the serum
of patients with brucellosis depends on the stage of illness. Therefore the two tests should be used as
complementary tests to increase sensitivity.
Storage
Brucella Flow kits should be stored at +4° C to +25° C, in a dry place and protected from direct exposure to
sunlight for optimal performance. Individual devices may be stored at +25° C to +45° C for short periods.
Assay procedure
A. Serum
1. Remove a Brucella Flow IgM Flow assay device from the packaging and place on a bench top with the test
window facing upwards.
Mark “M” using a pencil or marker pen.
2. Remove a Brucella Flow IgG Flow assay device from the packaging and place on a bench top with the test
window facing upwards.
Mark “G”.
3. Using a micropipet and a disposable pipet tip spot 5µl of serum to the sample pad in the round sample port
of the IgM Flow assay and spot 5ul of serum to the sample pad in the round sample port of the IgG Flow
assay.
4. Immediately add 130µl running fluid from the bottle provided to the round sample port. The running fluid
may be added using a micropipet or using the plastic Pasteur pipet provided. When using the Pasteur pipet
just transfer enough running fluid to completely fill the round sample port.
5. Close bottle and store bottle and Pasteur pipet for later use.
7. Read results at 10 to 15 minutes. Any staining observed at the test line should be considered positive. The
picture may be used for guidance.
B. Whole blood
1. Remove a Brucella Flow assay device from the packaging and place on a bench top with the test window
facing upwards. Mark IgM test “M” and IgG test “G”.
2. Collect 10µl of whole blood from finger prick with an anticoagulant coated capillary. Place the tip of the
capillary on the sample pad to make direct contact with the pad. The pad thus will drain the blood sample
from the capillary
3. Immediately add 130µl running fluid to the round sample port. The running fluid may be added using a
micropipet or using the plastic Pasteur pipet provided. When using the Pasteur pipet just transfer enough
running fluid to completely fill the round sample port. Keep the Pasteur pipet for later use.
Note: the use of whole blood instead of serum may give some background staining in the test window. However
this does not influence the reading of the test result.
4+ 3+ 2+ 1+ negative negative
Interpretation
A positive ( 1+) in either or both assays is highly consistent with brucellosis. The sensitivity of the two
tests combined for culture confirmed patients is almost 100%. The specificity is >95%.
3

Diagnostic Bacteriologique Et Serologique de La Brucellose

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Année Négatifs Total Positifs % de Positifs

1997 114 127 13 10.23

1998 129 135 6 4.44

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2001 210 256 46 17.96

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