ANEXOS:

Cultivo y aislamiento de bacterias

1. ¿Qué es el agar y de donde se obtiene?
El agar es un poligalactosido (polisacárido complejo formado por la mezcla de
agarosa y agaropectina), obtenido de algas rojas marinas principalmente de los
géneros Gracilaria, Gelidium y Euchema. Este muy utilizado debido su función como
agente gelificante en la preparación de medios de cultivos. 1

2. ¿Por qué el agar nutritivo es un medio general para el cultivo de

bacterias?
El agar es un medio general para el cultivo de bacterias pues estos microorganismos
son incapaces de degradarlo, puesto que presenta una capacidad superior a la
gelatina animal para resistir la capacidad licuadora de los microorganismos y
mantenerse estables a una temperatura adecuada para la incubación de los
mismos. Además estos microorganismos son poco exigentes en sus
requerimientos nutricionales, no presentan inhibidores del desarrollo bacteriano. Por
otra parte puede ser solidificado o convertido en gel con facilidad lo que permite que
los microorganismos puedan mezclarse en él fácilmente.

3. ¿Cuáles son las ventajas de un cultivo puro

Si se quiere estudiar, caracterizar e identificar algún microorganismo en particular,
se requerirían cultivos puros de estos individuos, debido que en los ambientes
naturales los microorganismos se encuentran usualmente como poblaciones mixtas
y sería muy compleja su distinción, entre sus ventajas están:
 Son esenciales para poder estudiar las características de los
microorganismos.
 Importantes para poder identificarlos con seguridad.
 se han diseñado para conservar la pureza de los cultivos y evitar su
contaminación con otros microorganismos que no nos interesan

4. ¿Por qué razón no debes compartir el mechero de Bunsen?

El mechero Bunsen permite crear una zona aséptica de trabajo y la esterilización de
diversos instrumentos como el asa de siembra o material de vidrio, mediante la
aplicación directa de calor.
En las prácticas de microbiología no se debe compartir el mechero, ya que al ser
este un mechero de gas al compartirlo se necesitaría tenerlo apartado del lugar
donde se esté trabajando y este es muy necesario para tener asepsia y tener el
lugar esterilizado y los materiales, teniendo buen uso de este.
5. ¿Cuál es la razón para flamear los tubos antes y después de cada
transferencia?
En microbiología es importante que en el material donde se va a inocular se flamee
antes ya que así se evitaría que al momento de destaparlo se encuentre
contaminado por algún microorganismo, y después en caso de que el asa llena de
inoculo accidentalmente toque a boca del tubo se debe flamear para que no queden
restos de microorganismos en este.
 6. Explica por qué debes evitar que el asa llena de inóculo toque la boca
del tubo fuente o del tubo a ser inoculado
Se evita ya que al tocar el asa la boca del tubo podría contaminarlo de
microorganismos llegando así a no dar los resultados esperados y
contaminando el material con que se estaría trabajando.

7. Cuando tomas un inóculo de una caja de Petri. ¿Por qué es necesario

tocar una parte estéril del agar con el asa antes de tocar el crecimiento
bacteriano?
Se debe de tocar una parte estéril del agar para disminuir la temperatura del asa
que previamente fue flameada, esto para evitar la exposición directa de la alta
temperatura en la que se puede encontrar el asa con los microorganismos, que
como consecuencia podría causar la muerte de estos.

8. ¿Por qué el asa debe ser flameada antes y después de todos los
procedimientos de siembra?
El asa debe esterilizarse antes de su utilización para evitar la contaminación de los
microorganismos que se desean estudiar con otros microorganismos que pudieran
estar presentes en el filamento metálico y después de su uso para evitar que los
microorganismos que se han tomado contaminen la zona de trabajo en el laboratorio
o sean incluso un riesgo biosanitario.

9. ¿Por qué las cajas de agar deben mantenerse invertidas durante la

incubación?
La caja de Petri, debe estar invertida durante la incubación para evitar que se
extiendan las colonias con el agua de condensación, que de otra manera puede
caer sobre ellas. Si la placa no es invertida durante la incubación, la bacteria no
podrá colonizar el agar apropiadamente, lo que evitará que crezca y forme colonias
adecuadamente, o estimulará el crecimiento de otros microorganismos. Cualquiera
de estas dos consecuencias invalidará el experimento. Además, la condensación o
humedad puede causar vetas, lo que hará que elegir y analizar colonias separadas
sea mucho más difícil. Una vez que la bacteria ha formado colonias, la placa
también debe ser almacenada hacia abajo para mantener los niveles de humedad.

Tinción simple
 ¿Por qué los colorantes básicos son más efectivos para las tinciones
bacterianas que los tintes ácidos?
Los colorantes básicos, se utilizan con mayor frecuencia que los colorantes ácidos,
debido a que estos últimos no son atraídos por la gran mayoría de bacterias, ya que
la superficie bacteriana con carga negativa repele los iones negativos del colorante,
de manera que este tiñe el fondo en lugar de la estructura bacteriana. Entre los
colorantes básicos encontramos el violeta de genciana, el azul de metileno, el verde
de malaquita y la safranina. 2
 ¿Una tinción simple puede ser usada para identificar algo más que las
características morfológicas de un microorganismo? Explique.
Sí, porque a pesar que la tinción simple brinda información sobre morfología,
también se encuentra relacionada a la determinación de presencia, concentración y
modo de agrupación bacteriana.

 Si se te olvidara fijar la muestra durante la aplicación del procedimiento de

tinción simple, ¿Qué diferencias crees que encontrarías al mirar tu muestra
en comparación con una correctamente fijada?
La observación de una menor cantidad de bacterias, ya que el frotis debe ser fijado
al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los métodos de tinción y poder hacer la
observación al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en
los sucesivos lavados. También la fijación de una extensión bacteriana ayuda a que
las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la
morfología y las posibles agrupaciones de células que pudiera haber.

 Si durante una charla de amigos uno de ellos derrama café sobre tu

camiseta y luego de varias lavadas no puedes recuperar su color original;
¿podemos decir que el café es un verdadero tinte biológico o es solo una
sustancia capaz de impartir color? Explica tu razonamiento.
Diría que es una sustancia que de imparte color, debido a que el café químicamente
se compone de agua y materia seca. La materia seca de los granos del café se
encuentra constituida por minerales y por sustancias orgánicas. De estos últimos se
da un complejo de reacciones químicas que traen consigo la producción de
melanoidinas coloreadas que le confieren el color marrón a este. 3 Por lo que estas
moléculas melanoides quizás no formarían uniones químicas con un grupo químico
en un tejido, no sufrirían adhesión sobre la superficie de algún tejido y tampoco
formarían reacciones con el tejido para producir una coloración.

Tinción diferencial
 ¿Cuál es la ventaja de la técnica de tinción diferencial frente a la de tinción
simple?
Es un método rápido y sencillo que permite la observación de formas, tamaños y la
agrupación de los microorganismos que pueden encontrarse en cadena, de a pares,
etc. También ayuda a la diferenciación de las bacterias grampositivas de
gramnegativas y ayuda a saber si la microbiota estudiada es mixta o mono-
especifica. 2

 Diga cuál es la función de Cada uno de los siguientes reactivos en una

tinción diferencial.
-Tinte primario: es el colorante principal que se va usar para teñir en un principio a
las células.
-Contratinte: es la sustancia que contra tiñe las células que han sido previamente
decoloradas y además el color contrasta con el tinte primario.
-Agente decolorante: es como su nombre lo indica, el agente que ayuda a
decolorar una parte de las células que se han teñido.
-Mordiente: es la sustancia que sirve para fijar los colorantes en la tinción con
mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. 2

 ¿Por qué es esencial que el colorante primario y el contra tengan colores

contrastantes?
Es esencial para poder observar las bacterias que tiñen de primario con un color y
luego al momento de teñir las bacterias faltantes con un color opuesto sea más
sencilla hacer la distinción de microorganismos en la muestra.

 ¿Cuál cree usted que es el paso más crucial en la coloración de Gram?

explique.
Agregar alcohol-cetona, debido a que en este paso se da la decoloración de las
gram negativas, mientras que gram positivas no se decoloran. Por ende ya se
podría diferenciar directamente en este paso las bacterias grampositivas de las
gramnegativas.

 Suponga que el laboratorio de hoy fue aplazado y se realiza la próxima

semana con el cultivo de B. cereus que tiene 9 días de antigüedad. Al
realizar la tinción de Gram usted observa celular teñidas de violeta intenso
y otras de color rosa. Proponga una explicación a este resultado
Se trata de un bacilo gram positivo. La edad de los cultivos puede afectar
notablemente su reacción a la coloración gram y se sugiere usar cultivos recientes
de hasta max 24 horas, ya que al utilizar cultivos de más de 24 horas, las bacterias
pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal violeta – yodo y se puede
dar una mala tinción de la muestra. También puede presentarse la contaminación
de la muestra con otra bacteria en el lapso que estuvo en el laboratorio y por tanto,
se puede observar una placa mixta.

Bibliografía

 [1] Negroni, M. Microbiología Estomatológica. 2nd ed. Buenos Aires: Medica

Panamericana. 2009, p.51.
 [2] Tortora, G., Funke, B. and Case, C. Introducción a la microbiología. 9th ed.
Buenos aires: Medica panamericana. 2007, p.69
 CULTIMED. Manual básico de microbiología. Instrumentación científico
técnica.