“Año del buen servicio al ciudadano”

Universidad Nacional Mayor de San

Marcos
(Universidad del Perú, Decana de América)
Facultad de Ciencias Biológicas
EAP Ciencias Biológicas

Práctica 2
CARACTERIZACION ESPECTROFOTOMETRICA
DEL ADN
Curso: Laboratorio de Biología Molecular

Integrantes:

 Sulca Miranda, Angela Fiorela 17100083

 Correa Salazar, Leslie Pamela 16100064
 Bravo Vega, Daysi

Horario: Viernes 13 -17 horas

Ciudad universitaria, 12 de septiembre de 2018

 INTRODUCCIÓN

En laboratorios en donde se usa el ADN como son los de diagnóstico y tratamiento de enfermedades,
en medicina forense, pruebas de paternidad, fármacos, agricultura y ganadería transgénicos es de
mucha importancia que todos los pasos de la Metodología de Extracción y Análisis del ADN sean de alto
rendimiento y poco costosos(1)
Una de las etapas de esta metodología es la cuantificación. Es esta etapa la que determina la
concentración y pureza de los ácidos nucleicos en una preparación. Este paso, junto con un estudio de
acción de nucleasas para obtener la calidad del ADN, va a determinar la eficacia del método con el cual
se extrajo el ácido nucleico(2)
Existen diversos métodos de cuantificación de ácidos nucleicos; sin embargo, los más usados son la
espectrofotometría y la fluorometria. El fundamento de la espectrofotometría es que cualquier solución
que contenga moléculas suspendidas permite el paso de un haz de luz a través de ella en proporción
inversa a la cantidad de moléculas que contiene. Los nucleótidos de ADN presentan la absorción máxima
a una longitud de onda de 260 nm (luz ultravioleta, UV); por lo tanto, los espectrofotómetros son los
aparatos más utilizados para determinar el estado del ADN, la concentración de ácidos nucleicos en
solución; así como también, para evaluar la contaminación por proteínas a través del índice 260÷280 y
entonces valorar la pureza del ADN. Por otro lado, la fluorometria se basa en la unión específica de
colorantes fluorescentes al ácido nucleico, que absorbe luz de una determinada longitud de onda y
emite luz de una longitud de onda superior (de menor energía). La relación entre la concentración del
ácido nucleico y la intensidad de emisión fluorescente es directamente proporcional(3)
Las nucleasas atacan el ADN en sus enlaces peptídicos liberando sus nucleótidos y así resultando en una
estructura que absorbe más luz UV (aumenta su absorbancia). En un ADN de calidad (poco hidrolizado)
si hay acción significativa de nucleasas. Por el contrario, en ADN de poca calidad (algo hidrolizado) las
nucleasas ya tienen pocos sitios de acción de las enzimas(4)
En este informe se evalúa que tan eficaz es el método de extracción cloroformo: alcohol isoamilico a
través del uso de la espectrofotometría con el que se obtiene pureza, estado del ADN y concentración
;y la hidrolisis con enzimas nucleasas correlacionándolo con hidrolisis de sustratos sintéticos obteniendo
la calidad.

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Resultados

ANÁLISIS ESPECTROFOTOMÉTRICO DEL ADN ANIMAL

Muestra Absorbancia a 260nm Absorbancia a 280nm

Tubo 1 0.290 0.159

Tubo 2 0.364

Tubo 3 0.256 0.158

Tubo 4 0.277

a. Estado del ADN

Para Argopecten sp.

Comparamos los tubos 1 y 2 a 260nm
Tubo 1 0.290 100%
Tubo 2 0.364 X

0.364𝑥100
X= = 125.5%
0.290

El incremento será de 125.5% - 100% = 25.5%

Como el incremento no supera el 30%, entonces suponemos que el ADN se encuentra en
estado desnaturado

b. Concentración de la muestra

Para Argopecten sp.

Ya que el ADN se encuentra en forma desnaturada, usaremos la siguiente relación:
1mg/ml de ADN = 27 unidades de absorbancia a 260nm
1mg/ml 27
X 0.290

𝑚𝑔
1 𝑚𝑙 𝑥 0.290
X=
27
X = 0,01074 mg/ml
Como al dilución fue de ¼, este valor se multiplica por 4
0,01074 x 4 = 0.04296 mg/ml
0.04296 mg/ml es la concentración de ADN en la muestra

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c. Grado de pureza

Utilizaremos la siguiente relación para cada caso:

Grado de pureza = Abs260/Abs280
0.290/0.159 = 1.82
El valor está por encima de 1.8, por lo que no es necesario determinar la concentración de
proteínas contaminantes, ya que su cantidad es mínima.

ANAILISIS ESPECTROFOTOMETRICO (VEGETAL)

Absorbancia a 260 nm en dilución de:

1:10 ADN pisum: 1 A

Para obtener en un rango de 0.500A se hacen diluciones de:

1:20 ADN pisum: 0.461ª

Se prepara una batería de tubos para el análisis

260 nm 280 nm

H2O 0.256 A 0.138 A

ADN pisum
NaOH 0.277 A

a) Estado de ADN

|0.277 − 0.256 |
𝑥 100 = 8.2%
0.256

.: El ADN se encuentra en estado denaturado

b) Concentración de la muestra

Estado denaturado:

1 mg/mL → 27

X→ 0.256 A

X: Concentración del ADN pisum diluido

4
 X=0.00948 mg/mL

[ ] ADN pisum =0.00948 mg/mLx20 (dilución)

[ ] ADN pisum =0.1896 mg/mL

c) Grado de pureza

𝐴𝑏𝑠 260
ADN pisum: = 1.855 ≈ 2
𝐴𝑏𝑠 280
-Determinación de concentración de proteínas:

Proteína (mg/mL)=1.55 (Abs280) – 0.76 (Abs260)

[ ] Proteína ADN pisum = 0.01936 mg/mL

ACCIÓN DE NUCLEASAS

a) Sobre sustrato natural (solución de ADN)

 Absorbancia registrada a 260nm : 0.242 A

 Se añadió la nucleasa e incubó la muestra durante 15 minutos.
Absorbancia registrada a 260nm : 0.309 A

Hallamos el incremento: Con los datos obtenidos se quiere conocer el incremento de la absorbancia,
realizando una regla de tres se obtiene lo siguiente:

100𝑥(0.309 − 0.242)
= 27,7%
0.242

b) Sobre sustrato sintético (bis-pNFF)

Absorbancia 400nm

Tubo1 0,368

Tubo2 0,593

Se determinó la Actividad Específica (AE), con la siguiente ecuación:

𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜 𝑙𝑖𝑏𝑒𝑟𝑎𝑑𝑜 𝑈𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎

𝐴𝐸 = ⁄ ⁄
(𝜇𝑀) (𝑚𝑖𝑛. ) (𝑚𝑔. )

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Teniendo en cuenta que:

𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛(𝑝 − 𝑛𝑖𝑡𝑟ó𝑔𝑒𝑛𝑜) = 6𝜇𝑀

6𝜇𝑀 𝑒𝑞𝑢𝑖𝑣𝑎𝑙𝑒 𝑎 1.000 𝑢𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎

Para el tubo 1:

 Cantidad de producto liberado:

6𝜇𝑀 → 1.000

𝑋 → 0,368

𝑋 = 2,2𝜇𝑀

 Tiempo usado: 3min.

 Cantidad de enzima usada:
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 𝑢𝑠𝑎𝑑𝑎 × 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛
= 𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎.
Reemplazando:

2 𝑚𝑔⁄𝑚𝑙 × 0,1𝑚𝑙 = 0,2𝑚𝑔

Reemplazando en la ecuación:

𝐴𝐸 = 2,2𝜇𝑀⁄ 3min⁄0,2𝑚𝑔

𝑨𝑬 = 𝟑, 𝟔𝟕 𝝁𝑴⁄ 𝐦𝐢𝐧⁄𝒎𝒈

Para el tubo 2:

Cantidad de producto liberado:

6𝜇𝑀 → 1.000

𝑋 → 0,593

𝑋 = 3,558 𝜇𝑀

 Tiempo usado: 6min.

 Cantidad de enzima usada:
2 𝑚𝑔⁄𝑚𝑙 × 0,1𝑚𝑙 = 0,2𝑚𝑔

Reemplazando en la ecuación:

𝐴𝐸 = 3,553 𝜇𝑀⁄ 6min⁄0,2𝑚𝑔

𝑨𝑬 = 𝟐. 𝟗𝟔 𝝁𝑴⁄ 𝐦𝐢𝐧⁄𝒎𝒈

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Discusión y conclusiones

ANÁLISIS ESPECTROFOTOMÉTRICO DEL ADN ANIMAL

Discusión:

 Para poder evaluar que los métodos de extracción de ADN usados en la anterior práctica
hayan sido eficaces se realizó el análisis espectrofotométrico del ADN, donde se tomó
en cuenta el estado del ADN, la concentración de la muestra y el grado de pureza del
producto resultante luego de la extracción.
 El porcentaje de incremento nos resultó menor de 30%, por lo que nuestro ADN extraido
estaba en un estado desnaturado, posiblemente porque al momento de la extracción,
hubo un mal manejo del material al agitarlo o aplicarle movimiento mecánico en exceso,
aunque también puede haber influido la cantidad de solución C (salina citratada) que se
nos pudo haber pasado, alterando el pH y provocando la desnaturalización
 Para la concentración de la muestra de ADN, nos resultó 0,01074 mg/ml, resultado en
el cual influyó el estado del ADN, debido a que la mayor parte de nuestro ADN extraido
estaba de forma desnaturada, por lo que hay más bases sueltas debido al rompimiento
de los puentes de hidrógeno, y ya que las bases púricas y piridiminicas tienen la
propiedad de absorber la luz UV a 260nm, a mayor cantidad de estas bases sueltas en
hebras monocatenarias, mayor será la cantidad de absorbancia, dándonos más
concentración de ADN en la muestra.
 Por último, analizando el grado de pureza mediante la relación de las absorbancias a
260nm y 280nm, este nos resultó un valor encima de 1.8, por lo que la concentración
de proteínas contaminadas es minima. Esto se debió al buen manejo del experimento al
agregar el cloroformo y el alcohol isoamilico al momento de la extracción, logrando en
su totalidad la separación de las proteínas del ADN, causado por la desnaturalización de
las proteínas.

Conclusiones

 El incremento en la absorbancia es importante para cuantificar el ADN extraido,

debido a que la naturaleza nativa o desnaturada en la que este, influirá directamente
en la proporción de unidades de absorbancia con respecto a la concentración de ADN
 El grado de pureza es independiente del estado del ADN, debido a que nuestra
extracción estaba mayoritariamente pura, aunque estuviera en su mayor parte en el
estado desnaturado.

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ANAILISIS ESPECTROFOTOMETRICO (VEGETAL)
Discusión:

 La absorción de luz UV de una cadena de ADN denaturada es mayor que el ADN nativo,
esto se da debido a que las bases nitrogenadas del ADN denaturado o de cadena sencilla
están más expuestas. A este fenómeno se le denomina Efecto Hipercromico. Al
representar la absorbancia a 260 nm cuando se le agrega agua y cuando se le agrega
hidróxido de sodio se va a observar un incremento. Si el incremento de absorbancia es
mayor o igual al 30%, entonces el ADN se encuentra en estado nativo, así mismo si el
incremento no supera el 30% el ADN se encuentra en estado denaturado o persiste ARN
en la solución. Esto se da porque el medio afecta en mayor o menor medida
dependiendo si el ADN es nativo o denaturado, ya que el medio básico (NaOH)
estabilizan la unión de las bases se unen mediante enlaces N-glucosídico con el
N1 de las pirimidinas o con el N9 de las purinas para formar los nucleósidos. El
incremento del ADN del pisum diluido fue de 8,2%, muy por debajo de 30%, por lo tanto
el ADN se encuentra en estado denaturado. Esto pudo ocurrir por error sistemático en
la extracción del ADN del Pisum, donde se fragmentaron regiones del ADN nativo.
(Estado de ADN)
 Si la muestra es pura la estimación de su densidad es más significativa. El ADN aunque
es una molécula estable presenta una tasa de degradación que depende de las
condiciones de almacenamiento, la forma de extracción del ADN, entre otros. La
concentración del ADN de Pisum fue de 0.1896 mg/ml. Si compara con el ADN de
Argopecten hay una diferencia significativa, ya que estado de almacenarían y la forma
de extracción del ADN debió haber sido el mismo esta diferencia se puede deber al tipo
de tejido de las dos muestras (Concentración de la muestra)
 La pureza del ADN en el Pisum fue de 1,855 sacado al calcular la relación entre
absorbancia de 260 y 280, este valor es mayor a 1.8 y se aproxima a 2, por lo que se
acepta esta muestra de ADN. Esto demostró que el rendimiento la lisis y purificación en
la extracción fue positiva y que no hubo un una concentración de proteína considerable,
a pesar de esto lo corroboramos calculando la concentración de proteína que fue de
0.01936 mg/mL. Esto se logró debido a que el método de extracción es simple, y se
obtiene regiones de ADN sin contaminantes. (Grado de pureza).

Conclusiones

 El incremento del ADN del Pisum diluido fue de 8,2%, muy por debajo de 30%, por lo
tanto el ADN se encuentra en estado denaturado. (Estado de ADN)
 La concentración del ADN de Pisum fue de 0.1896 mg/ml Si compara con el ADN de
Argopecten hay una diferencia significativa.
 La pureza del ADN en el Pisum fue de 1,855 se aproxima a 2, por lo que se acepta esta
muestra de ADN.

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ACCIÓN DE NUCLEASAS

a) Sobre sustrato natural (solución de ADN)

Discusión:

 No obstante se debe tener en cuenta, que para la prueba de Determinación del Estado del ADN,
la dilución usada no fue 1/10, sino ¼, en donde se usaron 1 ml de la muestra y 3 de solución C.
Esto debido a que la muestra presentaba una concentración por debajo de lo esperado.

 Dicho cambio en la concentración nos brinda un indicio de lo importante que es ser objetivo en
cada paso del proceso experimental, ciertamente el trabajar con una nueva concentración
debería ser suficiente para estimar los resultados obtenidos como certeros.

Conclusiones:

 El incremento en la absorbancia fue de 27.68%, lo que corroboraría el resultado de la prueba

anterior (determinación del estado del ADN) que tenía un aumento de 25.5% y al ser valores
menores al 30% se deduce que el ADN se encontraba en estado desnaturalizado.

b) Sobre sustrato sintético (bis-pNFF)

Discusión:

 La diferencia de Actividad Especifica podría deberse por algún error en el cálculo de las
cantidades de sustrato sintético utilizado para cada tubo, lo que se podría deducir con una
coloración amarilla discordante en ambos tubos.

 Gran parte del éxito o error de experimentos delicados como este requieren un control riguroso
en tiempo y cantidades usadas, es muy probable que los valores obtenidos se hayan alejado
ligeramente de los valores teóricos debido a un error de la mano de los experimentadores, sin
embargo, los resultados no muestran datos exorbitantes, y aun poseen validez para ser

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empleados en la práctica.

Conclusiones:

 Posiblemente los valores de Actividad Específica de la enzima utilizada difieran en los

experimentos obtenidos en ambos tubos (1) y (2) debido a una variación en el tiempo
utilizado por los miembros del grupo al detener la reacción cambiándole el pH con NaOH(0.1
N).

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BIBLIOGRAFIA:

1. Nasha Ccancce. Extracción de ADN animal [Internet]. Ciencias presentado en; 02:58:03
UTC [citado 13 de septiembre de 2018]. Disponible en:
https://es.slideshare.net/anawii/extraccin-de-adn-animal
2. P CJPB y CPU. Prácticas de biología molecular. Pontificia Universidad Javeriana; 2005.
110 p.
3. Fundamentos y Aplicaciones en Las Ciencias de La Salud [Internet]. Scribd Biologia
Molecular. [citado 12 de septiembre de 2018]. Disponible en: https://es.scribd.com/do

4. Barbas CF, Burton DR, Scott JK, Silverman GJ. Quantitation of DNA and RNA. Cold
Spring Harb Protoc. 11 de enero de 2007;2007(11):pdb.ip47.
5. Karp A, Ingram DS, Isaac PG, editores. Molecular Tools for Screening Biodiversity:
Plants and Animals [Internet]. Springer Netherlands; 1998 [citado 12 de septiembre de
2018]. Disponible en: //www.springer.com/la/book/9780412638305
6. Alejos Velázquez, L., Aragón Martínez, M. and Cornejo Romero, A. (n.d.). Extracción y
purificación de ADN. [online] Publicaciones.inecc.gob.mx. Available at:
http://www.publicaciones.inecc.gob.mx/libros/710/extraccion.pdf [Accessed 11 Sep.
2018].

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