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Fundamentos de la microscopía
confocal espectral
 6. Microscopía confocal espectral

Microscopio confocal
 6. Microscopía confocal espectral

Microscopio confocal
 6. Microscopía confocal espectral

La distinción fundamental entre la microscopía

óptica convencional y la microscopía óptica confocal
es la manera en la cual se produce la imagen.
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Microscopía óptica convencional

● Interacción de la radiación con la muestra en una
región extensa.
● Imágenes degradadas por toda la información óptica
que se origina en esa extensa iluminación, así como
por la información óptica contenida en planos que no
son el plano enfocado.
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Microscopía óptica confocal

● Se producen punto a punto en el plano imagen a
partir de los correspondientes puntos de iluminación
del plano de la muestra.
● La fuente de iluminación puntual ilumina una región
del objeto y el detector puntual recibe la radiación de
esta área objeto. La imagen se construye por el
barrido sincronizado de la fuente y el detector.
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Microscopía óptica confocal

El principio de confocalidad:
Luz láser
Diafragma
(PINHOLE)

Divisor
del haz Detector

Objetivo

Muestra
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Microscopía óptica confocal

● La calidad de las imágenes resultantes se debe a la
omisión de toda la información óptica fuera de foco
que degrada la imagen en la microscopía
convencional.
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Microscopía óptica confocal

El principio de confocalidad:
● El pinhole está conjugado con el punto focal de las
lentes por eso es un pinhole confocal.
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Microscopía óptica confocal

Luz láser
Diafragma
(PINHOLE)

Divisor
del haz Detector

Objetivo

Muestra
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Microscopía óptica confocal

● La microscopía confocal permite obtener secciones
ópticas en profundidad que generan imágenes
tridimensionales de la morfología de una muestra.

Microscopía confocal Microscopía convencional

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Instrumentación
Secciones ópticas:
Luz láser

Objetivo

Muestra
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Microscopía óptica confocal

● Una imagen confocal es una sección óptica de una
muestra. Tomando distintas imágenes confocales se
obtiene una imagen tridimensional en foco.
● Esta capacidad es útil para medir perfiles de
superficie y cuando se acopla con la fluorescencia
da una representación tridimensional de la
morfología interna de la muestra.
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Microscopía óptica confocal

Células
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Microscopía óptica confocal

Reconstrucción

Células
 6. Microscopía confocal espectral

Microscopía óptica confocal

Series

Drosofila
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Microscopía óptica confocal

Proyección máxima

Drosofila
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Microscopía óptica confocal

Reconstrucción

Drosofila
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Microscopía óptica confocal

Reconstrucción

Convalaria
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¿Cómo funciona un microscopio confocal?

láser

espejos
de barrido

espejo pinhole detector

dicroico

microscopio

muestra
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¿Cómo funciona un microscopio confocal?

láser

espejos
de barrido

espejo pinhole detector

dicroico

microscopio

muestra
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¿Cómo funciona un microscopio confocal?

láser

espejos
de barrido

espejo pinhole detector

dicroico

microscopio

muestra
 6. Microscopía confocal espectral
¿Cómo funciona un microscopio confocal?

La imagen se forma punto a punto

y sección a sección.
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Microscopio confocal ESPECTRAL

Filtro barrera
Filtro de excitación

Espejo dicroico

Muestra
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Microscopio confocal ESPECTRAL

Fluoresceína
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Microscopio confocal ESPECTRAL

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Microscopio confocal ESPECTRAL

Fluoresceína Rodamina
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Microscopio confocal ESPECTRAL

Fluoresceína Rodamina

498 552

537 665
 6. Microscopía confocal espectral

Microscopio confocal ESPECTRAL

La luz emitida por la muestra se separa en bandas

espectrales de modo que se pueda recoger el rango o
rangos de longitud de onda que interese.
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Microscopio confocal ESPECTRAL

Detectores

Rendijas
 6. Microscopía confocal espectral

Microscopio confocal ESPECTRAL

Prisma
Rendija
Detector
 6. Microscopía confocal espectral
Microscopio confocal ESPECTRAL
● El sistema de detección espectral ofrece la
posibilidad de seleccionar libremente las bandas de
detección y aumenta la captación de luz en un 20 –
40 % frente a sistemas de detección basados en
filtros ópticos.

● Esto supone una mayor relación señal/ruido, una

mejor calidad de imagen, menor blanqueado y
mayor viabilidad de muestras vivas ya que se
requiere menor potencia de láser, y mayor poder de
penetración en muestras con mucha dispersión de
luz.
 6. Microscopía confocal espectral
Microscopio confocal ESPECTRAL
● El resultado es un sistema de detección multibanda
que permite ajustar individualmente las bandas de
emisión aumentando la calidad y reduciendo el
cruzamiento.
● Es un espectrómetro que permite hacer barridos a
diferentes longitudes de onda.
● La longitud de onda puede ser adaptada a las
características reales de emisión de la muestra.
● Fácilmente adaptable a nuevos fluorocromos.
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Preparación de la muestra
● La mayoría de los protocolos de microscopía
confocal se basan en los desarrollados para la
preparación de muestras en microscopía óptica
convencional.
● Un buen punto de comienzo para el desarrollo de un
nuevo protocolo es preparar la muestra para la
microscopía óptica convencional e ir modificándolo
para el confocal según sea necesario.
 6. Microscopía confocal espectral

Preparación de la muestra
● El sistema confocal recoge menos fluorescencia de
una muestra gruesa comparado con el microscopio
convencional por lo que las muestras requerirán
tiempos de tinción mayores o bien mayores
concentraciones, y en el microscopio convencional
pueden aparecer sobreteñidas.
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Preparación de la muestra
● Muchos protocolos incluyen un antiblanqueante que
protege el fluoroforo de los efectos de blanqueo del
láser.
● Es aconsejable utilizar la menor potencia de láser
que sea práctica y así se protege el fluorocromo.
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Preparación de la muestra
● Se deben tomar medidas para preservar la
estructura tridimensional de las muestras utilizando
algún tipo de espaciador entre el porta y el cubre.

● Cuando las muestras vivas están sujetas a estudio,

generalmente es necesario montarlas en una
cámara que provea todo lo necesario para la vida.
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Preparación de la muestra
● Las propiedades de la muestra tales como opacidad
o turbidez pueden influir en la profundidad que es
capaz de alcanzar el láser dentro de la muestra.
Muchos protocolos incorporan algún agente
aclarante que aumenta la transparencia de la
muestra.
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Preparación de la muestra
Fijación:
● Buena preservación de la muestra y del anfígeno
● Sin añadir fluorescencia
Fijadores:
● Metanol
● Aldehídos: Paraformaldehído 4%
Formaldehído 3,9% = Formalina 10%
Glutaraldehído
● Especiales: PLP
(paraformaldehído, lisina, periodato)
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Preparación de la muestra
Marcaje:
● Específico e intenso
● Sin cruzamiento
● Mínimo photobleaching
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Preparación de la muestra
Marcaje:
1. Autofluorescente
2. Tinciones fluorescentes
● Tinciones generales: naranja de acridina, eosina
● Tinciones específicas: (Molecular Probes)
● nucleo: DAPI, Hoechst, Ioduro propidio, Sytox
● mitocondrias: mitotracker
● lípidos: nile red
● filamentos de actina: faloidina
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Preparación de la muestra
Montaje:
● Medio:
● Índice de refracción: glicerol
● Antifading

● Inhibidor de la contaminación: Azida sódica

● Cubreobjetos:
● 0,17 mm
● plano, regular

● Montaje sin apretar pero sin espacio entre

muestra y cubre.