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PROYECTO DE ASIGNATURA
AUTORES:
Valeria Cabrera
Ricardo Carpio
Michael Freire
Ivanna Encalada
José Ramírez
Lucy Reyes
Andrés Rogel
Jandri Vásquez
ASIGNATURA:
TUTOR:
CURSO:
2017 - 2018
INDICE
INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 3
OBJETIVOS ................................................................................................................................. 4
Objetivo General ....................................................................................................................... 4
Objetivos Específicos ................................................................................................................ 4
DESARROLLO ............................................................................................................................ 5
Proteína ..................................................................................................................................... 5
o Métodos de determinación de proteínas ............................................................................ 6
Determinación directa de proteínas ....................................................................................... 7
Métodos directos ............................................................................................................... 8
Titulación con formol .................................................................................................... 8
Métodos colorimétricos ................................................................................................. 8
Destilación directa ......................................................................................................... 8
Métodos al infrarrojo ..................................................................................................... 8
Métodos empíricos ............................................................................................................ 9
Método Kjeldahl............................................................................................................ 9
Otros métodos ................................................................................................................. 10
Absorbancia a 280 nm ................................................................................................. 10
Método de Lowry ........................................................................................................ 11
Método Biuret ............................................................................................................. 11
Método Bradford ......................................................................................................... 12
Método turbidimétrico................................................................................................. 12
Unión de colorantes..................................................................................................... 13
De bca.......................................................................................................................... 13
Métodos físicos ............................................................................................................... 13
Espectroscopia infrarroja............................................................................................. 13
Espectroscopia infrarroja reflectante ........................................................................... 14
Espectrofotometría ultravioleta ................................................................................... 14
Métodos refractométricos ................................................................................................ 15
Espectroscopia electrónica .......................................................................................... 15
PROCEDIMIENTO DEL MÉTODO KJEDAHL ...................................................................... 16
CONCLUSIÓN ........................................................................................................................... 19
RECOMENDACIÓN .................................................................................................................. 19
BIBLIOGRAFÍA......................................................................................................................... 20
INTRODUCCIÓN
El contenido total de proteínas en los alimentos está conformado por una mezcla compleja
de proteínas. Estas existen en una combinación con carbohidratos o lípidos, que puede
ser física o química. Actualmente todos los métodos para determinar el contenido proteico
total de los alimentos son de naturaleza empírica. Un método absoluto es el aislamiento
y pesado directo de la proteína pero dicho método se utiliza sólo a veces en
investigaciones bioquímicas debido a que es dificultoso y poco práctico. (Santiago, 2011)
El método Kjeldahl fue creado en 1883 por Johan Kjeldahl, un danés que revolucionó la
cuantificación de nitrógeno y proteínas. Durante más de 130 años, el método de Kjeldahl
ha sido el estándar oficial en todo el mundo para la determinación de nitrógeno en todos
los tipos de muestras de alimentos, por ejemplo, leche, queso, carne, cerveza, granos,
harina, cereales, entre otros. El método consiste en medio de determinación indirecta,
porque no determina la cantidad de proteína y sí el nitrógeno orgánico. Consta de tres
etapas principales para lograr la determinación de nitrógeno o de proteína que son: la
digestión, destilación y titulación. Este es el método más utilizado en el mundo para este
tipo de determinación, puede tomar hasta 2 horas para obtener un resultado final, y esta
vez puede variar con el tipo de muestra. (TECNAL, s.f.)
Objetivos Específicos
Investigar sobre el método Kjeldahl y su función.
Conocer el procedimiento para llevar acabo el método.
Ofrecer este conocimiento a nuestros compañeros.
DESARROLLO
Proteína
Las proteínas son moléculas complejas imprescindibles para la estructura y función de
las células. Su nombre proviene del griego proteos que significa fundamental, lo cual se
relaciona con la importante función que cumplen para la vida.
Todas las proteínas están compuestos por: Carbono, Hidrogeno, Oxigeno y nitrógeno. La
mayoría de las proteínas contienen además azufre y fosforo.
Según su composición, las proteínas se pueden clasificar en dos tipos que son proteínas
simples o proteínas conjugadas. (Las Proteínas, s.f.)
Las proteínas de los alimentos contienen aminoácidos que tienen varios grupos
funcionales, por lo que muestran una amplia variedad de reacciones químicas. Debido a
que los alimentos contienen mezclas de proteínas, los métodos directos para la estimación
de proteínas deben ser calibrados contra un método estándar de referencia para nitrógeno,
por ejemplo, el procedimiento de Kjeldahl.
Métodos directos
Cuando se adiciona formalina a una solución acuosa neutralizada, que contiene proteínas,
el grupo -NH2 reacciona para formar el grupo metilenoimino -N=CH2 con la liberación
de un protón que puede titularse.
Métodos colorimétricos
La reacción de Biuret da una coloración púrpura cuando los enlaces peptídicos reaccionan
con los iones cúpricos a un pH alcalino y se ha informado que no interfieren pequeñas
cantidades de azúcares reductores (Mitsuda y Mitsunaga, 1974).
Los colorantes de ácidos sulfonados reaccionan con proteínas a pH bajo para formar un
coágulo proteína - colorante insoluble-. Si se separa este coágulo por filtración o
centrifugación, la cantidad de color que permanece en el líquido sobrenadante es
indirectamente proporcional a la cantidad de proteína en la muestra. La reacción del
colorante con las proteínas es compleja y no uniforme, por lo que este método es
altamente empírico y requiere estandarización y calibración.
Destilación directa
Métodos al infrarrojo
Métodos empíricos
Método Kjeldahl
En esta técnica se digieren las proteínas y otros compuestos orgánicos de los alimentos
en una mezcla con ácido sulfúrico en presencia de catalizadores. El nitrógeno orgánico
total se convierte en sulfato de amonio mediante la digestión. La mezcla resultante se
neutraliza con una base y se destila. El destilado se recoge en una solución de ácido
bórico. Los aniones de borato así formado se titulan con HCL estandarizado para
determinar el nitrógeno contenido en la muestra. (JP SELECTA, 2012)
En la etapa de destilación se libera amoniaco, el cual es retenido en una solución con una
cantidad conocida de ácido bórico. Inicialmente se realiza una destilación con vapor por
el método de arrastre de vapor de agua, mediante la cual acelera la obtención del destilado.
Otros métodos
Absorbancia a 280 nm
La mayor parte de las proteínas poseen un pico de absorción máxima a 280 nm. Los
grupos responsables de tal característica son los aminoácidos aromáticos (Tirosina
y Triptofano). Las proteínas poseen coeficientes de extinción molar (E280nm) que puede
variar de acuerdo a su composición aminoacídica entre 0,4-1,5. Como aproximación se
puede considerar que una unidad de absorbancia se corresponde con una
concentración (C) de 1mg/ml de proteínas:
Abs280nm≡1 mg/ml
Si la solución de proteínas contiene DNA y/o RNA se introduce un error en la medición,
dado que estos absorben a 280 nm. (Iribarren, s.f.)
Método de Lowry
1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con
los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína
tienen un color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura
tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van
a participar en la segunda etapa de la reacción. El Cu2+ se mantiene en solución
alcalina en forma de su complejo con tartrato.
Al producirse dicha reacción hay un cambio en el color de la muestra que puede ser
cuantificado determinando la absorbancia a 660 nm.
Existe una amplia lista de sustancias (como buffers, detergentes, lípidos, etc.) que
interfieren con este ensayo y por lo tanto afectan la determinación del C real. La solución
a este problema se consigue por precipitación de las proteínas y re suspensión en un buffer
sin interferentes.
Método Biuret
Para el ensayo de Bradford se utiliza el colorante Coomassie Brillant Blue G-250. Se basa
en la conversión de la forma leuco del colorante (marrón-naranja) a una de color
intensamente azul cuando los grupos aniónicos del colorante interaccionan con los grupos
amino de las proteínas.
Dicha reacción se mide por absorbancia a 595nm y también existe una relación lineal
dentro de determinadas concentraciones de proteínas.
Método turbidimétrico
La turbidez producida cuando una proteína se mezcla con alguno de los precipitantes
comunes (ácido tricloroacético 3-10%, ácido sulfosalicílico y ferrocianuro de potasio en
ácido acético) para proteínas en bajas concentraciones se puede utilizar como un índice
de la concentración de proteínas.
Las técnicas turbidimétricas son rápidas y convenientes, sin embargo las principales
desventajas que presentan es que las proteínas difieren en la velocidad de precipitación
así como no permiten diferenciar entre proteínas y compuestos insolubles en ácidos tales
como ácidos nucleicos. (Layne, 1957)
Unión de colorantes
Controlando el pH y la fuerza iónica del medio los grupos funcionales ácidos y básicos
de las proteínas pueden interactuar con grupos orgánicos de carga opuesta. Al realizarse
la unión se presenta coloración o bien un cambio de ésta. Comúnmente se usan colorantes
sulfonados los cuales reaccionan a pH ácido con el grupo e-amino de la lisina y el grupo
guanidina de la arginina, el imidazol de la histidina y un número limitado de a-amino
terminales.
De bca
Métodos físicos
Son más simples, rápidos y el costo por análisis es menor aunque el costo de los equipos
es elevado. La exactitud de estos métodos se relaciona con las características del material
a analizar. La concordancia con nitrógeno total depende de que el material no varíe de
muestra en muestra.
Espectroscopia infrarroja
La muestra se ilumina con seis longitudes de onda cercanas a la radiación infrarroja (0,75-
2,5 Tm) y se detecta la luz reflejada.
Consideración
Ventajas
Desventajas
Espectrofotometría ultravioleta
Mide proteínas en solución con absorción máxima a 280 nm atribuible a los anillos
aromáticos de tirosina y triptófano y entre 180-220nm.
Ventajas
Rápido, no destructivo.
Desventaja
Interferencia de otros compuestos (ácidos nucleicos, nucleótidos).
Métodos refractométricos
Espectroscopia electrónica
Ventaja
Digestión:
Control Visual: El resultado es un líquido transparente nítido con coloración azul claro,
verde o amarillo dependiendo del catalizador utilizado. No deben quedar restos negros
adheridos a la pared de tubo.
Dilución:
Sacar los tubos muestra del bloque digestor y dejar enfriar a Tª ambiente. (Puede
forzarse sumergiendo los tubos, cautelosamente, en un poco de agua).
Añadir unos 25ml de agua destilada en cada tubo.
Añadir el agua despacio y moviendo el tubo sin dejar solidificar la muestra. Si es
necesario calentar ligeramente el tubo (por ej. introduciéndolo en el bloque
digestor todavía caliente)
Dejar enfriar de nuevo hasta To ambiente.
Para evitar pérdidas de nitrógeno y reacciones violentas no introducir el tubo
todavía caliente al destilador.
Destilación:
Control Visual: Una vez se ha añadido el NaOH, la muestra debe tomar una coloración
azulada, de no ser así, añadir más NaOH.
Valoración y cálculo:
Valorar el destilado con HCl o H2SO4 hasta el cambio de color. (Punto final: pH 4.65)
Realizar el cálculo:
𝑚𝑔 𝑁 = 𝑁 ∗ 𝑉 ∗ 14
Donde:
Para pasar ha contenido de proteínas corregir por el factor adecuado según la naturaleza
de la muestra. (6.25 por defecto)
Donde:
Almendras 5,18
Nueces 5,30
Nueces - cacahuetes 5,41
Gelatina 5,55
Soja 5,71
Cebada, avena, centeno 5.83
Trigo, harina entera 5,83
Harinas (no entera) 5,70
Arroz 5,95
Maíz 6,25
Todos los otros alimentos 6,25
Salvado 6,31
Leche y lácteos 6,38
CONCLUSIÓN
RECOMENDACIÓN
BIBLIOGRAFÍA