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PRÁCTICA 2

PROPIEDADES DE LAS PROTEÍNAS


DETERMINACIÓN DE LAS PROPIEDADES QUÍMICAS DE LAS
PROTEÍNAS
I. OBJETIVOS:
Identificar propiedades de las proteínas, solubilidad y capacidad espumante.
Analizar el efecto del pH sobre la solubilidad de proteínas hidrosolubles en solución acuosa.
Separar proteínas de una solución acuosa por precipitación salina.

II. FUNDAMENTO:

2.1. Punto isoeléctrico:


Todas las proteínas tienen una carga neta, dependiendo del pH del medio en el que
se encuentren y de los aminoácidos que la componen, así como de las cargas los
ligandos que se encuentren unidos a la proteína.
En un medio ácido, tienen carga neta positiva, debido a que los de grupos COOH de
los aminoácidos aspártico y glutámico están en su forma neutra pero los grupos amino
de Arginina y Lisina están protonados (-NH3+).
En un pH muy alto la proteína está cargada negativamente, pues los grupos carboxilo
estarían desprotonados (COO-) y los grupos amino estarían en su forma neutra (NH2).
Las proteínas tienen un pH característico al cual su carga neta es cero. A este pH se le
denomina punto isoeléctrico (pI), en el cual la proteína puede precipitar por disminución
de su solubilidad.

2.2. Caseína:

La caseína es una proteína globular estable frente a la desnaturalización por calor, es


fácilmente dispersable en álcalis diluidos y en soluciones salinas, tales como oxalato
sódico y acetato sódico.
La secuencia aminoacídica de la caseína contiene un número inusual de residuos
prolina: entre 10 en la α-s2-caseína y 35 en la β-caseína. Como resultado, las caseínas
son relativamente hidrofóbicas.
Su punto isoelectrico es a pH 4,6, y el pH de la leche es 6,6 aproximadamente. A pH
6.6, la caseína cargada negativamente y solubilizada como sal cálcica y fosfatos, se
encuentra como suspensión de micelas de surfactantes (pequeñas esferas hidrofílicas en
el exterior e hidrófobicas en el interior), que se estabilizan por su carga superficial
negativa.
Si se añade ácido a la leche, la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza
(los grupos fosfato se protonan) y la proteína neutra precipita

Ca2+ Caseinato + 2HCl Caseína + CaCl2

Química y física de las caseínas.


Cualquier factor que modifique la interacción de la proteína con el disolvente
disminuirá su estabilidad en disolución y provocará la precipitación. Así, la
desaparición total o parcial de la envoltura acuosa, la neutralización de las cargas
eléctricas de tipo repulsivo o la ruptura de los puentes de hidrógeno facilitarán la
agregación intermolecular y provocará la precipitación, por desnaturalización.
La caseína precipita por pH ácido (formando caseína acida) y por acción enzimática,
formando un precipitado denominado paracaseína.
Grandes cantidades de una sal agregada a una solución de proteínas, disminuye la
interacción proteína-H2O porque quita la capa de solvatación, predominando la
interacción proteína-proteína y generando la precipitación de las mismas. La
concentración salina a la que se produce la precipitación no es igual para todas las
proteínas, lo que permite usar ésta propiedad para la separación y purificación de
proteínas particulares a partir de mezclas complejas. Comúnmente se usa sulfato de
amonio (NH4)2SO4 para tal fin, a causa de su gran solubilidad (760 g de sulfato de
amonio/1000 mL de agua a 20°C) y porque el ión sulfato divalente permite alcanzar
altas fuerzas iónicas.

2.3. Propiedades funcionales de proteínas en alimentos.


La funcionalidad de las proteínas son las propiedades físicas y químicas de las
moléculas de proteínas que afectan a su comportamiento como producto. Tres de las
más importantes propiedades funcionales en los alimentos son la solubilidad, la
emulsificación y la espumación.
- Las emulsiones pueden contener agua, aceite y proteína. El pH, las sales, la
temperatura, el tipo y cantidad de aceite, la concentración de proteínas, el aporte
de energía y la temperatura afectan las propiedades de la emulsión final.
La estabilidad de emulsión se ensaya determinando la cantidad de aceite que se
separa.
Las espumas son dispersiones de burbujas de gas en una fase líquida, que
requieren aporte de energía y gas para su formación. El volumen de la espuma
depende de la capacidad de una proteína para bajar la tensión superficial entre la
fase acuosa y las burbujas de gas. También dependen del aporte de energía, del
pH, de la temperatura, del tratamiento térmico, y del tipo y la concentración de
los iones, los azúcares, los lípidos y las proteínas presentes en la espuma.
- Los parámetros utilizados para evaluar las espumas son volumen y estabilidad.
Se anota el volumen de espuma generado durante la espumación, y el
esponjamiento o expansión de la espuma se calcula como:

(peso 100 mL líquido − peso 100 mL espuma)


𝐸𝑠𝑝𝑜𝑛𝑗𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 (%) =
(peso de 100 mL de líquido)

La estabilidad de la espuma depende de las propiedades de la película de proteína


formada alrededor de las burbujas de gas.

2.4.- Espuma en clara de huevo.


La clara del huevo está compuesta por agua y proteínas
(fundamentalmente ovoalbúmina). A 65º C se coagula y se torna de color blanco. Al
batirse tiene tendencia a atrapar burbujas de aire, y si se bate puede aumentar de volumen
y tomar una consistencia semisólida, que se conoce en cocina como punto de nieve.

Mecanismo de formación de espuma.


El batido no solo introduce aire, sino que además produce un flujo en su matriz acuosa
que puede desenvolver los ovillos menos estables de proteína, obligándolos a perder su
estructura original y a presentar al exterior las zonas hidrófobas. Las proteínas así
desnaturalizadas se adsorben sobre la interfaz agua-aire orientando sus zonas apolares
hacia el interior de la burbuja y sus zonas polares hacia la matriz acuosa; esto reduce
drásticamente la tensión superficial de la burbuja actuando como un eficaz surfactante.
En los primeros momentos del batido se forma una espuma de grandes burbujas y poco
estable, surfactada principalmente por las ovomucinas, que son las proteínas de la clara
que más fácilmente pierden su estructura globular. Si el batido prosigue se incorporan a
la capa surfactante ovoglobulinas y ovotransferrinas, las burbujas se hacen cada vez
menores y aumenta la extensión total de interfaz.
Además, al perder las proteínas su estructura original en ovillo, muchos de los enlaces
débiles que la mantenían, quedan libres y tienden a rehacerse y al encontrarse una
multitud de moléculas proteínicas entremezcladas en la capa surfactante, muchos de estos
enlaces se rehacen como intermoleculares, asociando las diversas moléculas en una red
proteínica continua que estabiliza más la espuma. En este punto del proceso se hace
importante el papel de la conalbúmina, que no interviene como surfactante, pero al
oxidarse con el oxígeno que se difunde desde las burbujas se asocia con las proteínas
surfactantes conectando burbujas vecinas y fortaleciendo la red
Si se continúa el batido durante demasiado tiempo o con una potencia excesiva, la
apertura de enlaces prosigue y las proteínas vecinas comienzan a asociarse tan
estrechamente que expulsan el agua que embebe la red y la espuma queda seca y poco
flexible, haciendo muy difícil su mezcla con otros componentes de la receta que se
pretendía preparar. Más aún, si se prosigue el batido, aparecen gránulos proteínicos
rígidos que supuran líquido.

Factores que afectan la espumabilidad.


La temperatura tiene una doble influencia. Por un lado, la clara a temperatura ambiente
espuma mucho mejor que la recién sacada del frio ya que la baja temperatura dificulta la
desnaturalización de las proteínas que deben actuar como surfactantes. Sin embargo, al
estar el huevo frío es más fácil separar claras y yemas.
Se recomienda que se separen claras y yemas inmediatamente después de sacar los
huevos del frio, aunque se dejen templar antes de batirlos.

El pH original de la clara de huevo es ligeramente alcalino. Esta circunstancia facilita la


formación de enlaces disulfuro por unión de grupos sulfuro de diferentes moléculas
proteínicas, reforzando la red. Como los puentes disulfuro son los más estables de los
enlaces que mantienen la estructura globular, el efecto no es acusado en las primeras
etapas de la formación de la espuma, pero en caso de sobrebatido, este tipo de enlaces
son los principales responsables de la excesiva rigidez de la espuma y de la aparición de
grumos. Como consecuencia, si se baten las claras con medios mecánicos, es conveniente
acidificar ligeramente la clara, lo que permite que los grupos sulfuro se saturen con los
protones tomando la forma de –SH, en vez de formar puentes disulfuro. Además, si se
evita que se formen este tipo de enlaces, la espuma queda más suave y cremosa y es más
fácil de mezclar con otros ingredientes de la receta. Se suele utilizar ácido tartárico en
polvo.
Tradicionalmente se afirma que la clara a punto de nieve queda mejor formada si se
utiliza un recipiente de cobre; según Harold McGee, este fenómeno se explica porque los
iones de cobre se asocian también con los sulfuros, formando grupos –SCu, con efectos
similares a los de aumentar la acidez, pero con el inconveniente de comunicar algo de
sabor y un ligerisimo tinte verdoso a la espuma.

Adición de sal
Los iones de la sal al disolverse en la matriz acuosa bloquean la formación de enlaces
intermoleculares, incluso con baja concentración, e impiden así la consolidación de la
red proteínica disminuyendo la espumabilidad y la persistencia. Por esta razón no se
recomienda añadir la sal durante la formación de espuma.

Adición de azúcar.
Añadir azúcar a la clara tiene un doble efecto; si se añade al principio dificulta la
formación de espuma bloqueando la formación de enlaces intermoleculares, de modo
parecido a la sal. Sin embargo, añadiéndola cuando la espuma ya está levantada impide
la aparición de efectos de sobrebatido y espesa la matriz acuosa retrasando el drenaje y
contribuyendo a la persistencia.
Si se bate la clara a mano es indispensable no añadir azúcar al principio del batido. Si se
bate con medios mecánicos este aspecto toma menos importancia; añadiendo azúcar al
principio la espuma tarda algo más en aparecer, pero acaba formándose, y además se
combate desde el principio el posible sobrebatido.

Frescura de los huevos.


huevos al envejecer se alcalinizan debido a la pérdida del CO2 disuelto en la matriz
acuosa a través de los poros de la cáscara. La alcalinización de la yema es muy ligera,
pero la clara pude pasar de un pH ligeramente alcalino, alrededor de 7,5, hasta uno
francamente básico de más de 9. Por esto comienzan a deshacerse los agregados que
mantenían la clara translúcida y viscosa y las proteínas se repelen volviendose más
transparente y fluida.
Estos cambios motivados por el envejecimiento del huevo tienen consecuencias directas
sobre su espumabilidad: por un lado, las proteínas se desnaturalizan mejor y la clara se
monta más fácilmente; por otro, la pérdida de viscosidad favorece el drenaje y la espuma
es menos firme y estable. Además, la debilidad de la membrana de la yema favorece que
se rompa y contamine las claras durante la separación.
Presencia de grasas y detergentes.
Las grasas son enemigos de la espuma de clara, pues compiten con las proteínas
surfactantes en la interfaz agua-aire de las burbujas, y bloquean la formación de enlaces
entre proteínas debilitando la red que estabiliza la espuma. Los detergentes o los lípidos
polares que son buenos surfactantes de por si debilitan la espuma por la misma razón: no
son compatibles con las proteinas e interfieren su acción.

III. MATERIALES
Para el experimento 1.

13 tubos de ensayo de 10 X 150 mm


Balanza analítica

1 pipeta de 10 ml

6 pipetas de 5 ml

1 gradilla

Caseína
agua destilada.

Para el experimento 2.
Probetas de 25 mL,

Yema de huevo

Recipiente para el batido


Batidora

Jugo de limón

Azúcar común

Embudos

Claras de huevo
IV. METODOLOGÍA:

Parte 1. Solubilidad de la caseina.


Se provoca cambios de solubilidad en proteínas, mediante la modificación las
propiedades de los solventes.

A. Aislamiento de la caseína:
- Caliente en un vaso de precipitado 150 ml de agua destilada a 38ºC, añada
50 ml de leche y luego adicione ácido acético 1M, gota a gota agitando hasta
que se forme un precipitado (la leche se corta).
- Deje sedimentar y filtre sobre papel de filtro usando un embudo de cristal.
- Lave el precipitado con 20 ml de etanol en el mismo filtro.
- Seque el precipitado colocando varios pliegues de papel de filtro.
- Coloque el precipitado en un vaso de precipitado pequeño previamente pesado,
vuelva a pesar el vaso con el precipitado y luego adicione 5 ml/g de éter etílico.
- Filtre nuevamente.
- Deseche el líquido quedando un precipitado blanco de fácil manipulación que
es la caseína.

B. Preparación de la solución de caseína:


- Coloque aproximadamente 250 mg de caseína en un vaso de 50 ml.
- Agregue 20 ml de agua destilada y 5 ml de NaOH 1N; agite hasta lograr una
solución total de la caseína.
- Una vez disuelta la caseína, se vierte en un matraz aforado de 50 ml, adicione
5 ml de ácido acético 1N, diluya con agua destilada hasta 50 ml y mezcle bien.
- La solución debe ser clara y limpia y si no es así, debe volver a filtrar.
Parte 2. Determinación de las proteínas totales en la leche.
a) En un tubo de ensayo tome 1,5 mL de agua destilada y adicione 1,5 mL del reactivo
de Biuret. Mezcle bien y calibre el espectrofotómetro.
b) En otro tubo de ensayo adicione 1,5 mL de leche y 1,5 mL del reactivo (Biuret,
Lowry y Bradford), mezcle bien y mida la absorbancia. Tenga en cuenta la curva de
calibración que obtuvo en la práctica anterior. Si la absorbancia es mayor a los valores
de la curva, haga diluciones hasta que tenga un valor de absorbancia en el rango de la
curva de calibración. Para realizar las diluciones use la fórmula V1C1=V2C2. Anote
los datos de las diluciones para que los tenga en cuenta para calcular la concentración
de las proteínas totales de la leche.
Parte 3. Determinación del punto Isoeléctrico de la caseína por adición de un ácido.

- Preparar 10 tubos como se indica a continuación.


- Mezclar bien, esperar 30 minutos y observar los cambios que presente la solubilidad de
la caseína en cada tubo.

Tubo pH Agua Ac. Ac. Ac. Caseinato Solubilidad


destilada Acético Acético Acético de Sodio
0.01N 0.1 1.0N
1 8.38 0.62 0 0 1.0
2 7.75 1.25 0 0 1.0
3 8.75 0 0.25 0 1.0
4 8.5 0 0.5 0 1.0
5 8.0 0 1.0 0 1.0
6 7.0 0 2.0 0 1.0
7 5.0 0 4.0 0 1.0
8 1.0 0 8.0 0 1.0
9 7.4 0 0 1.6 1.0
10 5.8 0 0 3.2 1.0

Reportar el punto isoeléctrico correspondiente al tubo donde se presenta la mayor


precipitación.
Parte 4. Fraccionamiento de las proteínas de la leche.
a) Precipitación de caseína por punto isoeléctrico
Tome 20 mL de leche en un vaso de precipitado y mida el pH.
Agregue lentamente pequeñas alícuotas de HCl, agite (con agitación magnética), hasta
obtener un pH de 4,7. Registre las observaciones del efecto del pH sobre las
propiedades de la leche (suspensión de proteínas en agua).
Pese el papel de filtro y filtre al vacío usando un embudo Büchner (al vacío). Determine
el peso de las caseínas (después de la filtración). Tenga en cuenta este peso para
determinar la concentración de caseínas totales en la leche (%).
Mida el volumen del sobrenadante y téngalo en cuenta para determinar el porcentaje
de las proteínas de la leche que son solubles a pH 4.7.
b) Determinación de la concentración de proteínas solubles.
Tome 1,5 mL del sobrenadante y 1,5 mL del reactivo (Biuret, Lowry y Bradford),
mezcle bien y mida la absorbancia. Tenga en cuenta la curva de calibración que se
obtuvo en la práctica anterior. Si la absorbancia es mayor a los valores de la curva,
haga diluciones hasta que tenga un valor de absorbancia en el rango de la curva de
calibración y tenga en cuenta estos datos para calcular la concentración de proteínas
solubles totales en la leche (mg/mL).
c) Precipitación salina de las proteínas solubles (presentes en el sobrenadante).
Tome 1,5 mL de la solución de sulfato de amonio saturada y mézclela con 1,5 mL del
sobrenadante (proteínas solubles).
Centrifugue y observe si se forma un pellet. Pese el pellet y mida el volumen del
sobrenadante.

Parte 5. Capacidad espumante.


Separar la clara de la yema de 4 huevos. Agitar suavemente las claras para
homogenizar sin provocar espumado.
Pesar 30 g de clara y 10 g de agua destilada (control)
Colocar todo en el recipiente y batir, usando la batidora a velocidad 3 durante 3
minutos.
Colocar la espuma formada dentro del embudo y éste a su vez dentro de la probeta.
Medir el volumen escurrido a diferentes tiempos (5, 10, 15 y 20 minutos).
Tomar una pequeña muestra y observar al microscopio a tiempo 0 y 20 minutos. Hacer
foco utilizando un aumento de 10X y tomar foto.
Repetir el ensayo para las siguientes muestras:
a) 30 g de clara + 10 g de agua + 25 g de azúcar al inicio
b) 30 g de clara + 10 g de agua + 25 g de azúcar a los 2 minutos de batido
c) 30 g de clara + 10 g de agua + 2 g de sal al inicio
d) 30 g de clara + 10 g de agua + 2 g de yema al inicio
e) 30 g de clara + 10 g de agua + 2 g de limón
Calcule la expansión o esponjamiento de las espumas obtenidas a tiempo 0.
Realizar una gráfica de volumen escurrido (ml) versus tiempo (min) para las diferentes
muestras y analizar los resultados.
Comparar la distribución de tamaño de burbujas.

Volumen escurrido en tiempo


(min)
Agua Otro 5 10 15 20
Clara
10 0
30
10 25 g azúcar a tiempo
30
0
10 25 g de azúcar a 2
30
min
10 2 g de sal al inicio
30
10 2 g de yema al inicio
30
10 2 g de limón
30

V. RESULTADOS: